武曉玲，徐珒昭，徐遠(yuǎn)志，寧 可，解慶剛，許曉曦,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 164800）

嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被稱作新一代益生菌，是一種典型的哺乳動物腸道菌，依賴于腸道上皮細(xì)胞分泌的黏蛋白生存[1]，是腸道黏液層的關(guān)鍵微生物[2]，更與多種疾病存在重要關(guān)聯(lián)[3]。腸道內(nèi)Akk降解黏蛋白的代謝產(chǎn)物，如短鏈脂肪酸等，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)[4]，減輕肝臟氧化應(yīng)激和炎癥、減輕乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷[5]。Mithieux等[6]還發(fā)現(xiàn)，Akk能促進(jìn)腸道黏液產(chǎn)生，使黏液層增厚，并通過促進(jìn)Foxp3＋Treg、白細(xì)胞介素IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β表達(dá)，減少胰島炎癥，在I型糖尿病中起保護(hù)作用。口服Akk菌及其外膜蛋白Amuc_1100可增加結(jié)腸和腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞CTL的數(shù)量，上調(diào)其腫瘤壞死因子TNF-α表達(dá)、抑制程序性死亡受體PD-1表達(dá)，對小鼠結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)直腸癌起抑制作用[7]?？诜嗀kk還可改善老化小鼠的腸道表型，增強腸屏障完整性和腸細(xì)胞增殖再生能力，改善認(rèn)知功能、減少虛弱和肌肉萎縮，維持健康及延長壽命[8]，因此該菌也被稱為“長壽菌”。除此之外，尚有報道稱Akk在腸黏膜炎[9]、非酒精性脂肪肝[10]、結(jié)腸炎[11]等疾病的治療中也發(fā)揮重要作用。目前全球唯一一家Akk活菌制劑生產(chǎn)企業(yè)——美國Pendulum公司于2020年6月4日已上市銷售，其作為特醫(yī)產(chǎn)品主要用于II型糖尿病的治療[6]。

Akk作為一種典型的腸道菌，只能耐受低濃度的氧氣，其體外培養(yǎng)更是生長周期長、生長速度慢。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌生長存在一定的自然周期性，給工業(yè)化高密度培養(yǎng)帶來更多難題。到目前為止，Derrine等[12]提出適用于Akk培養(yǎng)的黏蛋白培養(yǎng)基是目前唯一的選擇性培養(yǎng)基，但近年來研究也發(fā)現(xiàn)，Akk可在其他培養(yǎng)基中增殖，如腦心浸液肉湯（brain-heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基[13]等。Liu Xinyue等[14]則以黏蛋白培養(yǎng)基為對照，將不同含量的黏蛋白加入BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以滿足Akk的營養(yǎng)需求；Machado[15]、Almeidado[16]等用PYG肉湯培養(yǎng)基評估了Akk在不同溫度、大氣和胃腸道模擬條件下的培養(yǎng)情況，活菌數(shù)可達(dá)到1.3×109CFU/mL，但由于這些培養(yǎng)基成分均較為復(fù)雜導(dǎo)致其成本較高，增加了工業(yè)化生產(chǎn)的難度。

