楊婭妮,湯家明,李潤芝,蔚洪恩,,3*

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院腦病教研室,太原 030024;2山西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3腦疾病防治山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:hongen.wei@sxmu.edu.cn)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種老年期最常見的慢性疾病,臨床表現(xiàn)主要有漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙、語言與記憶障礙、人格改變等[1]。中醫(yī)將 AD納入“呆病”“健忘”的范疇,認(rèn)為腎精虧虛,腦髓消減,神機(jī)失用是 AD的基本病機(jī)[2]。有研究報(bào)告顯示,截至2019年底我國現(xiàn)存 AD患者已經(jīng)超過1 000萬,而2050年,全球?qū)?huì)有1.52億人患有癡呆,其中2/3為 AD患者[3,4]。據(jù)估計(jì),2030年全球用于癡呆的治療與護(hù)理費(fèi)用將增至2萬億美元[5]。因此, AD的預(yù)防與治療問題必須得到重視。然而 AD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,目前認(rèn)為是多途徑參與的復(fù)雜機(jī)制共同導(dǎo)致。目前 AD可能的發(fā)病機(jī)制有β淀粉樣蛋白毒性學(xué)說、tau蛋白過度磷酸化學(xué)說、炎癥學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說等[6]。在藥物治療方面,膽堿酯酶抑制劑治療輕、中度 AD,如多奈哌齊、利斯的明等,美金剛作為重度 AD治療藥物[7]。但是目前臨床用藥選擇有限,品種較為單一,并且多具有惡心、胸悶、心慌等副作用,對于 AD只是癥狀上的暫時(shí)緩解,并不能根治疾病。因此我們迫切需要找到能夠治療 AD且副作用小的新藥物,而作為傳統(tǒng)文化瑰寶的中醫(yī)藥可為其提供新思路。

中藥因其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn),在疾病治療中能有效降低毒副作用,在臨床應(yīng)用中具有良好的效果。近年來,中藥對于 AD的治療取得很大進(jìn)展,但是因中藥有效成分復(fù)雜,對于疾病藥效的作用基礎(chǔ)以及用量的把控難以進(jìn)行系統(tǒng)性的深入研究。2007年,來自英國的Hopkins[8]首次提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”一詞,并于2008年發(fā)表相關(guān)文章表示網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是“下一代藥物研發(fā)模式”[9]。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛應(yīng)用于藥物和中藥活性化合物發(fā)現(xiàn)、藥物組合和方劑配伍規(guī)律解析等方面,為中藥體系研究指明了新道路,同時(shí)也為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的理論與技術(shù)支撐[10]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,以 AD相關(guān)疾病靶點(diǎn)作為切入點(diǎn),檢索匹配出相對應(yīng)的化合物和中藥,構(gòu)建并分析了核心靶點(diǎn)、化合物、中藥三者之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)關(guān)系,而后通過分子對接進(jìn)行驗(yàn)證,初步探尋中藥治療 AD的一般規(guī)律,為中醫(yī)藥干預(yù) AD的基礎(chǔ)理論提供了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù),同時(shí)也為后續(xù)治療時(shí)中藥的選擇、中醫(yī)復(fù)方加減配伍的選擇、后續(xù)新藥開發(fā)及中西醫(yī)結(jié)合臨床治療提供了思路。

1 材料與方法

1.1 AD相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取

通過檢索文本挖掘DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/),以“Alzheimer’s disease”為檢索詞,獲取阿爾茨海默病相關(guān)靶點(diǎn),通過微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)獲取交集靶點(diǎn),作為潛在靶點(diǎn)。將潛在靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)nipot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查詢各潛在靶點(diǎn)全稱。

1.2 候選化合物篩選及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖的構(gòu)建

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件篩選出可作用于 AD相關(guān)疾病靶點(diǎn)的化合物作為候選化合物,并保存為MOL2格式文件,再將其導(dǎo)入OpenBabel-2.4.1軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式文件,為后期分子對接做準(zhǔn)備。同時(shí)將候選化合物、靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò),并對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行整理分析。本次研究涉及的TCMSP平臺(tái)是一個(gè)全新的以系統(tǒng)藥理學(xué)為基礎(chǔ)的中藥研究平臺(tái)及數(shù)據(jù)庫,囊括了《中國藥典》(2010)注冊的所有499種中草藥,和其所含的共29 384個(gè)成分化合物,13 144個(gè)分子,給出了所有收錄的中草藥的組分和分子結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵 ADME參數(shù)、成分作用靶點(diǎn)以及相關(guān)疾病等關(guān)鍵信息[11]。

