田恒旗，王 耀,,*，楊海濤，李兆周，吳佳蓓，王 琳，劉浩宇，常云鶴，陳秀金,*

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南宜測科技有限公司，河南 鄭州 451162；3.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005）

農(nóng)藥在保障農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的同時，其本身也是一把雙刃劍，隨著農(nóng)藥的種類、使用量以及農(nóng)藥適用范圍的日益增加，相關(guān)食品安全事件頻頻發(fā)生，農(nóng)藥殘留成為了影響農(nóng)產(chǎn)品安全問題的一個重要因素[1-2]。馬拉硫磷是果蔬種植過程中常用的殺蟲劑，也常作為谷物儲藏的保護(hù)劑。馬拉硫磷雖屬于低毒性化合物[3]，但長期不合理的使用會導(dǎo)致環(huán)境及食品中馬拉硫磷殘留量超標(biāo)，經(jīng)食物鏈的富集進(jìn)入人體內(nèi)，通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，造成肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，嚴(yán)重的可導(dǎo)致中毒死亡[4]。長時間暴露于含馬拉硫磷的環(huán)境中也可能引發(fā)心肌炎、肺水腫、胰腺炎等并發(fā)癥[5]。

傳統(tǒng)的馬拉硫磷農(nóng)藥殘留檢測方法多為儀器檢測法[6]，如利用質(zhì)譜儀或色譜儀檢測農(nóng)藥殘留[7]，其準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，可同時檢測多種成分[8]。但是傳統(tǒng)檢測方法因儀器價格昂貴、樣品處理繁瑣、經(jīng)濟成本高，多作為確證手段使用，無法滿足現(xiàn)場即時檢測需要[9]。目前馬拉硫磷的快速檢測方法主要有酶抑制法和免疫分析法[10]，酶抑制法的檢測成本較低，易于操作，但是酶不穩(wěn)定、容易失活，導(dǎo)致誤差很大[11]。免疫分析法的特異性強，但是特異性抗體制備周期長、成本較高[12]。

適配體是通過體外篩選技術(shù)-指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到的一種能特異結(jié)合待測靶標(biāo)（如蛋白質(zhì)或其他的小分子物質(zhì)）的單鏈核苷酸[13]。與傳統(tǒng)的抗體相比，適配體具有易合成、可修飾性強、結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢[14-15]。目前，已有多種農(nóng)藥被篩選出高親和力和強特異性的適配體[16]，在此基礎(chǔ)上，也建立了包括比色法[17]、熒光法[18]、電化學(xué)法[19]在內(nèi)的多種農(nóng)藥殘留適配體傳感檢測方法，推動了農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展[20]。

本研究以馬拉硫磷特異性適配體作為識別元件、基于納米金（gold nanoparticles，AuNPs）作為顏色指示劑，建立了馬拉硫磷的適配體比色傳感檢測方法。本方法原理如圖1所示，AuNPs是穩(wěn)定的膠體溶液[21]，在高鹽環(huán)境下AuNPs會發(fā)生聚集，顏色和紫外吸收光譜會發(fā)生變化，若在體系中加入適配體，通過靜電吸附作用，適配體會結(jié)合到AuNPs表面，保護(hù)AuNPs在溶液中保持分散狀態(tài)，不發(fā)生聚集[22]，體系顏色也不發(fā)生變化，當(dāng)加入馬拉硫磷后，適配體與馬拉硫磷的高親和力使得適配體會優(yōu)先與馬拉硫磷結(jié)合，AuNPs失去了適配體的保護(hù)，在高鹽濃度下會發(fā)生聚集，溶液的顏色由紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)紫色，顏色的變化程度與添加的馬拉硫磷質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

圖1 AuNPs-適配體比色傳感法原理圖Fig.1 Schematic diagram of the principle of colorimetric sensing method using AuNPs-based aptamer

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜和蘋果購于本地超市。

氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸鈉、EDTA、K2CO3、馬拉硫磷、毒死蜱、樂果、丙溴磷、倍硫磷、吡蟲啉、敵敵畏、對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈、NaCl、HCl、單寧酸（均為分析純）天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。實驗用水均為超純水（18.2 MΩ·cm）。