本團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，Akk可利用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基成分簡單價格便宜，唯其生長速度較為緩慢。在該培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上篩選確定以卵清蛋白代替原培養(yǎng)基中的酵母浸粉，調(diào)整培養(yǎng)基中氮源的配比，以磷酸二氫鉀替換氯化鈉，并調(diào)整各組分的添加量，篩選出適合工業(yè)化生產(chǎn)且價格更低的優(yōu)化培養(yǎng)基配方。因不同的營養(yǎng)條件可影響菌的代謝產(chǎn)物種類及組成，且目前對Akk代謝產(chǎn)物與宿主疾病間互作關(guān)系鮮有報道，目前僅有Martin-Gallausiaux等[17]發(fā)現(xiàn)Akk菌培養(yǎng)上清液能夠激活腸上皮細(xì)胞中的NF-κB信號通路，上調(diào)MUC 2、BIRC 3和TNFAIP 3等腸屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)，提高腸細(xì)胞單層的完整性。因此利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對比分析Akk在這兩種培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物的差異，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路探究其特征性代謝產(chǎn)物與疾病的關(guān)聯(lián)，并以此證明優(yōu)化培養(yǎng)基在工業(yè)化高密度培養(yǎng)中的優(yōu)勢及應(yīng)用前景，旨在為Akk在中國的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AkkDSM 22959 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；無水葡萄糖 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；卵清蛋白（80%～90%） 大連美侖生物技術(shù)有限公司；酪蛋白胨 上海麥克林生化科技有限公司；硫代乙醇酸鈉 中國惠興生化試劑有限公司；L-胱氨酸 上海瑞永生物科技有限公司；刃天青 北京博奧拓科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純） 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市大陸化學(xué)試劑廠；1499230-935乙腈（分析純）、70221乙酸銨（≥98%） 德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GI 54 DWS高壓滅菌器 美國致微儀器有限公司；OptiClean 1300潔凈工作臺 上海力康精密科技有限公司；LC-85 C隔膜式抽氣泵 上海力辰邦西儀器科技有限公司；TS 2210 K 12 GB 5099氮氣鋼瓶 哈爾濱市通達(dá)工業(yè)氣體有限公司；SPL-80生化培養(yǎng)箱 天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；UV 752 N紫外分光光度儀 上海儀電分析儀器有限公司；5430 R低溫高速離心機(jī) 德國艾本德公司；AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀 美國愛博才思公司；1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與傳代

將安瓿管中的200 μgAkk凍干菌粉接入10 mL硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下厭氧（101 kPa、90% N2、10% CO2）培養(yǎng)5 d，菌種恢復(fù)活力后，以4%[18]（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中傳代，在上述條件下培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行傳代，實驗使用第3代菌。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3.2Akk在兩種培養(yǎng)基中生長曲線的測定

將活化后第3代Akk按照4%接種量分別接種至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中，在1.3.1節(jié)條件下培養(yǎng)。測定菌液密度，每隔4 h測定一次菌液的OD600nm，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，每次測定均設(shè)置3 個重復(fù)。

1.3.3 活菌計數(shù)

采用平板傾注的方法進(jìn)行平板計數(shù)。用生理鹽水將Akk在兩種培養(yǎng)基中生長到穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行梯度稀釋，實驗選用10-5、10-6、10-73 個梯度，分別吸取200 μL稀釋后的菌液到滅菌培養(yǎng)皿中，配好的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45 ℃左右，傾注到培養(yǎng)皿中，并立即輕輕水平轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液于培養(yǎng)基充分混勻，待培養(yǎng)基凝固后將平板倒置，在1.3.1節(jié)條件下培養(yǎng)，4 d后選取菌落數(shù)在30～300 個之間的平板統(tǒng)計菌落數(shù)，按下式計算活菌數(shù)：

活菌數(shù)/（CFU/mL）=同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

1.3.4Akk發(fā)酵上清液的制備

將Akk分別接種到硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中，在1.3.1 節(jié)條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期，1 000 r/min、4 ℃離心10 min，并用0.22 μm濾膜過濾，得到發(fā)酵上清液，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，每個樣本設(shè)置6 次重復(fù)。

1.3.5Akk發(fā)酵液樣本提取

樣本在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇-乙腈-水（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥，質(zhì)譜分析時加入100 μL乙腈溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.6 液相色譜-質(zhì)譜分析

1.3.6.1 色譜條件

樣本采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱進(jìn)行分離；柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量2 μL；流動相A為水＋25 mmol/L乙酸銨＋25 mmol/L氨水，B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B；整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊列中插入質(zhì)控（quality control，QC）樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實驗數(shù)據(jù)的可靠性（QC樣本是由待測樣本等量混合制成，在待測樣本液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)樣前、進(jìn)樣中和進(jìn)樣后上機(jī)檢測）。

