李俊花 劉 浩 張海平 趙曉軍 曾 皓 錢發(fā)聰 鄧 綱

（1 云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，昆明 650504；2 云南省煙草公司昆明市公司，昆明 650051）

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年由于病蟲害的發(fā)生導(dǎo)致糧食減產(chǎn)24%，其中有10%的減產(chǎn)是由蟲害導(dǎo)致的[1]。董大志等[2]在2010-2011 年期間開展云南煙草害蟲調(diào)查，發(fā)現(xiàn)云南煙草害蟲有96 種，主要害蟲優(yōu)勢種有小地老虎、銅綠麗金龜?shù)?。長時(shí)間以來，受數(shù)量效益型經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式的影響，化學(xué)方法仍是煙草病蟲害防治的主要方法，而長期使用化學(xué)防治導(dǎo)致的煙葉農(nóng)藥殘留、蟲害抗藥性增加以及生態(tài)環(huán)境問題日益突出[3-4]。為了減少農(nóng)藥的使用量，維持生物多樣性，很多煙草科技工作者意識(shí)到在煙草上從事生物防治的重要性[5]。而隨著對(duì)食品安全和環(huán)境保護(hù)的重視，越來越多的高效低毒生物類殺卵劑被廣泛應(yīng)用，如苦參堿·印楝素、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）等[6]。這類生物源農(nóng)藥的作用機(jī)制機(jī)理不同于一般普通的化學(xué)類農(nóng)藥，比如生物源農(nóng)藥不易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性[7-8]，對(duì)農(nóng)作物安全且無殘留物危害，而且有的生物源農(nóng)藥有利于作物生長，如印楝素乳油和蘇云金桿菌乳劑對(duì)有機(jī)水稻有顯著的增產(chǎn)效果[9]。生防細(xì)菌具有直接獲取、定殖快速、適應(yīng)力強(qiáng)、效果穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在防治植物細(xì)菌性或真菌性的病害中廣泛利用[10]。近年研究已發(fā)現(xiàn)一些用于防治蟲害和促生長的生防細(xì)菌，如綠僵菌不僅可以防治蟲害，同時(shí)其能夠在植物根際和根內(nèi)宿存，促進(jìn)植物生長[11-13]；貪噬菌屬（Variovorax）可以通過與根際環(huán)境互作維持根系正常發(fā)育[14]。

基于煙草對(duì)農(nóng)藥殘留、高品質(zhì)以及生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求，本文設(shè)置不同生物菌劑處理對(duì)煙草蟲害防控和煙草生長的影響進(jìn)行研究，以期獲得一種具有防蟲和促生長雙重效果的生物菌處理，并得到該處理下的農(nóng)藝和生理指標(biāo)變化規(guī)律，為未來煙草高效蟲害綠色防控提供新的技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種供試煙草品種為云煙87。田間試驗(yàn)的種子、煙苗均由云南省昆明市煙草公司嵩明縣分公司阿子營煙站提供。

1.1.2 供試藥劑苦參·印楝素：總有效成分含量為1%，苦參堿含量為0.4%，印楝素含量為0.6%，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；蘇云金桿菌：即蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，是近年來應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲劑，有效成分含量為16000IU/mg，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；金龜子綠僵菌：屬于子囊菌門、麥角菌科、綠僵菌屬，是一種廣譜性的殺蟲真菌，有效成分含量為100 億孢子/mL，購自云南綠戎生物產(chǎn)業(yè)開發(fā)股份有限公司；微生物菌W-1：即聚硼貪噬菌，屬于貪噬菌屬，可調(diào)控生長素濃度，維系根系健康生長。將分離純化的微生物菌W-1 在搖床150r/min，25℃設(shè)置下培養(yǎng)4d，使菌液濃度達(dá)到對(duì)數(shù)期，即106以上，呈比較渾濁的狀態(tài)即可。煙草蟲害常規(guī)對(duì)照處理（CK）不施用任何菌劑。

