費(fèi)永濤，黃一鶴，黃 力，劉功良,*，白衛(wèi)東

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；3.廣東省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，廣東 廣州 510240）

隨著消費(fèi)者對(duì)功能性食品興趣的日益濃厚，對(duì)功能性豆制品的發(fā)展提出了更高要求。發(fā)酵豆乳是益生菌利用豆乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，對(duì)豆乳中營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而制成的大豆飲品[1-2]。有研究表明，豆乳經(jīng)發(fā)酵后，營(yíng)養(yǎng)成分、大豆低聚糖消化率、風(fēng)味及穩(wěn)定性提高，并能改善人體腸道微生物組成，促進(jìn)人體健康[3]。近年來(lái)，益生菌對(duì)豆乳的發(fā)酵及益生作用已成為研究熱點(diǎn)之一[4-5]。

豆乳既可以給乳酸菌提供合適的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件，也可作為載體保護(hù)益生菌，提高其在胃腸道中的存活率[6]。乳酸菌發(fā)酵豆乳過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量乳酸和乙酸，降低發(fā)酵豆乳的pH值，將蛋白質(zhì)和降解后的氨基酸、肽類物質(zhì)沉淀，形成具有彈性的凝乳，從而使人體胃腸道更易吸收[7]；發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多種生物活性酶，如蛋白酶、糖苷酶和脂肪酶等，有助于將不利于人體吸收的大分子物質(zhì)分解成小分子，避免人體無(wú)法消化從而產(chǎn)生胃脹[8]。發(fā)酵豆乳中未被利用的大豆低聚糖水蘇糖和棉子糖，能作為益生元，選擇性富集腸道有益菌群[9]；結(jié)腸內(nèi)未消化的碳水化合物經(jīng)腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs），可向結(jié)腸上皮提供能量，調(diào)節(jié)膽固醇和脂質(zhì)代謝，抑制腸道致病菌，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[10-12]。

目前我國(guó)的豆乳發(fā)酵劑選擇面較窄，一般使用的牛乳發(fā)酵劑在豆乳環(huán)境中適應(yīng)性差，營(yíng)養(yǎng)利用率低，缺乏自研豆乳發(fā)酵劑[13-14]。在本課題前期研究中，從豆制品加工副產(chǎn)物豆腐酸漿水中分離得到的解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）L6，具有開發(fā)成為益生菌并作為豆乳發(fā)酵劑的潛力[15-18]。首先，L.amylolyticusL6不具有耐藥性，不會(huì)分泌有毒代謝產(chǎn)物，安全性較好，并在豆制品環(huán)境如豆腐黃漿水中具有優(yōu)良的發(fā)酵特性[16]。其次，該菌在人工合成胃液中具有較高的存活率，并能夠抑制致病菌、分泌細(xì)菌素、黏附CaCO2細(xì)胞，具有良好益生功能特性[17]。在基因水平和轉(zhuǎn)錄水平對(duì)該菌在豆乳中的適應(yīng)性機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌具有α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的編碼基因并且在豆乳環(huán)境中進(jìn)行高效表達(dá)，幫助L.amylolyticusL6利用大豆低聚糖，轉(zhuǎn)化大豆異黃酮，達(dá)到降低“脹氣”反應(yīng)，提高生物活性的效果[17-19]。雖然L.amylolyticusL6是良好的豆乳益生菌發(fā)酵劑，但是該菌制備的發(fā)酵豆乳對(duì)人體腸道菌群的影響仍未知，因此本研究通過(guò)發(fā)酵豆乳攜帶的L.amylolyticusL6在模擬胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)中的存活率，確定L.amylolyticusL6在胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)中的存活狀態(tài)，將模擬消化后的發(fā)酵豆乳進(jìn)行體外結(jié)腸發(fā)酵，觀察發(fā)酵豆乳對(duì)腸道菌群以及SCFAs含量的影響，探究L.amylolyticusL6發(fā)酵豆乳的腸道益生功效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆購(gòu)自德州市綠色食品有限公司陽(yáng)光豆坊。L.amylolyticusL6分離自豆腐酸漿水，現(xiàn)保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保存編號(hào)為CGMCC NO.9090。

MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乳酸、乙酸、丙酸、異丙酸、丁酸、異丁酸（均為色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；豬胃蛋白酶（1∶10 000）、豬胰蛋白酶（1∶250）、α-淀粉酶（≥5 U/mg）、脂肪酶（30 000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 北京蘭杰柯科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 艾基生物技術(shù)有限公司；5 U/μL LATaq、12 U限制性內(nèi)切酶HaeIII、2×SYBR Green PCR Master Mix 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；7900 HT實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀、3100毛細(xì)管電泳自動(dòng)序列分析儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵豆乳的制備

配制MRS液體培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，取保存于-80 ℃冰箱中的L.amylolyticusL6菌液，以5%接種量活化，至試管底部出現(xiàn)大量沉淀。取活化后的菌液以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次待用，重懸調(diào)整菌液濃度到108CFU/mL。

發(fā)酵豆乳的制備方法參考已報(bào)道文獻(xiàn)[14]，首先用0.5% NaHCO3溶液浸泡大豆14 h，倒去浸泡水后，按照1∶8（m/m）將大豆與飲用水混合，加入豆?jié){機(jī)打漿制備粗豆乳。使用100 目篩過(guò)濾豆渣，豆?jié){與飲用水以8∶2（V/V）混合，加入1.5 g/100 mL葡萄糖，于85 ℃加熱15 min，冷卻至37 ℃。以10 g/100 mL接種量接種生理鹽水重懸后的菌液，于37 ℃發(fā)酵10 h。

1.3.2 胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性

1.3.2.1 模擬胃腸液的制備

根據(jù)Wang Jie等[20]的方法稍作修改，制備模擬胃液與模擬腸液。調(diào)節(jié)PBS的pH值至2.5、3.0和8.0，隨后以0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。向pH 2.5和pH 3.0的PBS中添加3 g/L胃蛋白酶和2 g/L NaCl，以制備模擬胃液。向pH 8.0 PBS中添加1 g/L胰蛋白酶制備模擬腸液。

1.3.2.2L.amylolyticusL6菌液及其發(fā)酵豆乳的胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性

參考前期研究報(bào)道[17]，將L.amylolyticusL6接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，使用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次。將1 mL菌液接種至9 mL模擬胃液中（pH 2.5和pH 3.0），37 ℃處理3 h，每小時(shí)取樣，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定以生理鹽水為載體時(shí)L.amylolyticusL6菌株在模擬胃液（pH 2.5和pH 3.0）中的耐受性。樣品在模擬腸液中耐受性的測(cè)定，首先將樣品在pH 3.0胃液中處理3 h后，取1 mL混合液加入到9 mL模擬腸液（pH 8.0）中，37 ℃放置8 h，于4 h和8 h通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)并計(jì)算存活率，得出以生理鹽水為載體時(shí)L.amylolyticusL6的模擬胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性。同時(shí)以L.amylolyticusL6發(fā)酵豆乳樣品作為對(duì)照，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，存活率計(jì)算公式如下：

式中：N1為處理后的L.amylolyticusL6菌落數(shù)；N0為處理前的L.amylolyticusL6菌落數(shù)。

1.3.2.3L.amylolyticusL6菌液及其發(fā)酵豆乳對(duì)膽鹽的耐受性

在MRS肉湯中加入0.3 g/100 mL膽鹽，將發(fā)酵豆乳和生理鹽水清洗并重懸過(guò)的菌液接種到含有膽鹽的MRS培養(yǎng)基中（10 g/100 mL接種量），在37 ℃下孵育4 h，每隔1 h取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，平行3 次。

1.3.3 發(fā)酵豆乳體外模擬消化實(shí)驗(yàn)

參考Bresciani等[21]方法，主要包括樣品的模擬口腔及胃腸消化、糞便菌群的體外發(fā)酵、腸道菌群分析及SCFAs測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4 組實(shí)驗(yàn)，分別是以生理鹽水為樣品的空白對(duì)照組（BCG）、以L.amylolyticusL6菌懸液為樣品的對(duì)照組1（CG1）、以滅活發(fā)酵豆乳為樣品的對(duì)照組2（CG2）和以活性發(fā)酵豆乳為樣品的實(shí)驗(yàn)組（EG）。

