吳波 崔曉娟 王圓 王利君

(1.達(dá)州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,四川 達(dá)州 635000; 2.達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,四川 達(dá)州 635000)

肺癌是常見的惡性腫瘤,死亡率較高,是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因,約占20%[1]。肺癌患者根據(jù)癌細(xì)胞類型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC約占肺癌的85%,預(yù)后較差[2-3]。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展及靶向治療藥物的研發(fā),能夠更好地揭示驅(qū)動(dòng)基因突變?cè)贜SCLC發(fā)生發(fā)展中的作用,為患者的個(gè)體化治療提供確切的靶點(diǎn)。上皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor,EGFR)是NSCLC中最常見的驅(qū)動(dòng)基因,突變率高達(dá)46%,在亞洲NSCLC人群中,EGFR突變陽性率高達(dá)50%[4-5]。磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA)能夠使EGFR旁PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路磷酸化,進(jìn)而激活下游通路,通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等途徑參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展,是NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)[6]。PIK3CA基因突變常提示EGFR單抗耐藥[7]。因此,臨床上應(yīng)對(duì)NSCLC患者進(jìn)行EGFR、PIK3CA基因檢測。目前,主要采用腫瘤組織活檢進(jìn)行基因檢測,但其屬于有創(chuàng)檢查,且無法克服腫瘤的時(shí)間和空間異質(zhì)性[8]。有研究[9]證實(shí),外周血中循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)攜帶有完整的腫瘤基因組信息,且ctDNA檢查具有簡便、微創(chuàng)等特點(diǎn),外周血ctDNA的水平變化對(duì)癌癥患者臨床療效的評(píng)估及預(yù)后的預(yù)測具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在探討NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果的一致性,并分析影響兩者一致性的因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2019年12月—2020年12月我院收治的118例NSCLC患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為NSCLC。②年齡18～80歲。③腫瘤分期為Ⅰ～Ⅳ期。④肺部病灶為原發(fā)病灶。⑤東部腫瘤協(xié)作組行為狀態(tài)(Eastern Cooperative Group Performance Status,ECOG PS)[10]評(píng)分<2分。⑥接受ctDNA檢查。⑦臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①主要臟器功能衰竭。②合并其他惡性腫瘤。③自身免疫性疾病。④妊娠或哺乳期婦女。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 通過電子病歷收集納入患者的一般資料,包括年齡、性別、吸煙情況、腫瘤直徑、組織學(xué)亞型[肺鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)、肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LAC)、大細(xì)胞癌(Large cell carcinoma,LCC)、分化程度、腫瘤分期(Ⅰ～Ⅳ期)、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、轉(zhuǎn)移部位(腦、骨、肝、腎上腺、心包)、ECOG PS評(píng)分、初診未治情況。

1.2.2 外周血標(biāo)本及病理組織標(biāo)本的采集 外周血標(biāo)本的采集:患者入院后次日清晨采集空腹靜脈血10 mL置于抗凝管中,1600×g離心10 min,獲得白細(xì)胞(下層沉淀)和血清(上清),血清1600×g離心10 min獲得的上清即為血漿,保存于-80 ℃冰箱中備用。病理組織標(biāo)本的采集:厚度為5～8 μm的10片白片石蠟切片標(biāo)本保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 基因的提取及檢測方法 外周血標(biāo)本及病理組織標(biāo)本均完成10個(gè)基因(EGFR、PIK3CA及c-Met、TP53、FGFR1、BRAF、STK11、FANCA、KRAS、ERBB2)的檢測,檢測出豐度>0.2%定義為檢出陽性。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit試劑盒(德國Qiagen公司)提取血漿中ctDNA,采用QIAamp DNA FFPE組織試劑盒(德國Qiagen公司)提取病理組織中的DNA。使用Qubit 3.0和dsDNA HS檢測試劑盒(美國Life Technologies公司)對(duì)DNA進(jìn)行定量;采用Nanodrop紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度和純度;瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性。用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建文庫,于PCR儀上進(jìn)行文庫定量,將文庫在 Ion Torrent高通量測序平臺(tái)Proton上樣,測出DNA序列。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將兩種檢測結(jié)果中至少存在一種相同基因突變患者(真陽性)和無任何突變患者(真陰性)納入一致組,其余患者納入非一致組。

1.3 隨訪 通過電話或門診的方式對(duì)納入患者進(jìn)行定期隨訪,每3個(gè)月隨訪1次,隨訪時(shí)間為1年,隨訪截止至2021年12月,記錄118例患者的生存情況,計(jì)算1年生存率。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特征 納入患者中男63例,女55例,中位年齡32～76歲,平均(52.37±6.18)歲,組織學(xué)亞型為SCC型34例、LAC型78例、LCC型6例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例,腦轉(zhuǎn)移35例,骨轉(zhuǎn)移50例,肝轉(zhuǎn)移9例,腎上腺轉(zhuǎn)移15例,心包轉(zhuǎn)移9例。