1.1.3 供試肥料有機(jī)肥為烤煙生產(chǎn)專用有機(jī)肥，N+P2O5+K2O ≥5%，有機(jī)質(zhì)含量≥45%，水分≤30%，購自云南納若生物工程有限責(zé)任公司；復(fù)合肥為云南煙草專用肥，總養(yǎng)分≥47%（含硝態(tài)氮），N∶P2O5∶K2O=15∶8∶24，購自云南歐羅漢姆肥業(yè)科技有限公司；農(nóng)家肥：由昆明市嵩明縣煙草公司阿子營煙站提供，由當(dāng)?shù)氐目葜∪~堆積半年以上發(fā)酵后而成，主要養(yǎng)分為氮、磷、鉀和有機(jī)質(zhì)；農(nóng)業(yè)用硝酸鉀為云南煙草專用肥，總氮≥13.5%，氧化鉀≥44.5%，氯離子≤1.2%，購自云南歐羅漢姆肥業(yè)科技有限公司；農(nóng)業(yè)用硫酸鉀為云南煙草專用肥，水溶性氧化鉀≥52%，硫含量≥17%，氯含量≤1.5%，購自國投新疆羅布泊鉀鹽有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)地點(diǎn)該試驗(yàn)選取蟲害較為嚴(yán)重的地塊，位于云南省昆明市嵩明縣阿子營村，紅壤土，試驗(yàn)地海拔2100m，25.338958°N、102.783402°E，年平均氣溫14℃，年降水量1100mm，土壤pH 值為4.61，有機(jī)質(zhì)22.90g/kg，水解性氮（N）132.71mg/kg，有效磷（P）99.17mg/kg，速效鉀（K）194.35mg/kg，電導(dǎo)率237.00μs/cm，陽離子交換總量3.82cmol/kg，適宜種植玉米和烤煙等農(nóng)作物。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3 次重復(fù)，共12 個(gè)小區(qū)，各小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積50m2（60 株煙），種植密度行間距120cm，株距80cm，試驗(yàn)區(qū)外設(shè)置2 行煙草作為保護(hù)行。

表1 不同試驗(yàn)處理施用的生物菌劑

1.2.3 田間管理試驗(yàn)中各個(gè)處理所施用的生物菌劑有所不同，煙草蟲害常規(guī)對(duì)照處理（CK）不施用任何菌劑，但各個(gè)處理施用底肥和追肥所用肥料種類及含量均相同，即每hm2施用底肥所用的有機(jī)肥為1500kg、復(fù)合肥300kg、農(nóng)家肥1200kg，施用方式為穴施，施用時(shí)間4 月26 日（移栽期）；每hm2追施農(nóng)業(yè)用硝酸鉀150kg，農(nóng)業(yè)用硫酸鉀225kg，施用方式為穴施，施用時(shí)間6 月1 日（旺長期）。其他田間栽培管理一致，及時(shí)修剪病蟲枝葉，保持田間干凈，避免滋生病害。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀的測定測量煙草農(nóng)藝性狀時(shí)間為7 月1 日（旺長期），各處理小區(qū)選擇有代表性的5～10 株煙株掛牌標(biāo)記，按YC/T 142—1998《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》的標(biāo)準(zhǔn)，測定煙株的農(nóng)藝性狀，包括煙株的株高、最大葉長、最大葉寬、莖圍、有效葉片數(shù)，取平均值后為1 次重復(fù)，測量3 個(gè)重復(fù)小區(qū)，即所有指標(biāo)皆設(shè)生物學(xué)重復(fù)3 次。