1.3.3.1 試液的制備

模擬唾液：0.11 g/L CaCl2、1.3 g/Lα-淀粉酶溶于無(wú)菌去離子水中，調(diào)節(jié)pH 7.0。

人體糞便菌液：收集4 名志愿者（年齡20～25 歲，男女各2 名，飲食正常，近3 個(gè)月未服用抗生素及無(wú)消化道疾?。┑男迈r糞便。搜集1 名志愿者糞便后，立即于超凈臺(tái)取20 g糞便于厭氧盒中，更換厭氧包及指示劑，將厭氧盒至于4 ℃冰箱，重復(fù)此操作，直至取完所有志愿者糞便。實(shí)驗(yàn)前，從厭氧盒中取50 g糞便混合物于燒杯中，加入500 mL PBS、刃天青0.5 mg，攪拌均勻，然后通過(guò)已滅菌的紗布過(guò)濾去除大顆粒物后轉(zhuǎn)移至滅菌藍(lán)蓋瓶中，置于厭氧操作箱內(nèi)，并于1 h內(nèi)使用。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，酵母提取物2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，K2HPO40.04 g/L，KH2PO40.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，CaCl2·6H2O 0.01 g/L，NaHCO32 g/L，血紅素0.02 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，膽汁鹽0.5 g/L，刃天青1 mg/L，吐溫80 2 mL/L，VK110 μL/L，121 ℃滅菌20 min。

1.3.3.2 體外消化及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

模擬口腔階段，取13.6 mL發(fā)酵豆乳樣品與1.4 mL模擬唾液混合，調(diào)節(jié)pH 6.8，37 ℃、100 r/min振蕩5 min，平行若干管，以作pH值調(diào)整測(cè)試及樣品貯存之用；模擬胃階段，經(jīng)口腔階段消化后，消化液與模擬胃液等體積混合。使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，37 ℃、100 r/min振蕩2 h。模擬小腸階段，經(jīng)過(guò)模擬胃階段的消化后，取30 mL消化液，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。然后加入4 mL膽鹽溶液和1 mL CaCl2溶液，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，再加入2.5 mL脂肪酶懸浮液。37 ℃、100 r/min振蕩2 h。

體外發(fā)酵階段，在無(wú)氧環(huán)境下于厭氧管內(nèi)分裝生長(zhǎng)培養(yǎng)基及消化樣品（1.5 mL糞便菌液＋6.5 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基＋2 mL樣品消化液），發(fā)酵0、6、12、24、48 h后分別取樣，取樣后將樣品管立即插入冰中，10 000 r/min、4 ℃離心10 min。離心完畢后上清液轉(zhuǎn)移用于測(cè)定pH值和SCFAs含量，放-20 ℃冰箱備用，將底部菌渣放-80 ℃冰箱備用。

1.3.4 腸道細(xì)菌多樣性分析

從保存的樣品中提取基因組DNA，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增1 6 S r D N A 的V 3 ～V 4 區(qū)。引物序列為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物（即擴(kuò)增子）連接測(cè)序接頭，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，Illumina上機(jī)測(cè)序。

1.3.5 SCFAs含量的測(cè)定

S C FA s（乙酸、丙酸、異丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸）的測(cè)定參考安捷倫官網(wǎng)方法，樣液使用0.22 μm膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶待用。儀器參數(shù)及規(guī)格如下：7890B氣相色譜系統(tǒng)：色譜柱WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氮?dú)?，恒流模式；進(jìn)樣口250 ℃，分流比30∶1；柱溫箱162 ℃恒溫；氫火焰離子化檢測(cè)器溫度250 ℃，氫氣流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min，尾吹氣流速25 mL/min；進(jìn)樣量0.1 μL。乳酸的測(cè)定使用南京建成公司的乳酸測(cè)試盒（A019-2-1）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均3 次重復(fù)，使用SPSS（V23.0.0）進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. amylolyticus L6的模擬胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)耐受性