馬拉硫磷適配體序列參照Williams等[23]的研究，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：5’-TGT ACC GTC TGA GCG ATT CGT ACT ATG GTA TCC GAG AGG CCTACG GAA TTG TTG TAC AGC CAG TCA GTG TTA AGG AGT GC-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

透射電子顯微鏡 日立科學(xué)儀器有限公司；UV-2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司；氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技有限公司；H1650R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；pHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠；Vortex 1渦旋混均器 德國IKA公司；JJ224BF型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AuNPs的制備

使用單寧酸和檸檬酸為還原劑合成AuNPs[24]。首先，在攪拌下將1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HAuCl4和79 mL超純水加入到一個燒瓶中，然后在攪拌下將4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉、0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的單寧酸、0.1 mL濃度為25 mmol/L的K2CO3和15.8 mL超純水加入到另一個燒瓶中，將上述兩種制備的溶液分別加熱至60 ℃并保持30 min，然后在高速攪拌下混合在一起，直至顏色變?yōu)榫萍t色且不再變化，然后冷卻至室溫，將溶液儲存在4 ℃冰箱中。

1.3.2 AuNPs-適配體比色法檢測馬拉硫磷

用1×TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制1 μmol/L馬拉硫磷適配體溶液，然后將30 μL適配體溶液和150 μL AuNPs充分混勻，孵育10 min，加入30 μL馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液混勻，孵育10 min，再加入30 μL濃度為500 mmol/L的NaCl溶液充分混勻，反應(yīng)10 min，裸眼觀察溶液的顏色變化，并用UV-2600紫外-可見分光光度計掃描350～750 nm的紫外吸收光譜，記錄峰值變化，配制不同質(zhì)量濃度馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（50、100、200、300、400、800、1 500 ng/mL），用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有測定均在室溫下進(jìn)行。

1.3.3 特異性鑒定

配制800 ng/mL的馬拉硫磷、樂果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敵敵畏、草甘膦、吡蟲啉、倍硫磷溶液，按照AuNPs-適配體比色傳感法檢測馬拉硫磷的步驟，分別進(jìn)行適配體的特異性鑒定，并取等體積的緩沖液作為陰性對照。

1.3.4 實際樣品檢測

粉碎并稱取5.0 g具有代表性的果蔬樣本并加工成均質(zhì)的勻漿，加入20 mL濃度為10 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液與其混合，然后置于振蕩器上劇烈振蕩10 min，之后室溫下8 000 r/min離心20 min，以除去固體物質(zhì)。然后使用0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液，將過濾后的上清液作為提取液。將馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品添加到提取液中，制成不同質(zhì)量濃度（200、400、800 ng/mL）的加標(biāo)檢測液。使用本方法和國標(biāo)法進(jìn)行實際樣品中馬拉硫磷的檢測并將檢測結(jié)果進(jìn)行對比。

1.3.5 儀器驗證

參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》）[25]，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，條件如下：色譜柱溫度40 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min程序升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，再以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min，進(jìn)樣量為1 μL，流速為1.0 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖表繪制

采用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制，每組實驗重復(fù)3 次平行實驗，取平均值作為實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs的表征

制備的AuNPs為顏色鮮艷的酒紅色膠體溶液，紫外表征發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰在518 nm波長處，峰形較為尖銳（圖2），這表明制備的AuNPs粒徑均一，具有較好的性能。用透射電鏡對制備的AuNPs的外觀形貌進(jìn)行表征（圖3），可以看出AuNPs呈現(xiàn)統(tǒng)一的圓球形，粒徑較為均一，約為10 nm。正常情況下為分散狀態(tài)（圖3A），而在加入NaCl溶液后會發(fā)生聚集（圖3B）。綜上所述，本研究合成的AuNPs在水中呈現(xiàn)膠體狀，具有均有的大小和形狀，分散性良好，性質(zhì)穩(wěn)定[26]。