2.2EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果分析 118例NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果,外周血ctDNA基因檢測結(jié)果中,共有84例(71.19%)患者檢出至少1個(gè)EGFR突變位點(diǎn),其中19 del突變44例(37.29%)、L858R突變28例(23.73%)、T790M突變39例(33.05%),33例(27.97%)患者發(fā)生PIK3CA突變,其中p.E545K突變18例(15.25%)、p.H1047R突變11例(9.32%),p.E542K突變5例(4.24%),此外,還發(fā)現(xiàn)其它基因的突變,包括c-Met突變2例(1.69%)、TP53突變26例(22.03%)、FGFR1突變3例(2.54%)、BRAF突變5例(4.24%)、STK11突變6例(5.08%)、FANCA突變4例(3.39%)、KRAS和ERBB2突變各2例(1.69%)。病理組織基因突變檢測結(jié)果中,共有77例(65.25%)患者發(fā)生EGFR突變,其中19del突變42例(35.59%)、L858R突變28例(23.73%)、T790M突變37例(31.36%),25例(21.19%)患者發(fā)生PIK3CA突變,其中p.E545K突變15例(12.71%)、p.H1047R突變9例(7.63%)、p.E542K突變4例(3.39%),其它突變基因中,c-Met突變7例(5.93%)、TP53突變39例(33.05%)、FGFR1突變3例(2.54%)、BRAF突變3例(2.54%)、STK11突變6例(5.08%)、FANCA突變4例(3.39%)、KRAS突變3例(2.54%)、ERBB2突變4例(3.39%)。見圖1。

圖1 NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果

2.3 ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果一致性分析 NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測一致性結(jié)果,EGFR的檢測一致率為77.12%(Kappa=0.348,P<0.001),PIK3CA的檢測一致率為71.19%(Kappa=0.537,P=0.058),總體檢測一致率為64.41%(Kappa=0.645,P=0.929)。外周血ctDNA與病理組織中PIK3CA基因突變及總體檢測的一致性良好,EGFR檢測的一致性較差。見圖2、表1。

圖2 ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變陽性檢測結(jié)果比較

2.4 一致組與非一致組臨床資料的比較 根據(jù)118例NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果,分為一致組(76例)和非一致組(42例),兩組患者的年齡、腫瘤直徑、分化程度、腫瘤分期、轉(zhuǎn)移部位、初診未治差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),性別、吸煙、組織學(xué)亞型、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ECOG PS、病理類型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 一致組與非一致組臨床資料的比較[n(×10-2)]

2.5 多因素Logistic回歸分析影響ctDNA與病理組織基因突變檢測結(jié)果一致性的因素 將上述一致組與非一致組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為自變量,將外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測結(jié)果(非一致=0,一致=1)作為因變量,采用逐步回歸法進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果提示,腫瘤低分化、腫瘤分期Ⅳ期、骨轉(zhuǎn)移、初診未治是外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測一致性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見圖3。

圖3 多因素Logistic回歸分析影響ctDNA與組織基因突變檢測結(jié)果一致性因素的森林圖

2.6 外周血ctDNA中EGFR、PIK3CA基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,分別比較外周血ctDNA中EGFR基因突變陽性與陰性間及PIK3CA基因突變陽性與陰性間NSCLC患者1年生存情況,EGFR基因突變陽性患者(84例)1年生存率為75.00%(63/84),明顯低于EGFR基因突變陰性患者[91.18%(33/34)],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=3.909,P=0.048);PIK3CA基因突變陽性患者(33例)1年生存率[66.67%(22/33)]明顯低于PIK3CA基因突變陽性患者[84.71%(72/85)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-Rankχ2=4.774,P=0.029)。見圖4。

圖4 生存曲線分析外周血ctDNA中EGFR、PIK3CA基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響

3 討論

NSCLC的發(fā)病率較高,且近年來呈逐年上升趨勢(shì),全球男性癌癥患者死亡人數(shù)中,肺癌居于第一位,在女性癌癥死亡患者中居于第二位[11-12]。大多數(shù)NSCLC患者早期并未表現(xiàn)出明顯的癥狀,多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期階段,治療效果和預(yù)后較差,這是導(dǎo)致NSCLC發(fā)病率和死亡率較高的重要原因[13]。早期診斷和治療是提高患者預(yù)后的重要措施。目前,臨床上主要采取影像學(xué)技術(shù)結(jié)合臨床特征對(duì)患者進(jìn)行早期篩查,但靈敏度和特異度較差[14]。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,能夠進(jìn)一步對(duì)肺癌的基因及位點(diǎn)的突變進(jìn)行深入了解,為臨床肺癌的靶向治療提供有利的條件。NSCLC的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,多種信號(hào)分子及基因均參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展[15-16]。EGFR是一種位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白,是酪氨酸激酶型受體,其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān),是NSCLC的主要突變基因之一[17]。其中,19del突變是EGFR最常見的突變類型,約占45%。本研究結(jié)果顯示,ctDNA與病理組織檢測出的EGFR突變類型中,19del突變占比最高,其次是T790M突變,T790M突變與厄洛替尼、吉非替尼抵抗相關(guān),值得臨床關(guān)注。PIK3CA的體細(xì)胞突變和PIK3CA擴(kuò)增在NSCLC患者中也較為常見,與患者的預(yù)后密切相關(guān)[18-19]。9號(hào)外顯子螺旋區(qū)是PIK3CA最主要的突變位點(diǎn),其中p.E545K突變占比較高。本研究中,ctDNA與病理組織檢測出的PIK3CA突變類型包括p.E545K突變、p.H1047R突變和p.E542K突變,p.E545K突變檢出率均最高。