2.1.1L.amylolyticusL6對(duì)模擬胃液的耐受性

分別以生理鹽水和發(fā)酵豆乳作為載體，測(cè)定L.amylolyticusL6在pH 2.5和pH 3.0模擬胃液中的存活率，結(jié)果見表1。在pH 3.0模擬胃液中，L.amylolyticusL6在2 種載體中存活率均大于90%，但在pH 2.5模擬胃液中，發(fā)酵豆乳中L.amylolyticusL6在4 h后存活率為96.1%，但生理鹽水中的L.amylolyticusL6在3 h后已無(wú)法檢測(cè)出活菌，可見L.amylolyticusL6以發(fā)酵豆乳為載體可提高該菌在模擬胃液中的存活率，類似的現(xiàn)象也發(fā)生在干酪乳桿菌Zhang中，該菌以生理鹽水為載體時(shí)，在pH 2.5的模擬胃液處理3 h后保持有70%存活率，若以發(fā)酵馬乳、發(fā)酵豆乳和發(fā)酵牛乳為載體，則存活率均超過(guò)90%[20,22]。L.amylolyticusL6菌體對(duì)模擬胃液的耐受性不及干酪乳桿菌Zhang，但若以發(fā)酵豆乳作為載體，在pH 2.5模擬胃液中的耐受性與干酪乳桿菌Zhang相仿[20]。益生菌通常以食物為載體進(jìn)入人體胃腸道，發(fā)酵豆乳可給L.amylolyticusL6提供緩沖環(huán)境保護(hù)菌體，主要由于外發(fā)酵豆乳可提高胃內(nèi)容物的pH值[6]，并且發(fā)酵豆乳中的蛋白質(zhì)及氨基酸可作為人體腸道內(nèi)消化蛋白酶的緩沖劑和抑制劑[23]，從而在上消化道運(yùn)輸過(guò)程中保護(hù)攝入的L.amylolyticusL6，提高其存活率。

表1 L. amylolyticus L6對(duì)模擬胃液的耐受性Table 1 Tolerance of L. amylolyticus L6 to simulated gastric juice

2.1.2L.amylolyticusL6對(duì)模擬腸液的耐受性

發(fā)酵豆乳中的L.amylolyticusL6首先在pH 3.0模擬胃液消化3 h后，然后再接入模擬腸液消化8 h，其存活率均大于97%，相較于生理鹽水作為載體，發(fā)酵豆乳中的L.amylolyticusL6存活率提高了7.89%（表2）。同時(shí)，發(fā)酵豆乳中L.amylolyticusL6在pH 2.5模擬胃液消化3 h后，接入模擬腸液消化8 h前存活率為95.59%（表2）。可知，發(fā)酵豆乳中的L.amylolyticusL6在模擬腸液中有良好的耐受性，這一特性有利于L.amylolyticusL6長(zhǎng)期地在腸道內(nèi)定植[24]。

表2 L. amylolyticus L6對(duì)模擬腸液的耐受性Table 2 Tolerance of L. amylolyticus L6 to simulated intestinal juice

2.1.3L.amylolyticusL6對(duì)0.3 g/100 mL膽鹽培養(yǎng)基的耐受性

在0.3 g/100 mL膽鹽處理4 h后，2 種載體中的L.amylolyticusL6存活率均大于72%（表3）。正常人體小腸的膽鹽范圍為0.03～0.3 g/100 mL[25]，L.amylolyticusL6理論上可耐受小腸中的高膽鹽環(huán)境，順利進(jìn)入大腸。綜上可知，以發(fā)酵豆乳作為載體，可提高L.amylolyticusL6在模擬胃腸道中的存活率，從而增加其進(jìn)入大腸并定植的幾率。

表3 L. amylolyticus L6對(duì)0.3 g/100 mL膽鹽培養(yǎng)基的耐受性Table 3 Tolerance of L. amylolyticus L6 to 0.3 g/100 mL bile salt medium