圖2 AuNPs的紫外表征Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of AuNPs

圖3 AuNPs的透射電鏡表征Fig.3 Transmission electron microscopic image of AuNPs

2.2 檢測體系優(yōu)化

2.2.1 AuNPs體積的優(yōu)化

AuNPs是整個檢測體系的顏色指示劑，其體積在整個反應(yīng)體系中的占比直接影響方法的靈敏度，為獲得裸眼觀察的最佳指示顏色深度，通過向溶液中加入30 μL的馬拉硫磷適配體溶液、馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和500 mmol/L N a C l 溶液，優(yōu)化A u N P s 在整個反應(yīng)體積中的占比（40.0%、50.0%、62.5%、70.0%），結(jié)果見圖4，當(dāng)AuNPs體積分?jǐn)?shù)為40%、50%和62.5%時，體系可以由紅色變藍(lán)色，但是體積分?jǐn)?shù)為40%和50%時，顏色變化不明顯，體積分?jǐn)?shù)為62.5%時，顏色變化較為明顯。因此選擇AuNPs的體積分?jǐn)?shù)為62.5%，即加入150 μL AuNPs溶液。

圖4 AuNPs的體積優(yōu)化Fig.4 Optimization of volume of AuNPs used

2.2.2 NaCl濃度的優(yōu)化

AuNPs會在高鹽環(huán)境下發(fā)生聚集，隨著NaCl濃度的增加，AuNPs的聚集程度也隨之增加，AuNPs的顏色發(fā)生明顯變化，由酒紅色逐漸變?yōu)樗{(lán)紫色。當(dāng)NaCl濃度過大時，在沒有靶標(biāo)的情況下AuNPs也可能發(fā)生聚集；當(dāng)NaCl濃度過小時，AuNPs可能只發(fā)生部分聚集從而影響試驗的結(jié)果，因此本研究對NaCl濃度進(jìn)行優(yōu)化[27]。在AuNPs的最佳反應(yīng)體積下（150 μL），用超純水代替適配體和靶標(biāo)，然后加入30 μL不同濃度（0、50、200、350、500、650、800、950 mmol/L）的NaCl溶液，充分混勻，靜置10 min后觀察溶液的顏色并使用紫外分光光度計進(jìn)行吸光度的測定。

如圖5所示，當(dāng)NaCl濃度低于500 mmol/L時，AuNPs呈紅色，表明此時的NaCl濃度較低，無法使AuNPs發(fā)生聚集；當(dāng)NaCl濃度為500 mmol/L時，AuNPs發(fā)生聚集，顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。之后隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，AuNPs的顏色不再發(fā)生明顯變化。但是單以顏色變化不能夠準(zhǔn)確判定出AuNPs聚集完成情況，需要根據(jù)紫外吸收光譜的變化進(jìn)行判定。由圖5可以看出，隨著NaCl濃度增加，AuNPs在518 nm波長處的吸收峰值逐漸變小，并且在620 nm波長處出現(xiàn)了一個新的特征吸收峰，這是因為AuNPs發(fā)生聚集導(dǎo)致等離子發(fā)生了共振變化，使得AuNPs的特征吸收峰向右發(fā)生了偏移。因此，需要根據(jù)A620nm/A518nm值判定AuNPs的聚集程度，結(jié)果如圖6所示，當(dāng)NaCl濃度為500 mmol/L時，A620nm/A518nm值突然增大，之后隨著NaCl濃度的繼續(xù)增加，不再發(fā)生明顯變化，因此NaCl的最佳濃度為500 mmol/L。

圖5 NaCl的濃度優(yōu)化Fig.5 Optimization of NaCl concentration

圖6 不同NaCl濃度下A620 nm/A518 nm值Fig.6 A620 nm/A518 nm ratio at different NaCl concentrations