1.3.6.2 質(zhì)譜條件

采用AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級、二級譜圖的采集。色譜分離后的電噴霧電離源條件如下：霧化氣壓（Gas1）60 kV，輔助氣壓（Gas2）60 kV，簾氣壓力30 arb，發(fā)射源溫度600 ℃，噴霧電壓±5 500 V（正負(fù)兩種模式）；飛行時間質(zhì)譜掃描范圍m/z60～1 000，產(chǎn)物離子掃描范圍m/z25～1 000，飛行時間質(zhì)譜掃描累積時間0.20 s/spectra，產(chǎn)物離子掃描累積時間0.05 s/spectra；二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集獲得，并且采用高靈敏度模式，去簇電壓設(shè)為±60 V（正負(fù)兩種模式），碰撞電壓設(shè)為（35±15）eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長情況對比

由于Akk在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中生長其菌液密度極低（生長速度慢且活菌數(shù)較少），因此本課題組前期在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對Akk培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。為確定Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長穩(wěn)定期以制備發(fā)酵上清液樣本，并對比Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長情況，通過測定菌液OD600nm并繪制生長曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 Akk在兩種培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Akk in original and optimized thioglycolate medium

由圖1可知，0～8 h為Akk的生長遲緩期，12 h左右進(jìn)入生長對數(shù)期。在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，Akk生長對數(shù)期為12～32 h，32 h菌液OD600nm達(dá)到最高（0.269±0.003），之后進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期活菌數(shù)為6.75×107CFU/mL。而在優(yōu)化培養(yǎng)基中的生長對數(shù)期同樣在12 h左右進(jìn)入對數(shù)期，44 h時菌液OD600nm最高可達(dá)0.761±0.011，是硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基的2.83 倍，并在44 h之后趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定期的活菌數(shù)為1.74×109CFU/mL，比硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基高出2 個數(shù)量級。由此可知，優(yōu)化后的培養(yǎng)基雖相對延長了Akk的對數(shù)生長期，但顯著提高了Akk的菌液密度及活菌數(shù)。并由此選擇其在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)入生長旺盛期的32 h和44 h發(fā)酵上清液，用以分析兩組樣本的差異代謝物。

2.2 差異性代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 QC分析

為評價儀器的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性，分別在正負(fù)離子模式下將QC樣本總離子流圖進(jìn)行譜圖重疊比較，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明兩種模式下各色譜峰的響應(yīng)強度和保留時間均基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，實驗結(jié)果較為可靠。

2.2.2 代謝物鑒定數(shù)量及化學(xué)分類歸屬統(tǒng)計

通過高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測Akk在兩種培養(yǎng)基發(fā)酵上清液中的代謝產(chǎn)物，正負(fù)離子模式下合計鑒定到代謝產(chǎn)物2 253 種，其中正離子模式下鑒定到代謝產(chǎn)物1 585 種，負(fù)離子模式下鑒定到668 種。根據(jù)化學(xué)分類歸屬信息將所有代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計，各類代謝物數(shù)量所占比例如圖3所示。

圖3 鑒定的代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量占比Fig.3 Proportion of metabolites identified in various chemical classifications

兩組樣本中檢測到的代謝物包括有機(jī)酸及其衍生物（34.976%），脂質(zhì)和脂質(zhì)類分子（21.127%），有機(jī)雜環(huán)化合物（10.567%），苯甲酸類（6.569%），有機(jī)氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和類似物（2.308%），有機(jī)氮化合物（1.243%），生物堿及其衍生物（0.666%），木質(zhì)素、新木質(zhì)素及相關(guān)化合物（0.178%），有機(jī)金屬化合物（0.133%），有機(jī)硫化合物（0.133%），烴類衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。