2.2 體外發(fā)酵過(guò)程中腸道菌群的變化

通常人體的消化道由口腔、食道、胃、小腸和大腸構(gòu)成，本研究首先分別對(duì)空白對(duì)照組（生理鹽水，BCG）、對(duì)照組1（L.amylolyticusL6菌懸液，CG1）、對(duì)照組2（滅活L.amylolyticusL6發(fā)酵豆乳，CG2）及實(shí)驗(yàn)組（L.amylolyticusL6發(fā)酵豆乳，EG）4 個(gè)組別的樣品進(jìn)行體外消化（包括模擬口腔、胃、小腸），隨即將消化液加入體外結(jié)腸發(fā)酵48 h，于12、24、48 h取樣，通過(guò)16S rDNA V3～V5區(qū)高通量測(cè)序分析腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成的變化。如圖1所示，在門水平上，腸道菌群主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，這與已有的報(bào)道類似[26-27]。相比BCG和CG1組，添加發(fā)酵豆乳的CG2和EG組在體外發(fā)酵48 h后，變形菌門細(xì)菌相對(duì)豐度顯著提高（P＜0.05），其次梭桿菌門相對(duì)豐度亦稍有提高，其余厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門細(xì)菌相對(duì)豐度均有不同程度的下降。

圖1 體外發(fā)酵后腸道菌群的門水平物種組成豐度熱圖Fig.1 Heatmap of species composition and abundance of intestinal flora at the phylum level after in vitro fermentation

埃希氏菌屬（E s c h e r i c h i a）中的大腸桿菌（Escherichia coli），為腸道內(nèi)常見優(yōu)勢(shì)菌屬之一[26]，在體外發(fā)酵48 h后，相比于BCG及CG1組，CG2和EG組中埃希氏菌屬相對(duì)豐度顯著增加（圖2），分別達(dá)到79.52%和80.31%，主要是由于發(fā)酵豆乳中有較多的碳源存在（尤其是葡萄糖），被作為優(yōu)勢(shì)菌屬的埃希氏菌屬快速代謝利用，大量繁殖，導(dǎo)致CG2和EG組中埃希氏菌屬相對(duì)豐度高于BCG和CG1組。此外，EG組3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)乳桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度都顯著高于BCG和CG2組（P＜0.05），CG1組直接添加菌懸液雖然在體外發(fā)酵12 h相對(duì)豐度（27.94%）遠(yuǎn)高于EG組，但是24 h和48 h后其相對(duì)豐度迅速下降到10%以下，低于EG組14.32%和13.86%，主要是由于發(fā)酵豆乳中既有益生乳酸菌L.amylolyticusL6也有益生元即棉子糖和水蘇糖，選擇性地為益生菌后期繁殖提供碳源。大量體內(nèi)和體外研究也發(fā)現(xiàn)，攝入發(fā)酵乳品包括酸牛乳、酸豆乳等，能夠顯著提高腸道菌群中乳酸桿菌屬的豐度，改善腸道菌群[28-29]。本研究還發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵豆乳的EG和CG2組中，多種有害細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度下降，包括Lachnoclostridium、假單胞菌屬（Prseudomonas）、嗜膽菌屬（Bilophia）、Erysipelatoclostridium、史雷克氏菌屬（Slackia）、科林氏菌屬（Collinsella）和多爾氏菌屬（Dorea），它們是人體胃腸道中常見的與疾病相關(guān)聯(lián)的菌屬，可能由于腸道較低的pH值有助于抑制有害細(xì)菌活性，維持腸道健康（圖3）[11]。史雷克氏菌屬和假單胞菌屬是常見的人體腸道微生物，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能引起食物中毒、器官感染等一系列的人體疾病[30-31]。腸易激綜合征是一種常見的胃腸道疾病，常見癥狀有腹痛、腹脹和腹瀉，已有多項(xiàng)研究表明該疾病與多爾氏菌屬種群在腸道內(nèi)增加相關(guān)[32]。嗜膽菌屬中的沃氏嗜膽菌（Bilophila wadsworthia）具有較強(qiáng)的嗜膽鹽特性，能在人體腸道內(nèi)定植，是人體腸道內(nèi)的常見致病菌之一，已被報(bào)道與闌尾炎及其他局部炎癥以及大腸癌相關(guān)[33]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Lachnoclostridium在人體腸道內(nèi)豐度提高，與結(jié)直腸腺瘤和結(jié)腸癌直接相關(guān)[34]。綜上可知，相比于直接攝入L.amylolyticusL6，通過(guò)豆乳作為載體攜帶L.amylolyticusL6進(jìn)入腸道，能有效提高乳桿菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)降低腸道有害細(xì)菌的豐度，防止病原菌的定植，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖2 體外發(fā)酵后腸道菌群的屬水平物種組成豐度熱圖Fig.2 Heatmap of species composition and abundance of intestinal flora at the genus level after in vitro fermentation