2.2.3 適配體濃度的優(yōu)化

當(dāng)AuNPs溶液中不存在適配體時，AuNPs在高鹽環(huán)境下會發(fā)生聚集，AuNPs由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色；當(dāng)加入的適配體濃度較低時，通過靜電吸附作用，低濃度的適配體可以吸附在AuNPs表面，但因為濃度較低，不能夠?qū)uNPs的表面完全包裹，仍然有一部分AuNPs呈單一分散狀態(tài)，此時AuNPs溶液會由藍(lán)色變?yōu)樗{(lán)紫色；當(dāng)適配體濃度為1 μmol/L時，適配體可以保護(hù)AuNPs不發(fā)生聚集現(xiàn)象，此時AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色，之后隨著適配體濃度的繼續(xù)增加，不再發(fā)生明顯變化。如圖7所示，當(dāng)適配體濃度為1 μmol/L時，A620nm/A518nm值也不再隨著適配體濃度的增加而改變，說明在500 mmol/L的NaCl濃度下，1 μmol/L的適配體已經(jīng)將AuNPs的表面完全包裹，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不再受高NaCl濃度的影響發(fā)生聚集現(xiàn)象。

圖7 不同適配體濃度下A620 nm/A518 nm值Fig.7 A620 nm/A518 nm ratio at different aptamer concentrations

2.2.4 反應(yīng)時間的優(yōu)化

AuNPs在高濃度NaCl溶液中的聚集需要一定時間，在達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)之前，顏色會不斷發(fā)生變化，與之相應(yīng)的A518nm也會不斷發(fā)生變化。為了使檢測更為準(zhǔn)確，減小誤差，需要研究體系顏色從不斷發(fā)生變化到達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需要的時間。如圖8所示，當(dāng)NaCl濃度為500 mmol/L時，A518nm在10 min之前，隨著反應(yīng)時間的延長吸光度不斷降低；而在10 min后，隨著反應(yīng)時間延長，吸光度不再發(fā)生明顯變化。因此，AuNPs與500 mmol/L的NaCl溶液的最佳反應(yīng)時間為10 min。

圖8 AuNPs與NaCl不同反應(yīng)時間下A518 nm值Fig.8 Change in A518 nm as a function of reaction time between AuNPs and NaCl

如圖9所示，隨著AuNPs與適配體孵育時間延長，A518nm也隨之增加，在10 min時吸光度達(dá)到最大。然后隨著時間延長，吸光度開始出現(xiàn)一段下降趨勢。這表明時間較短時，適配體還沒有完全吸附在AuNPs的表面，存在一部分分散的AuNPs；適配體作為單鏈DNA序列，反應(yīng)時間過長時，序列的質(zhì)量在室溫下會有所下降，可能會導(dǎo)致部分AuNPs不再處于聚集狀態(tài)。綜上所述，AuNPs與適配體的最優(yōu)反應(yīng)時間為10 min。

圖9 AuNPs與適配體不同反應(yīng)時間下A518 nm值Fig.9 Change in A518 nm as a function of reaction time between AuNPs and aptamer

2.3 靈敏度檢測

在最佳的條件下，建立了AuNPs-適配體比色傳感法定量檢測馬拉硫磷的方法，為減弱基質(zhì)效應(yīng)影響，采用與實際樣品相同的加標(biāo)條件繪制了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖10所示，隨著馬拉硫磷質(zhì)量濃度升高，溶液顏色逐漸由紅變藍(lán)，在馬拉硫磷質(zhì)量濃度范圍為50～1 500 ng/mL時，A620nm/A518nm值與馬拉硫磷質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.930 07X＋2.695 75×10-4，R2=0.995，檢出限為45.54 ng/mL。在馬拉硫磷質(zhì)量濃度為300 ng/mL時，AuNPs已經(jīng)開始變色，為防止視覺誤差，馬拉硫磷目測檢出限為400 ng/mL。本方法與其他檢測方法的比較如表1所示，國標(biāo)中規(guī)定的生菜和蘋果中馬拉硫磷的最大殘留限量最低為500 ng/mL，本方法的檢出限遠(yuǎn)低于國標(biāo)限量，且在較大的線性范圍內(nèi)均適用。