2.2.3 組間差異分析

本研究結(jié)合單變量統(tǒng)計分析和多維統(tǒng)計分析方法，篩選Akk在兩種培養(yǎng)基中的顯著性差異代謝物，對正、負(fù)離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進(jìn)行分析。

2.2.3.1 單變量統(tǒng)計分析

在進(jìn)行兩組樣本間的差異分析時，常用的單變量統(tǒng)計分析方法包括差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）分析、T檢驗/非參檢驗?；趩巫兞糠治?，對正、負(fù)離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進(jìn)行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902 種，其中正離子模式下670 種，負(fù)離子模式下232 種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結(jié)果如圖4所示。

圖4 正（a）、負(fù)（b）正負(fù)離子模式火山圖Fig.4 Volcano maps of differential metabolites in positive (a) and negative (b) ion modes

如圖4 所示，每個圓圈代表一個特定的代謝產(chǎn)物，優(yōu)化后相對優(yōu)化前，紅色為顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＞1.5，P＜0.05），藍(lán)色為顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對紅色和藍(lán)色圓圈代表的顯著性差異代謝物。

2.2.3.2 多維統(tǒng)計分析

多維統(tǒng)計分析可以從總體水平反映組間差異以及組內(nèi)的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。

圖5 正（a）、負(fù)（b）離子模式下PCA得分圖Fig.5 PCA score plots in positive (a) and negative (b) ion modes

圖5中橢圓代表95%置信區(qū)間，同一顏色的點表示組內(nèi)的各個生物學(xué)重復(fù)，由點的分布狀態(tài)可以看出，該模型可以區(qū)分兩組樣本，組間樣本的數(shù)據(jù)點很好地集中在一起。PCA模型參數(shù)R2X越接近1表明模型越可靠，正、負(fù)離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結(jié)果表明該模型穩(wěn)定可靠，實驗重復(fù)性好，隨機(jī)誤差較小，可進(jìn)一步對樣本進(jìn)行差異性分析。

OPLS-DA是為了濾除與分類信息無關(guān)的噪音、提高模型的解析能力和有效性。為避免模型在建模過程中發(fā)生過擬合，保證模型的有效性，采用置換檢驗對模型進(jìn)行檢驗。OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗如圖6所示。

圖6 正（a）、負(fù)（b）離子模式下OPLS-DA得分圖及置換檢驗圖Fig.6 OPLS-DA score plots and permutation test plots in positive (a) and negative (b) ion modes

如圖6所示，t[1]能最大程度反映組間差異，而to[1]則反映組內(nèi)變異?？梢钥闯鯫PLS-DA模型可顯著區(qū)分兩組樣本，且組內(nèi)差異較小，結(jié)果與PCA模型一致。經(jīng)7 次循環(huán)交互驗證得到模型評價參數(shù)R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5 即表明模型穩(wěn)定可靠。該模型正、負(fù)離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機(jī)模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 篩選差異代謝物

O P L S-D A 模型得到的變量權(quán)重值（v a r i a b l e importance for the projection，VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實驗以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，正離子模式下篩選到670 種顯著性差異代謝物，負(fù)離子模式下篩選到232 種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯觯c硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基相比，Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵后，正離子模式下22 種代謝產(chǎn)物顯著上調(diào)，28 種代謝產(chǎn)物顯著下調(diào)，負(fù)離子模式下顯著上調(diào)代謝產(chǎn)物22 種，顯著下調(diào)代謝產(chǎn)物28 種。后續(xù)將對這些顯著性差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。

圖7 正（a）、負(fù)（b）離子模式顯著性差異代謝物表達(dá)FC分析（VIP前50）Fig.7 Fold change (FC) of significantly differential metabolites with top 50 highest VIP scores in positive (a) and negative (b) ion modes

2.2.4 聚類分析

為了更全面直觀地顯示樣本之間的關(guān)系以及代謝物在不同樣本中的表達(dá)模式差異，將VIP值前50的顯著性差異代謝物用層次聚類進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖8所示。聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細(xì)胞通路。

Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中，顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、煙曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、檸檬酸鹽、甘露糖和各種多肽等，這些代謝產(chǎn)物在人體疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。其中肌酸[19]被認(rèn)為有抗炎作用，可減少炎癥標(biāo)志物的出現(xiàn)，并可抑制免疫反應(yīng)，并在鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，可減少氧化應(yīng)激，且有可能在水腫、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)傳遞改變方面發(fā)揮作用；煙曲霉素[20]是一種具有多種生物活性的抗生素，與降低體質(zhì)量、有效抑制肝腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移功能相關(guān)，Takayuki等[21]還發(fā)現(xiàn)，煙曲霉素是一種有效的血管生成抑制劑，能通過激活內(nèi)皮細(xì)胞中的p53通路上調(diào)p21表達(dá)，抑制血管生成并抑制腫瘤細(xì)胞生長。巴多昔芬[22]是一種雌激素受體調(diào)節(jié)劑，已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市，用于預(yù)防絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松。近年來大量研究證明了巴多昔芬在疾病中的作用，如抑制雌激素受體Cyclin D 1、p-P 70 S 6 K、Survivin、c-Myc和Bcl-2的表達(dá)抑制雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞[23]；通過抑制IL-6/IL-6R/STAT3信號傳導(dǎo)發(fā)揮抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，并能夠在腫瘤細(xì)胞中抑制白細(xì)胞介素IL-6與gp 130蛋白結(jié)合并阻斷其下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]；可有效穿過血腦屏障，緩解卵巢切除誘導(dǎo)的小鼠空間記憶損傷等[25]。由此表明，Akk的這些代謝產(chǎn)物是該菌在緩解腸道炎癥，治療癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病主要功能因素。

顯著下調(diào)的產(chǎn)物有：烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、煙酰胺、高三尖杉酯堿、靈芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龍膽苦苷等。其中，烏頭堿是有毒植物中存在的一種毒性成分—二萜類生物堿，毒性極強，具有心臟毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同時能通過血液吸收危害肝臟、腎臟等靶器官[26]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中的烏頭堿顯著下調(diào)，說明Akk在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵能更大程度發(fā)揮預(yù)防及治療心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病的作用[27]。除此之外的Akk代謝產(chǎn)物均被發(fā)現(xiàn)有一定抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等益生功效，但是優(yōu)化培養(yǎng)基中這些產(chǎn)物均有不同程度的下調(diào)，因此表明，補充Akk活菌制劑時應(yīng)注意其有效菌數(shù)，過多的活菌數(shù)可能帶來疾病風(fēng)險，Wang Qi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）緩解還是惡化骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）與腸道菌群的結(jié)構(gòu)有關(guān)，在Akk豐度適中時，CS能夠改善OA，但Akk含量高于或者低于硫酸酯酶分泌菌和硫酸鹽還原菌時，CS均能加重OA。也有研究[29]提出，補充滅活A(yù)kk可顯著改善超重/肥胖的胰島素抵抗者的多項代謝指標(biāo)，且安全性良好，效果優(yōu)于Akk活菌，由此為其作為后生元提供了有效證據(jù)。

2.2.5 KEGG通路注釋與分析

在生物體內(nèi)不同代謝物需要相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于KEGG通路分析有助于更進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能。為了解Akk在不同培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物含量變化的機(jī)制，將正負(fù)離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物整合后進(jìn)行KEGG通路注釋，并根據(jù)P值選擇顯著性最高的前20 條KEGG通路進(jìn)行富集，富集結(jié)果以氣泡圖的形式顯示，結(jié)果如圖9所示。