1.3.2 不同生物菌劑處理煙草酶活性的測定在煙草采收前期（8 月5 日）進(jìn)行煙草葉片的采集，在每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取煙株中部葉子，即從根部第1 片往上數(shù)大約第8 片煙葉，每個(gè)小區(qū)取10 片葉子混成1個(gè)樣為1 次重復(fù)（約10g），3 個(gè)小區(qū)即為3 次生物學(xué)重復(fù)。所取葉片測定相關(guān)生理生化指標(biāo)，包括葉片葉綠素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL），均采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒按照說明書進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3 次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)及表格制作采用Microsoft Excel 2021軟件進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用LSD 多重比較法（P＜0.05）進(jìn)行方差分析，采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物菌劑對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響由表2 可知，施用不同生物菌劑的處理相對(duì)于CK 處理，煙株的不同農(nóng)藝性狀變化不同。本試驗(yàn)中施用不同生物菌劑對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的株高、莖圍影響較小，各處理與CK 均無顯著差異，但T3 處理的株高相對(duì)于CK 處理呈上升現(xiàn)象，株高最大，為38.22cm，株高大小順序?yàn)門3＞CK＞T2＞T1，T2 和T1 處理較CK 分別下降0.94%、5.09%，T3 處理提升9.20%。莖圍與株高類似，各個(gè)處理間差異不顯著，最大值和最小值分別為8.36cm（T2）、8.11cm（T1），兩者相差很小，說明各個(gè)處理對(duì)莖圍影響較小。CK 處理與T1、T2 處理的葉長差異不顯著，與T3 處理差異顯著，但不同生物菌劑處理的葉長相對(duì)于CK 處理均有所增加，煙株葉長最大值為66.11cm（T3），最小值為58.67cm（CK），葉長大小順序?yàn)門3＞T1＞T2＞CK，3 個(gè)生物菌劑處理較CK 葉長分別提升了12.68%（T3）、7.38%（T1）、3.97%（T2）。煙株葉寬與葉長變化相類似，最大值為29.67cm（T3），最小值為23.56cm（CK），葉寬大小順序?yàn)門3＞T1＞T2＞CK，T3 處理與CK 處理差異顯著，3 個(gè)生物菌劑處理較CK 葉寬分別提升了25.93%（T3）、8.49%（T1）、7.05%（T2）。T2、T3 處理煙株有效葉片數(shù)與CK處理相比較差異不顯著，但3 個(gè)生物菌劑處理有效葉片數(shù)均低于CK 處理，有效葉片數(shù)大小順序?yàn)镃K＞T3＞T2＞T1。綜合以上農(nóng)藝性狀指標(biāo)結(jié)果，各處理之間株高和莖圍差異不顯著，3 個(gè)生物菌劑處理較對(duì)照葉長、葉寬有不同程度增加，有效葉片數(shù)減少，但T2、T3 處理減少不顯著。因此相對(duì)于T1 和T2 處理，T3 處理對(duì)煙株的生長促進(jìn)作用更強(qiáng)。

表2 不同處理對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響

2.2 不同生物菌劑對(duì)煙草生理生化指標(biāo)的影響由圖1 可知，不同生物菌劑處理后與CK 相比較，T3處理顯著抑制SOD 活性；T2 和T3 處理均顯著抑制CAT 活性；T1 和T2 處理顯著抑制Pro 含量，且對(duì)可溶性蛋白含量也有顯著抑制作用；3 個(gè)處理均顯著抑制PAL 活性，但與對(duì)照葉綠素含量均差異不顯著；T3 處理對(duì)POD 和可溶性糖含量有顯著促進(jìn)作用，其中T3 處理POD 活性為3697.87U/g，可溶性糖含量為51.25mg/g，CK 處理POD 活性為2093.93U/g，可溶性糖含量為42.18mg/g，即相對(duì)于CK 處理，T3處理POD 活性增加了76.60%，可溶性糖含量增加了21.50%；T1、T2 和T3 處理均顯著促進(jìn)PPO 活性，PPO 活性大小順序?yàn)門2＞T1＞T3＞CK，分別提升80.46%（T2）、64.94%（T1）、61.19%（T3）。植物遭受逆境時(shí)會(huì)產(chǎn)生SOD、POD、CAT、PPO、PAL等來抵御逆境所帶來的傷害，則這些酶活性越高抗逆性相對(duì)來說較強(qiáng)。而MDA 在植物體內(nèi)積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，MDA 含量越高則植物細(xì)胞受到的損傷越大，脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白是植物體內(nèi)理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性糖影響烤后煙葉的水溶性總糖和還原糖，葉綠素隨著煙葉的成熟而逐漸減少，若葉綠素含量過少則影響煙葉的成熟度進(jìn)而影響烘烤煙葉的品質(zhì)。綜合煙草葉片生理生化指標(biāo)結(jié)果，T3 處理對(duì)煙株病害的抗逆性強(qiáng)于T1 和T2 處理。

