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超聲輔助法提取當(dāng)歸總黃酮工藝優(yōu)化研究*

2023-10-21 08:24:10汪本宗彭文彬鄭秀文周雪韋趙啟宇宋俊梅
云南化工 2023年10期
關(guān)鍵詞:蘆丁黃酮乙醇

汪 凡,張 旭,汪本宗,彭文彬,鄭秀文,周雪韋,趙啟宇,宋俊梅

(巢湖學(xué)院,安徽 合肥 238024)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根。秋末收獲,除去泥沙和須根,只保留主根;待水分稍微蒸發(fā),包扎成小捆,上棚,用煙火慢慢烘干,再切薄片[1]。當(dāng)歸又名秦歸、馬尾歸、馬尾當(dāng)歸等,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中,主要產(chǎn)自于我國云南、甘肅等地。其味甘、辛而溫,中醫(yī)認(rèn)為歸心、肝、脾經(jīng),具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血止痛、潤(rùn)腸通便的功效[2-3]。所謂“十方九歸”,可見當(dāng)歸在中醫(yī)組方中的重要地位,故有“藥王”之稱。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸還具有抗氧化、抗腫瘤、消炎、平喘、抗抑郁等功能,在婦科疾病中也有廣泛的應(yīng)用[4]。

黃酮是當(dāng)歸的重要成分之一。黃酮類化合物是一類多酚類天然產(chǎn)物,常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在于幾乎所有綠色植物中。黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性,分布廣泛,種類繁多,且多數(shù)化合物容易以結(jié)晶形式獲得[5-8]。當(dāng)歸總黃酮經(jīng)分離純化后可分為木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷和木犀草素-7-O-蘆丁糖苷兩類[9]。當(dāng)歸作為一種良好的中藥抑菌劑,其總黃酮對(duì)于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌具有一定的抑制作用;還能夠調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng),促進(jìn)胰島B細(xì)胞的恢復(fù),降低血糖和膽固醇。因此對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有一定治療作用,也降低輻射對(duì)DNA的損傷[10]。

目前總黃酮的提取方法主要有超聲提取法、加熱回流法、超聲復(fù)合酶法等,超聲輔助浸取便是利用超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等增加溶劑的穿透力,可使物料中的有效成分加速溶出,大大減少提取時(shí)間,提高提取效率[11]。因此,本實(shí)驗(yàn)以干燥當(dāng)歸切片為原料,采用超聲提取法探討當(dāng)歸總黃酮提取工藝,通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)考查乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率、物料比對(duì)當(dāng)歸總黃酮含量的影響,以期為提高當(dāng)歸總黃酮類化合物的提取效率提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

當(dāng)歸,產(chǎn)地為甘肅定西;醫(yī)用酒精(C2H5OH),95%,河北瑞康醫(yī)藥科技有限公司;亞硝酸鈉(NaNO2),分析純,天津市天茂化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉(NaOH),分析純,西隴化工股份有限公司;硝酸鋁[Al(NO3)3·9H2O],分析純,天津市天茂化學(xué)試劑廠。

電子天平(FA1004N),上海箐海儀器有限公司;新型密封型搖擺式高速粉碎機(jī)(100克),雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司;數(shù)控超聲清洗儀(500W)(JK-500DB),合肥金尼克機(jī)械制造有限公司;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-ΙΙΙ),河南省予華儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(41K30RA-C),鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV-5100B),上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配置成 0.4 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用吸量管準(zhǔn)確量取0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0 mL 置于試管中,后分別加入 1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置 6 min;再吸取 1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液,搖勻后靜置 6 min;最后加入 10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液;再加入60%的乙醇溶液稀釋至 25 mL,搖勻靜置 10 min;在 510 nm 的條件下分別測(cè)定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程Y=0.5224X-0.0813 (r=0.9995)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 當(dāng)歸總黃酮提取及含量測(cè)定

稱取 4 g 當(dāng)歸,進(jìn)行超聲提取,過濾,取濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到蒸發(fā)液。用乙醇溶液定容至50 mL得到總黃酮提取液。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法,在 510 nm 條件下測(cè)定其吸光度,平行3次。利用(1)式計(jì)算當(dāng)歸總黃酮的提取率:

(1)

式中:m1為試樣的測(cè)定質(zhì)量,mg;D為稀釋倍數(shù);m0為稱量的當(dāng)歸質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1)乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%,超聲時(shí)間 30 min,超聲功率40%,物料比 1∶10 g/mL。

2)超聲時(shí)間的選擇

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間 30 min,超聲功率40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,物料比1∶10。

3)超聲功率的選擇

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,超聲功率80%,物料比 1∶10 g/mL。

4)物料比的選擇

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲時(shí)間 20 min,超聲功率80%,物料比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)而設(shè)計(jì)正交表,進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用正交實(shí)驗(yàn)法在四因素三水平上對(duì)當(dāng)歸總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)篩選的最佳提取工藝組合進(jìn)行驗(yàn)證,按最佳組合條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并與先前各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比,以驗(yàn)證最佳提取工藝的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖2可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,當(dāng)歸總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在乙醇體積分?jǐn)?shù)處于30%~60%時(shí),當(dāng)歸總黃酮提取量呈上升趨勢(shì),在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),提取量達(dá)到最大值;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大,可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí),增大了脂溶性物質(zhì)浸出增加,雜質(zhì)增加,從而當(dāng)歸總黃酮的提取量減少[12]。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)當(dāng)歸總黃酮的影響

