魏可欣，石銳琪，林仲寅，李世恒，李繼桐，李琦，呂俊峰

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100）

沙門氏菌屬腸桿菌科，是一種革蘭氏陰性腸道桿菌，一般無莢膜，大多數(shù)有周身鞭毛。家禽是腸炎沙門氏菌的天然感染對象，雛鴨感染尤為嚴(yán)重。感染雛鴨精神沉郁，食欲不振，排白色如水狀的糞便，肛門周圍絨毛被糞便污染[1]，死亡率升高。剖檢可見心臟腫大，并伴有出血現(xiàn)象，嚴(yán)重時會有干酪樣物。肝臟腫大，出現(xiàn)點(diǎn)狀出血或者局部壞死，卵巢和卵泡也會出現(xiàn)一定程度上的壞死[2]。沙門氏菌病已成為危害山東省肉鴨養(yǎng)殖的主要細(xì)菌性疾病之一[3]，因此需對該病的病原菌分離鑒定，測定、分析不同沙門氏菌致病性差異，為臨床防控與治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于山東不同地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖場內(nèi)采集新鮮糞便樣本及泄殖腔拭子，具體采集數(shù)量見表1。

表1 樣品采集信息

1.2 試劑與引物

實(shí)驗(yàn)所用TSA 固體培養(yǎng)基、LB 固體、液體培養(yǎng)基均由本實(shí)驗(yàn)室配制保存；2×Tap PCR StarMix試劑盒購自康潤誠業(yè)生物科技（北京）公司。

根據(jù)胡興娟等人的報(bào)道[4]，按照腸炎沙門氏菌sdf 基因設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列和擴(kuò)增片段如表2 所示。

表2 引物序列

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

吸取50 μL 采集的樣品液均勻涂抹至TSA 固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基各接種4 類樣品，37 ℃培養(yǎng)12 h 觀察TSA 培養(yǎng)基是否有菌落生長。挑取生長的單菌落使用四區(qū)劃線法接種至LB 固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h[5]，以同種方法連續(xù)純化3次，挑取3 次純化后的單菌落加入LB 液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后置4 ℃保存。

2.2 PCR 鑒定

以2.1 保存的菌液為模板，以sdf-F/R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為2×Tap PCR StarMix 10 μL，sdf-F/R 各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共30 個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。將獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

2.3 動物回歸試驗(yàn)

取2.1 待檢沙門氏菌以1:100 比例轉(zhuǎn)接至20 mL LB 液體培養(yǎng)基，120 r/min 搖菌培養(yǎng)5~6 h，經(jīng)細(xì)菌平板計(jì)數(shù)可知細(xì)菌數(shù)為1.15×1012CFU/mL。將菌液11 000 r/min 離心15 min，用無菌 PBS 溶液重懸沉淀菌體并繼續(xù)離心，重復(fù)3 次后用適量無菌PBS 溶液重懸制成菌液濃度為1.15×109CFU/mL的懸菌液，分為5 組并標(biāo)記備用[6]。

取50 只7 日齡的雛鴨隨機(jī)分為1 組對照組和5 組試驗(yàn)組，對照組10 只，試驗(yàn)組40 只，5 組試驗(yàn)組分別命名為沙門1、2、3、4、5 組，每組8只，各組單獨(dú)飼養(yǎng)。將配制的5 組菌液分別接種各試驗(yàn)組，每只雛鴨腿部肌肉注射0.2 mL 濃度為1.15×109CFU/mL 的懸菌液，對照組每只腿部肌肉注射0.2 mL 生理鹽水。

攻毒后的第1、3、5 天每組分別稱重并剖檢兩只雛鴨，第7 天將全部雛鴨稱重后頸部放血處死。取剖檢雛鴨心臟、肝臟、肺臟、十二指腸、脾臟等主要臟器稱取重量，觀察是否出現(xiàn)病變。使用燒紅的烙鐵將剖檢肝臟表面消毒，無菌接種環(huán)穿透肝臟表面接種至LB 固體培養(yǎng)基中，按2.2方法進(jìn)行鑒定，檢測剖檢鴨肝臟中是否含有沙門氏菌。

3 結(jié)果

3.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示，在獲得50 份樣品中共有5 份樣品（J1356、J1329、J1360、J1362、J1363）出現(xiàn)菌落生長。眼觀菌落邊緣整齊、光滑圓潤（圖1），與沙門氏菌菌落形態(tài)相似，故初步判定為沙門氏菌[7]。5 份樣品分別命名為沙門氏菌1、2、3、4、5 組。