圖3 體外發(fā)酵過(guò)程中不同組別的pH值變化Fig.3 pH changes of different groups during in vitro fermentation

2.3 體外發(fā)酵過(guò)程中SCFAs變化及其與菌群的相關(guān)性分析

由圖3 可知，經(jīng)體外發(fā)酵后，相較于B C G 和CG1組，添加發(fā)酵豆乳的EG和CG2組pH值下降顯著（P＜0.05），研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸環(huán)境pH值的降低能提高鈣、鎂離子的生物利用度并抑制致病菌[35]，腸道菌群變化的結(jié)果也證實(shí)EG和CG2組相較于BCG和CG1組，致病菌屬的相對(duì)豐度較低。由圖4可知，4 組樣品中，添加帶有L.amylolyticusL6活菌的發(fā)酵豆乳EG組，在體外發(fā)酵48 h后產(chǎn)生的SCFAs質(zhì)量濃度最高，達(dá)到2.4 g/L，其次是添加滅活發(fā)酵豆乳CG2組，達(dá)到1.75 g/L，BCG及CG1組均不超過(guò)0.75 g/L。可知，攝入發(fā)酵豆乳可顯著提升SCFAs含量從而降低結(jié)腸環(huán)境的pH值，抑制致病菌，SCFAs還可調(diào)節(jié)膽固醇和脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[36]。在Ahlborn等[37]的報(bào)道中，研究了牛乳和羊乳對(duì)嬰兒糞便的體外發(fā)酵影響，發(fā)現(xiàn)它們均有助于SCFAs的生成。在本研究中，相比于滅活后的發(fā)酵豆乳，攝入攜帶有L.amylolyticusL6活菌的發(fā)酵豆乳，SCFAs含量提高了37%，L.amylolyticusL6活菌與發(fā)酵豆乳的協(xié)同作用能提高發(fā)酵豆乳的益生功效。

圖4 體外發(fā)酵過(guò)程中不同組別的SCFAs變化Fig.4 Changes in total SCFAs content in different groups during in vitro fermentation

