徐永妮,李 爍,趙智凝

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院第九八六醫(yī)院檢驗(yàn)病理科,西安 710054;*通訊作者,E-mail:h0erxx@163.com)

細(xì)菌性肺炎是一種感染性肺部疾病,肺炎鏈球菌作為一種革蘭陽(yáng)性菌,是引起細(xì)菌性肺炎常見的病原體,其入侵宿主無(wú)菌部位后,免疫系統(tǒng)受到抑制,促使肺炎鏈球菌通過(guò)肺泡上皮的遷移,最終導(dǎo)致肺部感染[1,2]。因此,研究肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細(xì)胞的作用機(jī)制對(duì)細(xì)菌性肺炎的治療具有重要意義。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)來(lái)源于黃芪根部,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用,對(duì)心血管疾病、肺病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有保護(hù)作用[3,4]。研究顯示黃芪甲苷能夠減輕肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[5],但具體的作用機(jī)制還尚未研究。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子1(Sirtuin 1,SIRT1)是一種NAD+依賴性去乙?；?參與細(xì)胞分化、凋亡、能量代謝等。磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作為SIRT1的下游因子,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝[6]。據(jù)了解,啟動(dòng)SIRT1/AMPK通路對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的肺泡上皮屏障功能具有保護(hù)作用,而黃芪甲苷可以通過(guò)啟動(dòng)SIRT1/AMPK信號(hào)通路改善血管內(nèi)皮功能障礙[7,8]。因此,本研究通過(guò)觀察肺泡上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及蛋白表達(dá)情況,探討黃芪甲苷對(duì)肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用及其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和菌株 人正常肺泡上皮細(xì)胞A549(批號(hào)CBP30021L)購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司,ATCC BAA-255肺炎鏈球菌(批號(hào)092144)購(gòu)自上海碩欣生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 黃芪甲苷(批號(hào)202208,北京凱詩(shī)源生物科技有限公司);EX527(SIRT1抑制劑,批號(hào)15452,美國(guó)Med chem Express公司);脫纖維羊血、THB培養(yǎng)基(批號(hào)分別是1001339、HB0311-3,北京普非生物科技有限公司);MTT細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C11019,廣州市銳博生物科技有限公司);5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU,批號(hào)A1397,北京康瑞納生物科技有限公司);Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)FY600003,上海弗元生物科技有限公司);白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)DS647、3648D、DS636,上海優(yōu)利科生命科學(xué)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)分別是11119、11184,翌圣生物科技股份有限公司);BrdU、SIRT1、AMPK、p-AMPK一抗(批號(hào)分別是ab6326、ab189494、ab32047、ab92701,英國(guó)abcam公司);熒光標(biāo)記及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號(hào)1053、1102,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、GAPDH引物設(shè)計(jì)與合成(上海生工生物工程有限公司);NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司);CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);CytoFLEX流式細(xì)胞儀(上海貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易有限公司);Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀(上海帝肯實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肺泡上皮細(xì)胞A549用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)基放在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時(shí)開始傳代。肺炎鏈球菌用含有5%的脫纖維羊血的平板培養(yǎng),并在實(shí)驗(yàn)開始之前放入含0.5%酵母的Todd-Hewitt肉湯(Todd Hewitt broth,THB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理 將傳代后培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為對(duì)照組、感染組、黃芪甲苷低、中、高濃度組、黃芪甲苷+SIRT1抑制劑組(黃芪甲苷+EX527組)。對(duì)照組用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng),感染組用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)細(xì)胞24 h[9],黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞分別用濃度為10,20,40 μmol/L的黃芪甲苷培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞用PBS清洗,再用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)24 h[10],黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞用含有40 μmol/L黃芪甲苷和200 nmol/L SIRT1抑制劑EX527[6]的培養(yǎng)基共培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞用1×108CFU/ml肺炎鏈球菌培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h。然后吸棄上清液,加150 μl DMSO,振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各孔的吸光值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4 BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種至24孔板中,按分組培養(yǎng)24 h后,每孔中加入10 μmol/L的BrdU孵育2 h。然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,加入BrdU抗體在37 ℃下孵育2 h,再用山羊抗兔熒光二抗孵育1 h,最后加入DAPI進(jìn)行核染,在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況,并計(jì)算BrdU陽(yáng)性細(xì)胞(綠色熒光)的比例,以此表示細(xì)胞增殖率。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞用PBS洗滌,4 ℃,200g離心5 min,收集細(xì)胞沉淀加入200 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞,再分別加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)染色液混勻,避光放置10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量 收集各組細(xì)胞上清液,然后利用ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,并依據(jù)操作步驟處理待測(cè)樣品,用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm處的吸光值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-RCR)檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞提取總RNA,并用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度,利用試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qPCR,反應(yīng)體系為SYBR Green Master Mix 10 μl,上下游引物各0.4 μl,cDNA 1 μl,水8.2 μl。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;2步法:95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),熔解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中mRNA的相對(duì)表達(dá)量,引物序列見表1。

表1 RT-qRCR引物

1.2.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)SIRT1、AMPK、p-AMPK蛋白的表達(dá) 收集各組培養(yǎng)的細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離總蛋白,并將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜取出用TBST清洗3次,置于5%的脫脂牛奶中封閉2 h,TBST沖洗后放入脫脂牛奶配制的一抗稀釋液(SIRT1、AMPK、p-AMPK稀釋比例1∶1 000)中,4 ℃孵育過(guò)夜,再放入羊抗兔二抗稀釋液(1∶1 000)中,室溫孵育2 h,繼續(xù)用TBST清洗3次,放入顯影劑中避光顯色10 min。用蛋白凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶并拍照,并以GAPDH為內(nèi)參蛋白,利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