1.3 核心靶點(diǎn)與候選化合物的分子對接驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的靶點(diǎn)及其配體關(guān)系的可信度,將靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)中度值前四的核心靶點(diǎn)與所有的候選化合物進(jìn)行分子對接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)查詢出4種核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu),并與候選化合物的pdb格式文件一起導(dǎo)入AutoDockTools-1.5.7進(jìn)行分子對接,得到靶點(diǎn)與化合物的3D對接圖。若結(jié)合力<0 kcal/mol,表明配體分子能與受體蛋白進(jìn)行自發(fā)的結(jié)合,但是目前對于高結(jié)合性分子的篩選標(biāo)準(zhǔn)尚無統(tǒng)一規(guī)定[12,13]。再將已經(jīng)對接好的靶點(diǎn)-化合物文件轉(zhuǎn)化為pdb格式,導(dǎo)入LigPlus生成2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比觀察。

1.4 中藥篩選及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了進(jìn)一步整合中藥和化合物及疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系,通過Cytoscape 3.9.1中的merge插件將靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)、化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并,構(gòu)建出“靶點(diǎn)-化合物-中藥”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。

1.5 中藥數(shù)據(jù)整理以及頻數(shù)分析

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中匹配出潛在靶點(diǎn)的對應(yīng)中藥材,參照“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[14]以及中國藥典2020年版[15]中對中藥的性味歸經(jīng)進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過檢索DisGeNET數(shù)據(jù)庫以及OMIM數(shù)據(jù)庫收集 AD相關(guān)疾病靶點(diǎn),在微生信網(wǎng)站進(jìn)行交集獲得 AD靶點(diǎn)69個(gè)(見圖1)。其中在TCMSP數(shù)據(jù)庫中能匹配到化合物,且DL≥0.18,OB≥30%的靶點(diǎn)共有11個(gè),將這11個(gè)靶點(diǎn)定義為潛在靶點(diǎn),其基本信息見表1。

表1 Uiport數(shù)據(jù)庫阿爾茨海默病潛在靶點(diǎn)的基本信息

DisGeNET OMIM

2.2 靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖的構(gòu)建

以“可關(guān)聯(lián)至相關(guān)靶點(diǎn)”“DL≥0.18”以及“OB≥30%”為條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出26個(gè)候選化合物。在Cytoscape 3.9.1中導(dǎo)入潛在靶點(diǎn)和候選化合物繪制靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(見圖2),將度值前四的靶點(diǎn)定義為核心靶點(diǎn)。分別是白介素6(interleukin-6,IL-6)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、尿激酶型纖溶酶激活劑(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)。候選化合物信息見表2,度值前六的化合物分別為槲皮素(quercetin,度值7)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,度值5]、木犀草素(luteolin,度值3)、漆黃素(fisetin,度值3)、芝麻素(sesamin,度值2)、青藤堿(sinomenine,度值2)。這些化合物可作用于多個(gè) AD相關(guān)蛋白,活躍性更強(qiáng),可作進(jìn)一步研究。

表2 阿爾茨海默病的候選化合物信息

圖中綠色為潛在靶點(diǎn),黃色為候選化合物,節(jié)點(diǎn)大小以該節(jié)點(diǎn)度值為標(biāo)準(zhǔn),度值越大,節(jié)點(diǎn)越大

2.3 中藥的獲取結(jié)果及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫將26個(gè)候選化合物進(jìn)行匹配,共獲得380味中藥,其中有47味藥物未被“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》及中國藥典2020年版收錄,除此之外廣棗、天山雪蓮、冬葵果3味中藥僅記錄性味而無歸經(jīng),對此50味中藥進(jìn)行排除,故最終收集到330味中藥,其中篩選出的中藥度值不小于4的有35個(gè)(見圖3)。通過候選化合物的橋接作用收集各個(gè)中藥的靶點(diǎn),結(jié)果顯示銀杏葉、菟絲子、夏枯草、香附、白果、半枝蓮、浮萍、苦參、連翹、木蝴蝶、山豆根包含的靶點(diǎn)較多,因此推測11種中藥對 AD發(fā)病機(jī)制具有一定的調(diào)控作用。本研究通過選取中藥(度值≥4)及相關(guān)化合物、靶點(diǎn)來構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖(見圖4)。其中,銀杏葉、菟絲子等中藥度值較高,與 AD的靶點(diǎn)以及化合物關(guān)聯(lián)更為密切。