圖1 不同處理對(duì)煙草葉片生理生化指標(biāo)的影響

2.3 不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀及葉片酶活性的相關(guān)性分析分別對(duì)不同生物菌劑處理煙草農(nóng)藝性狀的株高、葉長、葉寬、莖圍、有效葉片數(shù)和煙草葉片SOD、POD、CAT、PPO、PAL 酶活性及MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素之間的相關(guān)性進(jìn)行分析（表3）。由結(jié)果可見，SOD 與POD、MDA、株高呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)，POD、MDA、株高三者之間呈極顯著正相關(guān)，POD 與可溶性糖呈顯著正相關(guān)，CAT 與PAL 呈顯著正相關(guān)，PPO 與PAL呈極顯著負(fù)相關(guān)，MDA 與可溶性糖和葉寬呈顯著正相關(guān)、與株高呈極顯著正相關(guān)，Pro 與可溶性蛋白和有效葉片數(shù)呈顯著正相關(guān)，可溶性糖與株高呈極顯著正相關(guān)，可溶性蛋白與有效葉片數(shù)呈極顯著正相關(guān)，葉長與葉寬呈顯著正相關(guān)。

表3 不同生物菌劑處理對(duì)煙草農(nóng)藝性狀及葉片酶活性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

植物生長會(huì)遭遇許多逆境，煙草侵染性病害的發(fā)生嚴(yán)重影響著煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著煙草生產(chǎn)的發(fā)展[15-16]，而蟲害侵襲是影響植物生長品質(zhì)的一個(gè)重要因素。在本試驗(yàn)中5 月中旬至5 月底天氣連續(xù)下雨，影響煙草生長發(fā)育速度，使得煙草團(tuán)棵期推遲，推測為本試驗(yàn)施用不同生物菌劑煙株相對(duì)于對(duì)照煙株的農(nóng)藝性狀多出現(xiàn)下降的原因。而3 種處理相對(duì)于對(duì)照處理在防御病蟲害的情況下，對(duì)煙株的葉長、葉寬有促進(jìn)作用，且微生物菌W-1（T3）處理相對(duì)于苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理促進(jìn)作用更強(qiáng)，但是對(duì)煙株的有效葉片數(shù)無促進(jìn)作用，推測微生物菌W-1 可促進(jìn)單個(gè)葉片的長寬，而對(duì)有效葉片數(shù)并無顯著促進(jìn)作用。