MTT和BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,感染組細(xì)胞存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率升高(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細(xì)胞增殖活性升高(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率升高(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率降低(P<0.05,見圖1和表2)。

圖1 BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 (×200)

表2 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比,感染組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05,見表3和圖2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

表3 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與對(duì)照組相比,感染組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05,見表4)。

表4 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

2.4 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,感染組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)降低,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)升高,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)降低,Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)升高(P<0.05,見表5)。

表5 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

2.5 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞中SIRT1、AMPK、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),AMPK在各組細(xì)胞中均無(wú)顯著變化。與對(duì)照組相比,感染組細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK降低(P<0.05);與感染組相比,黃芪甲苷低、中、高濃度組細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷低濃度組相比,黃芪甲苷中、高濃度組細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷中濃度組相比,黃芪甲苷高濃度組細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK升高(P<0.05);與黃芪甲苷高濃度組相比,黃芪甲苷+EX527組細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK蛋白表達(dá)及p-AMPK/AMPK降低(P<0.05,見表6和圖3)。

1.對(duì)照組;2.感染組;3.黃芪甲苷低濃度組;4.黃芪甲苷中濃度組;5.黃芪甲苷高濃度組;6.黃芪甲苷+EX527組

表6 黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞中SIRT1、p-AMPK、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肺炎鏈球菌是一種高度適應(yīng)人類的病原體,其作為呼吸道微生物群中常見的無(wú)癥狀成員,具有引起黏膜和侵襲性疾病的能力,包括肺炎、中耳炎、腦膜炎等[11]。其中由肺炎鏈球菌感染引起的細(xì)菌性肺炎在世界上仍然有較高的發(fā)病率和死亡率,當(dāng)人類肺細(xì)胞和組織被肺炎鏈球菌感染后會(huì)引起強(qiáng)烈的促炎反應(yīng),進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡,且已知IL-6、IL-1β、TNF-α是評(píng)估肺泡上皮細(xì)胞損傷程度的重要炎性細(xì)胞因子[5,12,13]。因此,本研究對(duì)細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染組肺泡上皮細(xì)胞的存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率明顯低于對(duì)照組,細(xì)胞凋亡率以及其培養(yǎng)液中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯高于對(duì)照組。表明肺炎鏈球菌成功感染了肺泡上皮細(xì)胞并引起炎性損傷。而黃芪甲苷不同濃度處理后細(xì)胞的存活率及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞率升高,凋亡率以及IL-6、IL-1β、TNF-α的含量明顯降低。提示黃芪甲苷能夠促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),從而減輕肺炎鏈球菌感染引起的損傷。接著又檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),已知抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax均是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),pro-Caspase-9被轉(zhuǎn)化為其活性形式,并作用于Caspase-3前體形成cleaved Caspase-3[14,15]。結(jié)果顯示,與感染組相比,黃芪甲苷處理組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA表達(dá)升高,Bax和cleaved Caspase-3 mRNA表達(dá)降低。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芪甲苷對(duì)肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用,這與先前的研究結(jié)果[5]保持一致,但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步了解。

SIRT1是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵因子,也是細(xì)胞存活的重要組成部分,其可以作用于細(xì)胞的增殖、凋亡以及炎癥反應(yīng)[16]。AMPK作為SIRT1的下游基因,也是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵,在各種類型的細(xì)胞中參與脂質(zhì)代謝、炎癥和血管生成的調(diào)節(jié)[17]。當(dāng)AMPK被啟動(dòng)后可以增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平,從而建立代謝反饋機(jī)制,使SIRT1活性增強(qiáng),導(dǎo)致SIRT1靶蛋白的去乙?；?調(diào)節(jié)線粒體功能和維持能量平衡[18,19]。有研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)啟動(dòng)SIRT1/AMPK信號(hào)通路可以抑制炎癥和細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)缺血再灌注引起的肺上皮細(xì)胞損傷[20]。本研究結(jié)果顯示,感染組細(xì)胞中SIRT1和磷酸化AMPK蛋白表達(dá)降低,黃芪甲苷處理組SIRT1和磷酸化AMPK蛋白表達(dá)升高。表明黃芪甲苷可以啟動(dòng)SIRT1表達(dá),從而介導(dǎo)下游AMPK蛋白磷酸化。而加入SIRT1抑制劑EX527后,黃芪甲苷促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞增殖,抑制其凋亡和炎癥反應(yīng)的作用被逆轉(zhuǎn),且AMPK磷酸化表達(dá)降低。進(jìn)一步揭示了黃芪甲苷能夠減輕肺炎鏈球菌引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制可能與調(diào)控SIRT1/AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,黃芪甲苷通過(guò)調(diào)控SIRT1/AMPK信號(hào)通路,減輕肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷。本研究為肺炎鏈球菌等細(xì)菌感染引起的肺部疾病提供了新的治療思路和依據(jù)。但本研究仍然存在一定的局限性,首先本研究?jī)H在細(xì)胞中進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),并未探討黃芪甲苷在體內(nèi)的作用效果及機(jī)制;其次,本研究?jī)H證明了黃芪甲苷對(duì)肺炎鏈球菌感染造成的肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并未探究黃芪甲苷對(duì)肺炎鏈球菌的具體作用。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)一步研究黃芪甲苷對(duì)肺炎鏈球菌的作用,并深入探討黃芪甲苷在體內(nèi)對(duì)肺炎鏈球菌感染引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷的具體作用。