表1 文獻(xiàn)報道方法與本法檢測馬拉硫磷的比較Table 1 Comparison of this method and other reported ones for the determination of malathion

圖10 不同馬拉硫磷質(zhì)量濃度下A620 nm/A518 nm值Fig.10 A620 nm/A518 nm ratio at different malathion concentrations

2.4 特異性鑒定

本研究選擇馬拉硫磷、樂果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敵敵畏、草甘膦、吡蟲啉、倍硫磷考察方法的特異性，如圖11所示，在體系中加入800 ng/mL的馬拉硫磷、樂果、乙酰甲胺磷、毒死蜱、敵敵畏、草甘膦、吡蟲啉、倍硫磷，除馬拉硫磷外，加入其他農(nóng)藥時A620nm/A518nm值較低，與陰性對照大致相同，AuNPs不發(fā)生聚集；而加入馬拉硫磷時，體系中A620nm/A518nm值較大，AuNPs發(fā)生聚集現(xiàn)象。表明本方法對馬拉硫磷具有特異性識別能力，且馬拉硫磷結(jié)構(gòu)類似物及其他有機磷農(nóng)藥不會影響馬拉硫磷殘留的特異性檢測。

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

為驗證建立的AuNPs-適配體比色傳感法的準(zhǔn)確性和可靠性，采用本方法對生菜和蘋果樣品進(jìn)行檢測。從本地超市購得生菜和蘋果樣品中未檢出馬拉硫磷。通過向預(yù)處理的樣品中添加馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)品制成不同質(zhì)量濃度（200、400、800 ng/mL）的加標(biāo)檢測液。使用本方法進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)測定3 次。如表2所示，基于AuNPs-適配體的比色傳感法檢測馬拉硫磷的加標(biāo)回收率范圍分別為98.24%～100.91%和99.48%～101.29%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.2%～2.2%和0.2%～2.8%。上述結(jié)果表明，基于適配體建立的AuNPs-適配體比色傳感法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。本方法可用于生菜和蘋果中馬拉硫磷的快速篩查和現(xiàn)場檢測。

表2 馬拉硫磷在生菜和蘋果中的加標(biāo)回收結(jié)果（本方法）Table 2 Recoveries of malathion from spiked lettuce and apple samples using this method

2.6 方法驗證結(jié)果

國標(biāo)法檢測結(jié)果如表3所示，將本方法的檢測結(jié)果與國標(biāo)法的結(jié)果進(jìn)行對比（圖12），結(jié)果顯示兩者的準(zhǔn)確度一致，生菜樣品和蘋果樣品的R2均為0.999，證實了本方法的可靠性。

表3 馬拉硫磷在生菜和蘋果中的加標(biāo)回收結(jié)果（國標(biāo)法）Table 3 Recoveries of malathion from spiked lettuce and apple samples using the national standard method

圖12 本方法和國標(biāo)法的加標(biāo)回收結(jié)果對比Fig.12 Comparison of recoveries of this method with those of the national standard method

3 結(jié) 論

以AuNPs為指示劑，馬拉硫磷適配體作為識別元件，建立了AuNPs-適配體比色傳感法。通過優(yōu)化溶液濃度，最后得到NaCl最適濃度為500 mmol/L，適配體濃度為1 μmol/L。通過優(yōu)化孵育時間，最終得到的NaCl與AuNPs最佳反應(yīng)時間為10 min，馬拉硫磷適配體與AuNPs最佳反應(yīng)時間為10 min。本方法在馬拉硫磷質(zhì)量濃度為50～1 500 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.995，根據(jù)計算得到本方法檢出限為45.54 ng/mL，

目測檢出限為400 ng/mL。本方法簡單快速，易于進(jìn)行定性和定量分析，具有優(yōu)異的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性。經(jīng)驗證，本方法在實際加標(biāo)樣品中的檢測結(jié)果與國標(biāo)法的檢測結(jié)果高度一致，是一種可行的快速檢測食品中馬拉硫磷殘留的高效方法，可為其他農(nóng)藥的現(xiàn)場快速篩查方法研究提供參考。