不同組別體外發(fā)酵過(guò)程中各種SCFAs含量變化見表4。BCG和CG1組的乳酸含量一直處于較低的水平，而CG2和EG組經(jīng)體外發(fā)酵24 h后，乳酸含量顯著提高（P＜0.05），但在48 h后乳酸含量顯著下降（P＜0.05）。體外發(fā)酵48 h后，EG組的乙酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)到0.95 g/L，其次是CG2組達(dá)到0.81 g/L，BCG和CG1組均不超過(guò)0.27 g/L。乳酸和乙酸被認(rèn)為是益生菌發(fā)酵后的產(chǎn)物，然而乳酸會(huì)被不同的菌屬轉(zhuǎn)化為其他SCFAs，這可能是發(fā)酵過(guò)程中乳酸下降的原因[38]。隨著體外發(fā)酵的進(jìn)行，丙酸的上升趨勢(shì)與乙酸類似，48 h后EG組的丙酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)到0.82 g/L，其次是CG2組達(dá)到0.71 g/L，BCG和CG1組均不超過(guò)0.23 g/L。丙酸經(jīng)腸道細(xì)菌產(chǎn)生后，可被人體吸收進(jìn)入血液隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，并能控制血糖并對(duì)肝癌細(xì)胞有抗增殖作用[10,39]。4 組實(shí)驗(yàn)中，異丁酸含量均處于低水平，體外發(fā)酵48 h后，EG組的丁酸質(zhì)量濃度亦為最高，達(dá)到0.30 g/L，其次是CG2組0.27 g/L，BCG和CG組均不超過(guò)0.21 g/L。丁酸鹽既可以由腸道細(xì)菌代謝未消化的碳水化合物產(chǎn)生，也可通過(guò)對(duì)乙酸及乳酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生[40]，丁酸鹽與結(jié)腸細(xì)胞的抗炎和抗腫瘤作用相關(guān)[41]。在4 組樣品中，僅檢測(cè)出較低含量的異戊酸，戊酸僅在EG組中檢測(cè)出。綜上，發(fā)酵豆乳作為能源物質(zhì)可增加結(jié)腸內(nèi)的SCFAs水平，L.amylolyticusL6活菌與發(fā)酵豆乳的協(xié)同作用能提高體外發(fā)酵后的SCFAs含量。這可能是由于L.amylolyticusL6活菌可在體外發(fā)酵過(guò)程中利用發(fā)酵豆乳中剩余的碳源，無(wú)氧環(huán)境下產(chǎn)生乳酸，乳酸經(jīng)其他腸道微生物轉(zhuǎn)化為各種SCFAs，從而提高了體外發(fā)酵過(guò)程中SCFAs的含量并降低pH值。在Lactobacillus caseiZhang的研究中，給不同年齡的24 位志愿者連續(xù)服用28 d該益生菌片劑，檢測(cè)糞便樣品中的微生物群落與SCFAs，發(fā)現(xiàn)SCFAs的代謝水平與該菌的存活率相關(guān)[42-43]。

表4 體外發(fā)酵過(guò)程中不同SCFAs含量的變化Table 4 Changes in contents of individual SCFAs in different groups during in vitro fermentation

EG體外發(fā)酵過(guò)程中，菌群和SCFAs的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、嗜膽菌屬、多爾氏菌屬和考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）與檢測(cè)到的4 種主要SCFAs丙酸、異丙酸、丁酸和異丁酸呈顯著正相關(guān)（圖5），前期研究報(bào)道也顯示雙歧桿菌和多爾氏菌屬能利用腸道環(huán)境中的多糖轉(zhuǎn)化為SCFAs[44-45]，同時(shí)考拉桿菌屬能夠利用腸道中的琥珀酸產(chǎn)生丙酸[46]，但是嗜膽菌屬能與高脂肪飲食協(xié)同促進(jìn)更高炎癥反應(yīng)、腸屏障功能障礙和膽汁酸代謝異常[47]，未發(fā)現(xiàn)與SCFAs產(chǎn)生相關(guān)的報(bào)道。與4 種主要SCFAs含量呈負(fù)相關(guān)的菌屬包括擬桿菌屬（Bacteroides）、腸球菌屬（Enterococcus）、鏈球菌屬（S t r e p t o c o c c u s） 和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。

圖5 EG樣品體外發(fā)酵過(guò)程中菌群和主要SCFAs的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between intestinal microbiota and major SCFAs during in vitro fermentation

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)以L.amylolyticusL6發(fā)酵豆乳為載體，在低pH值模擬胃液、模擬腸液以及高膽鹽環(huán)境中菌體均保持高存活率，隨后對(duì)其進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)加入經(jīng)模擬消化后的發(fā)酵豆乳體外發(fā)酵48 h后，多種有害腸道菌屬豐度下降，同時(shí)體外發(fā)酵過(guò)程中SCFAs含量也有顯著提高，并且攜帶L.amylolyticusL6活菌的發(fā)酵豆乳相較于滅活后的發(fā)酵豆乳，體外發(fā)酵48 h后SCFAs含量提高37%，L.amylolyticusL6與發(fā)酵豆乳的協(xié)同作用有利于提高發(fā)酵豆乳的益生功效，后續(xù)將開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定酸豆奶對(duì)腸道菌群的改善作用。