在本研究中,外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測的一致率分別為77.12%和71.19%,略低于Bai等[20]報(bào)道中二者檢測EGFR基因突變的一致率(86.1%)和Schwaederle等[21]報(bào)道中檢測PIK3CA基因突變的一致率(88.1%)。本研究通過同時(shí)采集外周血ctDNA和病理組織、多部位獲取外周血并增加外周血樣本采集量等方法提高ctDNA檢出率及其與病理組織檢測的一致性。發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變的總體檢測一致率為64.41%。表明ctDNA與病理組織檢測基因突變的一致性仍較差,還需進(jìn)一步分析其具體的影響因素,對(duì)提高二者檢測的一致率和臨床NSCLC患者基因突變?cè)\斷的準(zhǔn)確性有重要意義。外周血ctDNA檢測方法簡便,容易被患者接受,當(dāng)患者無法耐受病理組織活檢時(shí),外周血ctDNA檢測是一種良好的備選方案,提高外周血ctDNA檢測的準(zhǔn)確性及與病理組織檢測基因突變的一致性有利于臨床上腫瘤的早期診斷和治療,提高患者的預(yù)后水平。

李鶴飛等[22]研究發(fā)現(xiàn),NSCLC患者血清ctDNA與腫瘤組織中TP53、EGFR、PIK3CA、KRAS、GNAS、NFE2L2、CYP2D6、BRCA2、ALK基因突變檢測的一致率為46%,影響二者檢測一致性的原因包括腫瘤分化程度、腫瘤分期及骨轉(zhuǎn)移。在本研究中,腫瘤低分化、腫瘤分期Ⅳ期、骨轉(zhuǎn)移、初診未治是外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA基因突變檢測一致性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,原因可能是腫瘤的分化程度越低、分期越高,其周圍組織及血管越容易受到侵犯,形成遠(yuǎn)處傳播及轉(zhuǎn)移,細(xì)胞凋亡在外周血中的發(fā)生率增加,使外周血中ctDNA的含量升高,有利于提高外周血ctDNA與病理組織中基因突變檢測的一致率。姜惠琴等[23]研究結(jié)果顯示,晚期結(jié)直腸癌患者血漿ctDNA與腫瘤組織中KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因突變檢測的一致性為62.50%,初診未治和肝轉(zhuǎn)移是影響二者檢測一致性的重要原因。在本研究中,初診未治是外周血ctDNA與病理組織中EGFR、PIK3CA檢測一致性較高的重要原因。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)是基于EGFR敏感突變研發(fā)的靶向治療藥物,目前已研發(fā)至第三代,能夠明顯改善患者的生存和預(yù)后,但對(duì)第三代EGFR-TKI耐藥性的產(chǎn)生仍不可避免[24-25]?？笶GFR單抗治療可能會(huì)加劇EGFR、PIK3CA等基因的突變,導(dǎo)致ctDNA與病理組織中基因突變檢測的不一致率增加。本研究中,肝轉(zhuǎn)移并不是影響二者檢測一致性的因素,與姜惠琴等[23]的研究存在差異,原因可能與納入的研究對(duì)象的癌癥類型不同及本研究的樣本量不足有關(guān),還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討。生存曲線分析結(jié)果顯示,ctDNA檢測EGFR突變陽性患者生存率明顯低于陰性患者,PIK3CA突變陽性患者生存率明顯低于陰性患者,表明外周血ctDNA檢測EGFR、PIK3CA基因突變對(duì)NSCLC患者的預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值。

本研究也存在一定的局限性,為單中心小樣本回顧性研究,且缺乏NSCLC患者治療情況下外周血ctDNA的動(dòng)態(tài)研究,還需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心、前瞻性研究。

4 結(jié)論

外周血ctDNA與組織DNA檢測PIK3CA的一致性良好,檢測EGFR的一致性較差,腫瘤分化程度、分期、骨轉(zhuǎn)移及初診治療情況均與檢測一致性有關(guān)。