中藥度值

圖中橢圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),長方形節(jié)點(diǎn)表示化合物,菱形節(jié)點(diǎn)表示中藥,中藥的度值越大,節(jié)點(diǎn)越大

2.4 核心靶點(diǎn)與候選化合物的分子對接驗(yàn)證結(jié)果

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得26個(gè)候選化合物的成分結(jié)構(gòu),導(dǎo)入AutoDockTools-1.5.7進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。對接結(jié)果的結(jié)合熱力圖顯示4個(gè)核心靶點(diǎn)與其已知的配體對接得分最高分別是EGFR-MOL003187(6.76分)、IL10-MOL003187(5.46分)、PLAU-MOL003187(5.78分)、IL6-MOL005944(5.97分)(見圖5)。為了更好地展現(xiàn)其靶點(diǎn)分子結(jié)構(gòu),在4個(gè)靶點(diǎn)中選擇各自結(jié)合力最強(qiáng)的進(jìn)行2D和3D結(jié)構(gòu)展示,結(jié)果見圖6。

EGFR:表皮生長因子受體;IL-10:白介素10;PLAU:尿激酶型纖溶酶激活劑;IL-6:白介素6;圖中顏色越紅代表結(jié)合力越強(qiáng)

右側(cè)鏈接的綠色虛線表示氫鍵作用,紅色虛線表示疏水作用,字母表示結(jié)合位點(diǎn)氨基酸

2.5 中藥性味歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

共收集到中藥380味,其中能在“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》以及中國藥典2020年版中查詢到的中藥共330味,查詢這些中藥的性味、歸經(jīng)等信息并進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示可能對 AD進(jìn)行調(diào)節(jié)的中藥以苦味藥最多,其次為辛味、寒味和甘味,出現(xiàn)頻率共計(jì)67.99%;藥性方面則以寒性中藥數(shù)目最多(見圖7)。從歸經(jīng)來看,歸肝經(jīng)的中藥最多,占22.80%,其次是歸肺經(jīng),占17.10%,歸肝、肺經(jīng)的藥物共計(jì)39.90%(見圖8)。

圖7 可能對阿爾茨海默病進(jìn)行調(diào)節(jié)的中藥歸經(jīng)頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖8 可能對阿爾茨海默病進(jìn)行調(diào)節(jié)的中藥性味頻次統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)圖

3 討論

阿爾茨海默病是一種慢性神經(jīng)退行性疾病[16],其致病因素較多、病理機(jī)制復(fù)雜。目前對于 AD的發(fā)病機(jī)制,相關(guān)中藥新藥研究也在逐步推進(jìn)。但是新藥的研發(fā)往往是一個(gè)需要消耗大量的人力與財(cái)力的長期過程,而現(xiàn)有的醫(yī)療模式是針對所有患者的單一疾病、單一靶點(diǎn)、單一藥物和單一療法,成本高昂[17],因此中藥因“多成分”“多靶點(diǎn)”“多途徑”的優(yōu)勢在 AD的臨床治療中發(fā)揮著重要作用。本研究基于DisGeNET、OMIM、Uniport等多個(gè)數(shù)據(jù)庫,以 AD疾病靶點(diǎn)為核心,匹配出對應(yīng)的化合物和中藥,擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),構(gòu)建并分析靶點(diǎn)-化合物-中藥的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖,總結(jié)出中藥治療 AD的一般規(guī)律。