植物本身在遭遇蟲害時(shí)會(huì)做出一系列反應(yīng)來抵御蟲害，通常將植物體抵御蟲害的機(jī)制分為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性[17-18]，誘導(dǎo)型抗性是植物遭遇蟲害時(shí)產(chǎn)生并激活防御酶活性，生成防御物質(zhì)。SOD、POD 及CAT 是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要保護(hù)酶，具有抵抗逆境脅迫的防御作用[19-21]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理的SOD 酶活性顯著低于CK 處理，POD 酶活性顯著高于CK 處理，其余生物菌劑處理與對(duì)照均無顯著差異，金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）和微生物菌W-1（T3）處理的CAT 酶活性顯著低于CK 處理。SOD、POD及CAT 酶活性并不是都顯著高于CK 處理，而是有一定的差別，推測可能是在煙草采收前期進(jìn)行取樣，煙草體內(nèi)的酶活性已經(jīng)有一定程度的降低?？寡趸赶到y(tǒng)也包括PPO，在植物遭受逆境時(shí)，提高植株體內(nèi)PPO 酶的活性，從而使植物細(xì)胞免受因氧化作用而產(chǎn)生的破壞，本研究中3 個(gè)生物菌劑處理的PPO 含量均顯著高于CK 處理，這與范艷玲等[22]研究的棗樹遭受蟲害后，其PPO 酶活性快速增加從而提高抗逆性一致。植物器官在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA 是膜脂過氧化主要產(chǎn)物之一，一般認(rèn)為MDA 在植物體內(nèi)積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，它的含量是判斷膜脂過氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)[23]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理MDA 含量顯著高于CK 處理，因此抗逆性低于CK處理，而苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理與CK 處理無顯著性差異。脯氨酸（Pro）在生物體內(nèi)不僅是理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可作為膜和酶的保護(hù)物質(zhì)及自由基清除劑，從而對(duì)植物在滲透脅迫下的生長起到保護(hù)作用，本研究中苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理脯氨酸含量與CK 處理相比顯著降低，表明這2 個(gè)處理的抗逆性在脯氨酸方面較CK 處理差。PAL 參與植物抗蟲性與產(chǎn)生的木質(zhì)素和植保素的苯丙烷類代謝途徑有關(guān)，木質(zhì)素的積累加厚細(xì)胞壁，影響昆蟲取食，植保素有毒害和趨避作用，而本研究中3 個(gè)生物菌劑處理的PAL 酶活性均低于對(duì)照處理，這與Constabel等[24]在JA 和SA 循環(huán)代謝途徑中，蟲害脅迫常會(huì)造成植物體內(nèi)PAL 活性升高的研究結(jié)果完全相反，推測可能是與煙株所受蟲害的昆蟲有關(guān)?？扇苄蕴呛扛叩臒熑~較柔軟，色澤鮮亮。董傳媛[25]研究表明，油茶葉片的可溶性糖含量呈遞增趨勢，與發(fā)病率呈正相關(guān)。而可溶性蛋白作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植食性害蟲的寄主選擇行為有關(guān)，植物中可溶性蛋白含量升高，害蟲的存活率、生長發(fā)育速度及生殖力會(huì)相對(duì)提高[26]。本研究中微生物菌W-1（T3）處理可溶性糖與CK 處理有顯著差異，明顯高于對(duì)照處理，而3 個(gè)生物菌劑處理的可溶性蛋白含量都低于CK 處理，但是微生物菌W-1（T3）處理的可溶性蛋白含量高于苦參·印楝素+蘇云金桿菌（T1）和金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌（T2）處理。本研究中不同處理煙株葉綠素?zé)o顯著差異，不同生物菌劑的施用對(duì)葉綠素影響不大。綜合以上煙草抗逆相關(guān)指標(biāo)，3 個(gè)生物菌劑處理以微生物菌W-1 處理最佳。

影響煙草農(nóng)藝性狀和葉片酶活性的因素有很多，比如施肥種類、品種、生產(chǎn)條件等。本研究中POD 和MDA、可溶性糖、株高，CAT 和PAL，MDA 和可溶性糖、株高、葉寬，Pro 和可溶性蛋白、有效葉片數(shù)，可溶性糖和株高，可溶性蛋白和有效葉片數(shù)，葉長和葉寬均呈顯著或極顯著正相關(guān)，說明它們關(guān)系密切。其中POD 與株高、MDA、可溶性糖呈正相關(guān)，這與孟莉等[27]的研究發(fā)現(xiàn)POD 活性在煙葉生長過程中與總酚的含量呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢研究一致，其他具體原因有待深究。

通過對(duì)施用不同害蟲生防菌劑對(duì)煙草農(nóng)藝性狀、葉片生理生化指標(biāo)及兩者的相關(guān)性，綜合本文研究可得施用微生物菌W-1 控制煙草蟲害，煙草生長生理指標(biāo)最優(yōu)。