3.2 PCR 鑒定結(jié)果

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，除空白對照外，試驗(yàn)組沙門氏菌1~5 組均于119 bp 處出現(xiàn)特異性條帶（圖2）。將PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行Blast 比對確認(rèn)檢測的5 株菌均為腸炎沙門氏菌。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖

3.3 動物回歸試驗(yàn)結(jié)果

致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門氏菌5 組毒力最強(qiáng)，其次依次為沙門氏菌2 組、4 組、3 組、1組，死亡率分別為87.5%、75%、62.5%、50%、12.5%，對照組無死亡（圖3）。

圖3 試驗(yàn)組各組存活率（詳見附錄彩圖）

觀察攻毒組雛鴨形態(tài)體征，發(fā)現(xiàn)接種沙門氏菌3 組與5 組懸菌液的雛鴨體態(tài)受影響最大。感染鴨跛行嚴(yán)重，不能正常行走；沙門氏菌3 組對雛鴨的體態(tài)運(yùn)動有較大的影響，同樣出現(xiàn)跛行，但癥狀較2、5 組輕，發(fā)生運(yùn)動障礙；4 組前期對體態(tài)無影響，沒有癥狀出現(xiàn)，隨日齡增長，逐步危害體態(tài)，使其運(yùn)動發(fā)生障礙；1 組對雛鴨的體態(tài)幾乎沒有影響。對照組雛鴨精神狀態(tài)良好，體態(tài)正常，飲食未有異常。

雛鴨剖檢觀察結(jié)果顯示，試驗(yàn)組心臟、肺臟、十二指腸重量均輕于同日齡對照組雛鴨，脾臟則普遍重于同日齡對照組；沙門氏菌2 組、5 組心臟病理變化不明顯，肝臟有不同程度腫脹、出現(xiàn)大小不一的出血點(diǎn)和壞死灶。接毒72 h 后，沙門氏菌1 組心臟出現(xiàn)心包炎及出血，心臟外膜有黃白色纖維素樣物質(zhì)滲出，出現(xiàn)壞死灶或結(jié)節(jié)；肝臟發(fā)生肝周炎，肝臟表面滲出白色纖維素狀物，出現(xiàn)壞死灶；肝被膜與胸壁、心臟腹膜發(fā)生粘連。脾臟、肺臟、十二指腸也有輕微病變：脾臟不同程度腫脹、出血、淤血；肺臟不同程度出血，呼吸道出現(xiàn)大量的黏液；十二指腸僅見少量出血點(diǎn)，未出現(xiàn)明顯病變。同日齡對照組雛鴨各組織臟器均正常，無任何病變和壞死灶。由此可見，分離到的5 株沙門氏菌菌株對心臟、肝臟的致病性有較大差異，對其余臟器也有致病性，但各組間差異較小。

對各組感染鴨肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，沙門氏菌2、3、4、5 組在LB 固體培養(yǎng)基上生長出灰白色、半透明狀的菌落，對分離得到的18 個帶菌平板挑取單菌落進(jìn)行PCR 反應(yīng)并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖4 所示。除空白對照外，挑取的18 個單菌落均于119 bp 處出現(xiàn)特異性條帶。將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果上傳NCBI 經(jīng)Blast 比對后確定為腸炎沙門氏菌。

圖4 分離細(xì)菌的凝膠電泳結(jié)果圖

4 結(jié)論

本試驗(yàn)自山東省部分地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖場采集的病料中分離到5 株沙門氏菌，經(jīng)過一系列檢測鑒定確認(rèn)為鴨腸炎沙門氏菌，分別命名為沙門氏菌1、2、3、4、5 株。動物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的5 株沙門氏菌均有不同程度的致病性，且不同的菌株致病力不同，多呈現(xiàn)急性或者亞急性感染。從致病性來看，5 組的致病性最強(qiáng)，死亡率高達(dá)87.5%，其次為2 組、4 組、3 組、1 組；從病理變化來看，2 組、5 組的病理變化不明顯，僅出現(xiàn)肝脾腫大、出血等現(xiàn)象，4 組感染鴨出現(xiàn)卵黃吸收障礙，1 組和3 組病變不明顯，致死率也較低，更傾向發(fā)展為隱性感染。因此，感染沙門氏菌的雛鴨除出現(xiàn)病變嚴(yán)重、死亡等顯性癥狀外，也極容易出現(xiàn)隱性感染，這種感染會使鴨產(chǎn)品成為腸炎沙門氏菌的隱性傳染源，威脅養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，危害人類健康。若想預(yù)防沙門氏菌的感染，應(yīng)從傳染源、傳播途徑入手，注意加強(qiáng)鴨舍內(nèi)外環(huán)境、飲食環(huán)境的消殺，阻斷或降低環(huán)境因素導(dǎo)致的水平傳播風(fēng)險[8]。