2.1.2 超聲功率

由圖3可知,隨著超聲功率的增加,當(dāng)歸總黃酮的提取量先增加后減少。在40%~80%范圍內(nèi),當(dāng)歸總黃酮提取量隨超聲功率增加而增加;超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)使細(xì)胞破裂程度增加,當(dāng)歸總黃酮的浸出率增大。而超過80%時(shí),對(duì)細(xì)胞的破壞達(dá)到最大,使大量雜質(zhì)開始溶出,且對(duì)黃酮類化合物產(chǎn)生一定破壞,從而使當(dāng)歸總黃酮提取量下降[13]。因此選擇超聲功率70%、80%、90%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 超聲功率對(duì)當(dāng)歸總黃酮的影響

2.1.3 超聲時(shí)間

由圖4可知,在10~20 min 范圍內(nèi),超聲波對(duì)細(xì)胞有一定破壞作用。隨著時(shí)間的增加,細(xì)胞破裂更充分,有利于黃酮類化合物的浸出。而超過 20 min 以后,雜質(zhì)的浸出量增加,過長(zhǎng)的超聲時(shí)間,也對(duì)當(dāng)歸總黃酮產(chǎn)生一定破壞,使得總黃酮的提取量下降[14]。因此選擇超聲時(shí)間 10、20、30 min 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)當(dāng)歸總黃酮的影響

2.1.4 物料比

由圖5可知。隨著物料比的增大,當(dāng)歸總黃酮提取量基本呈先上升后下降再緩步上升的過程。當(dāng)物料比在1∶5~1∶15 g/mL 范圍內(nèi),隨著浸取液增加,溶出的黃酮類化合物含量增加。超過 1∶15 g/mL 時(shí),其他雜質(zhì)的溶出量增加,改變浸取液理化性質(zhì),使當(dāng)歸總黃酮的浸出量減少[15];故在物料比為 1∶15 g/mL 時(shí)當(dāng)歸總黃酮提取量最大。因此選擇物料比1∶10、1∶15、1∶20 g/mL 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 物料比對(duì)當(dāng)歸總黃酮的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

為優(yōu)選當(dāng)歸總黃酮超聲提取工藝,根據(jù)單因素考察結(jié)果和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法原則,按照L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。根據(jù)正交分析圖中,從影響因素乙醇濃度來看,三個(gè)水平中均值一最高,表明乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取率最大;從影響因素超聲功率來看,三個(gè)水平中均值三最高,表明超聲功率為90%時(shí)提取效率最大;從影響因素超聲時(shí)間來看,三個(gè)水平中均值一最高,表明超聲時(shí)間 10 min 時(shí)提取效率最大;從影響因素料液比來看,三個(gè)水平中均值三最高,表明料液比為 1∶20 g/mL 時(shí)提取效率最大,綜上所述較優(yōu)提取工藝為應(yīng)選擇A2B3C1D3的條件即超聲功率90%、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間 10 min、料液比 1∶20 g/mL。由極差分析可知,超聲功率對(duì)當(dāng)歸總黃酮的影響較大,各因素的主次順序?yàn)锽(超聲功率)﹥A(乙醇體積分?jǐn)?shù))﹥C(超聲時(shí)間)﹥D(料液比)。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可行性與穩(wěn)定性,以正交實(shí)驗(yàn)所得超聲功率90%、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間 10 min、物料比 1∶20 g/mL 進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),三次平行實(shí)驗(yàn)如表3,得到當(dāng)歸中提取總黃酮的含量均值為4.9018(mg/g)。并與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比分析,因此確認(rèn)該設(shè)計(jì)方法得到的當(dāng)歸總黃酮的提取條件合理有效。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取當(dāng)歸總黃酮,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法檢驗(yàn)總黃酮的提取量,利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在對(duì)乙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間、物料比4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到影響當(dāng)歸總黃酮提取量大小的因素為:超聲功率﹥乙醇濃度﹥超聲時(shí)間﹥料液比,最佳的提取方案為A2B3C1D3,即超聲功率90%(450 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時(shí)間 10 min、料液比 1∶20 g/mL,并通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到在此條件下當(dāng)歸總黃酮的提取量為4.9018(mg/g)。

在大健康產(chǎn)業(yè)背景下,國家越來越重視藥食兩用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,2019年新增當(dāng)歸為藥食兩用物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法,優(yōu)化當(dāng)歸總黃酮提取工藝,旨為進(jìn)一步開發(fā)和利用當(dāng)歸總黃酮提供理論依據(jù);同時(shí),有利于促進(jìn)中國傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化。

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