以DL≥0.18和OB≥30%為條件篩選出的候選化合物中槲皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、木犀草素、漆黃素、芝麻素、青藤堿,這6種化合物均包含抗氧化及抗炎的作用,對于 AD的發(fā)病機(jī)制中的氧化應(yīng)激學(xué)說和炎癥學(xué)說較為吻合。其中槲皮素已經(jīng)被證明可作為一種新的治療氧化應(yīng)激神經(jīng)退行性疾病的藥物,它能夠抑制炎癥因子和MDA、Keap1的水平,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而改善含有3個(gè)突變等位基因(PS1、APP、Tau)的純合子(3×Tg-AD)小鼠的認(rèn)知功能障礙[18]。在腦卒中的治療中,槲皮素清除多余的活性氧,維持線粒體的功能,保護(hù)神經(jīng)元[19]。同時(shí),構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中,另一種化合物青藤堿目前研究多應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病,而來自重慶醫(yī)科大學(xué)的張毅及其研究團(tuán)隊(duì)[20]發(fā)現(xiàn),青藤堿保護(hù)海馬神經(jīng)元免受腦出血處理的小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的間接毒性,其抗炎和腦保護(hù)作用機(jī)制也為腦出血的潛在治療提供了新的線索。由此可見,中藥防治 AD具備很大的潛能,并且所篩選的候選化合物中有許多可從常見的植物及食物中獲取,成本相對較低。因此本研究也對 AD的食療具有一定的指導(dǎo)意義。

分子對接結(jié)果顯示:4個(gè)核心靶點(diǎn)與26種成分均能夠進(jìn)行對接,這說明靶點(diǎn)與配體有較強(qiáng)的結(jié)合力,證明靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系結(jié)果是可靠的。而分子對接結(jié)合能熱力圖顯示,對接結(jié)果良好,達(dá)到了一定的結(jié)合活性標(biāo)準(zhǔn)。其中表皮生長因子受體(EGFR)與26種成分整體對接活性較高,提示其可作為潛在有效的治療靶點(diǎn)。目前有研究證實(shí)了EGFR過度的激活與許多的神經(jīng)退行性疾病有關(guān),而EGFR抑制劑能夠減輕Aβ的毒性以及改善神經(jīng)炎癥,但因其血腦屏障滲透性較差,仍需進(jìn)一步研究[21]。對于這一劣勢,中醫(yī)有著獨(dú)特的見解。據(jù)《素問玄機(jī)原病式》記載:“玄府者,無物不有,人之臟腑、皮毛、肌肉、筋膜、骨髓、爪牙,至于世之萬物,盡皆有之,乃氣出入升降之道路門戶也。”將玄府定義為通行氣機(jī)、調(diào)節(jié)氣血津液運(yùn)行的通道。腦作為元神之府,總領(lǐng)五臟之神,腦玄府開闔功能正常是大腦發(fā)揮正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其功能類似于血腦屏障[22]。中藥引經(jīng)及方劑配伍,能夠做到因人制宜,引藥入腦,開通腦玄府,使得藥物通過血腦屏障作用于腦疾病靶點(diǎn),因而EGFR靶點(diǎn)可作為潛在的中藥治療阿爾茨海默病的作用靶點(diǎn),值得更進(jìn)一步的研究。

根據(jù)中藥的性味、歸經(jīng)等信息的頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析可知, AD機(jī)制與肝經(jīng)、肺經(jīng)關(guān)系緊密。在治療方面則可多考慮苦、寒味藥的應(yīng)用。所篩選的中藥中,銀杏葉、菟絲子、夏枯草、香附、白果、半枝蓮、浮萍、苦參、連翹、木蝴蝶、山豆根這11味中藥調(diào)控多個(gè)阿爾茨海默病的核心靶點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)對于銀杏葉基礎(chǔ)研究較多,研究證明銀杏葉具有擴(kuò)張血管、拮抗血小板活化因子、保護(hù)缺血損傷及抗炎等多種藥理作用,在腦功能障礙、腦外傷后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和清除氧自由基等方面具有確切的療效[23]?？鄥⒅卸喑煞?、多部位均具有抗氧化作用[24,25],韓亞非等[26]發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過抑制海馬神經(jīng)元凋亡改善及降低氧化應(yīng)激損傷來改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述,本研究以 AD的疾病靶點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn),通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)的方法,初步探討了中藥干預(yù) AD的一般用藥規(guī)律,為后期繼續(xù)深入研究EGFR等相關(guān)靶點(diǎn)以及作用機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。然而本研究主要是通過挖掘數(shù)據(jù)庫以及計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算獲得的數(shù)據(jù)來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),無法顧及實(shí)際應(yīng)用時(shí)中藥的劑量、一些毒性作用以及中藥復(fù)方加減配伍的計(jì)量搭配等因素,具有一定局限性,因此具體結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。