圖9 KEGG富集通路氣泡圖Fig.9 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway

富集最顯著的5 個通路為蛋白質(zhì)的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、膽汁分泌、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白質(zhì)的消化和吸收通路富集最為顯著，強調(diào)蛋白質(zhì)是Akk的第一營養(yǎng)需求，因此培養(yǎng)基優(yōu)化主要針對這一需求進(jìn)行。在這些通路中，蛋白質(zhì)的消化和吸收、膽汁的分泌是Akk消化系統(tǒng)中的代謝通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遺傳信息處理中發(fā)揮重要作用，ABC轉(zhuǎn)運蛋白涉及到Akk的膜運輸功能，對外界環(huán)境的信息進(jìn)行處理，氨基酸生物合成則可合成多種氨基酸。除膽汁分泌通路外，其余4 種代謝通路均富集到了多種氨基酸，人體所需的多種必需氨基酸包含其中，這些氨基酸均由培養(yǎng)基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代謝得到。富集到膽汁分泌通路上的代謝物有20 種，這些代謝物包括茚地那韋、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韋、烏本苷、長春花堿等，其中茚地那韋[30]是一種選擇性、強效和特異性的HIV蛋白酶抑制劑，目前用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，還能顯著減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）相關(guān)的記憶缺陷[31]，而相關(guān)研究表明，AD大鼠模型中，Akk可減輕AD大鼠的認(rèn)知障礙[32]。依托泊苷[33]、多烯紫杉醇[34]、長春花堿[35]等均為有效的抗腫瘤和抗癌藥物，可應(yīng)用于相應(yīng)的癌癥治療。此外一些研究也證實了Akk在肺癌[36]、結(jié)直腸癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[37]等的治療中發(fā)揮了重要作用。因此表明，其膽汁分泌通路可能是Akk發(fā)揮其功效的重要通路之一。蛋白質(zhì)的消化和吸收通路中富集到了一種短鏈脂肪酸——丙酸，它除能維持腸道健康、緩解腸道炎癥外，在人體其他組織和器官中也可發(fā)揮重要作用，膳食中補充丙酸可通過抑制食欲提高胰島素敏感性，并增加能量消耗防止高脂飲食引起的肥胖[38]。據(jù)報道[9]，Akk在體外培養(yǎng)時主要代謝產(chǎn)物為丁酸和丙酸，而在優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵后丙酸呈現(xiàn)顯著上調(diào)，一方面說明該培養(yǎng)基更有利于Akk發(fā)揮改善腸道疾病、減肥等作用。但目前也有報道，機(jī)體內(nèi)有機(jī)酸累積與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)[39]。由此也表明，腸道中Akk活菌數(shù)量應(yīng)保持一定上限，否則會帶來不良健康影響。

Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基通過影響其代謝通路，這些代謝通路產(chǎn)生代謝產(chǎn)物較硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基顯著上調(diào)，一方面表明該培養(yǎng)基組分能使Akk更好地發(fā)揮抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、緩解腸道炎癥等益生功能，另一方面，顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物則從側(cè)面說明如果腸道內(nèi)Akk豐度過高可能帶來某些疾病風(fēng)險，如增加骨關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等患病風(fēng)險等，且如果人體本身患有腸道炎癥補充Akk活菌反而會加重病情。

3 結(jié) 論

目前已知Akk與人體某些疾病存在重要關(guān)聯(lián)，但至今為止將其工業(yè)化高密度培養(yǎng)依然存在技術(shù)難題。本研究對硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了適合工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方，并通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)比較分析了Akk發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物之間的差異，這些代謝產(chǎn)物與Akk發(fā)揮抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)腸-腦軸和腸-肝軸等功能密切相關(guān)；將這些差異性代謝物進(jìn)行KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)Akk的蛋白質(zhì)消化和吸收通路富集最為顯著，證明了影響該菌生長的最重要因素是蛋白質(zhì)，同時也表明以此對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化的合理性。為該培養(yǎng)基在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用提供了依據(jù)，也為將來Akk高密度培養(yǎng)以及作為后生元的可能性提供了研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。