鄭志方 陳國利 王文濤 敬小青

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.小兒內(nèi)科; 2.外一科, 河北 承德 067000)

腎病綜合征(Nephrotic syndrome,NS)是目前臨床上常見的慢性病之一,它以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高血脂癥為基本特征[1],會引起腎小球基底膜通透性增加,嚴(yán)重者會發(fā)生腎衰竭而危及生命。臨床治療NS的方法主要是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GCs)。GCs是治療NS的首選藥物之一,但其在應(yīng)用過程中會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng),影響臨床治療效果[2]。中藥治療NS不僅能緩解病情,又能夠避免應(yīng)用GCs的不良反應(yīng),在臨床治療有著良好的前景。曲克蘆丁(Troxerutin,TRO)作為蘆丁的衍生物,是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)TRO具有抗凋亡、抗氧化、預(yù)防血栓形成、抑制血小板和紅細(xì)胞凝聚等多種作用[4]。在治療腎小球腎炎方面,TRO能增加腎血流量和腎小球?yàn)V過率,具有良好的利尿消腫療效[5]。但TRO能否減輕阿霉素(Adriamycine,ADM)誘導(dǎo)的NS大鼠腎損傷,目前還鮮有研究。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)是介導(dǎo)調(diào)控自噬的重要信號通路[6],當(dāng)組織接受損傷信號時,AMPK發(fā)生磷酸化,減輕了mTOR的磷酸化,達(dá)到促進(jìn)自噬、抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的目的[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)其能通過介導(dǎo)自噬減輕腸道黏膜損傷、缺血/再灌注損傷、延緩腦衰老等,但在NS治療中能否減輕腎損傷方面研究較少。本研究通過建立ADM誘導(dǎo)的大鼠NS模型,給予TRO干預(yù),并以腹腔注射AMPK抑制劑,旨在觀察TRO對NS大鼠腎損傷的影響及AMPK/mTOR信號通路在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級雄性Wistar大鼠60只,體質(zhì)量220～250 g,購自博濟(jì)醫(yī)藥科技股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證號為:SYXK(粵)2022-0279。實(shí)驗(yàn)前所有動物飼養(yǎng)于通風(fēng)、采光良好的實(shí)驗(yàn)室,溫度(22±1)℃,相對濕度40%～60%環(huán)境下飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)已得到本院動物倫理委員會批準(zhǔn)(動物倫理號:10458936)。

1.2 主要試劑與儀器 注射用鹽酸多柔比星購自日本明治制藥株式會社;曲克蘆丁(純度≥98%)購自江蘇南京景竹生物科技有限公司;Compound C購自于上海芮暉化工科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250蛋白染色劑購自上海邁聯(lián)生物工程有限公司;AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR、Beclin-1、LC3、GAPDH抗體及其二抗購自美國Cell Signaling Technology;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司;全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 NS模型的建立與動物分組、給藥 參照文獻(xiàn)[9]方法,選取48只大鼠建立ADM誘導(dǎo)的NS模型。選取的大鼠經(jīng)尾靜脈注射濃度為2 mg/mL的ADM,注射劑量為6.5 mg/kg。于造模前1 d和造模7 d后收集24 h尿液,檢測各組大鼠尿蛋白,若大鼠出現(xiàn)尿蛋白含量>100 mg/24 h,則NS模型建立成功[10]。將造模成功的48只大鼠隨機(jī)分為模型組(Model組)、低劑量TRO組(TRO-L組,50 mg/kg)、高劑量TRO組(TRO-H組,100 mg/kg)、高劑量TRO+AMPK抑制劑Compound C組(TRO-H+CC組,100 mg/kg TRO+20 mg/kg CC),每組12只。另取12只作為對照組(Control組),Control組尾靜脈注射等量的生理鹽水。造模7 d后驗(yàn)證模型建立成功,按各組藥物劑量進(jìn)行灌胃給藥。每日一次,共給藥7 d。Model組灌胃等量的生理鹽水,每日一次,共7 d。TRO-H+CC組除每日灌胃TRO外,還需腹腔注射20 mg/kg CC,每日1次,共7 d。

1.4 大鼠尿蛋白、血清生化指標(biāo)的檢測 末次給藥后收集各組大鼠24 h尿液,用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行尿蛋白檢測。末次給藥1 h后用乙醚麻醉大鼠,腹主動脈取血,采血后于4 ℃靜置4 h后,低溫離心機(jī)(4 ℃)以轉(zhuǎn)速3000 r/min離心10 min,取上清液即為大鼠血清。利用全自動生化分析儀對血清中白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的含量進(jìn)行檢測。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腎組織病理學(xué)變化 取血后處死大鼠,解剖取其腎臟。將各組其中6只大鼠腎臟置于10%多聚甲醛中進(jìn)行固定(剩余大鼠腎組織用于酶聯(lián)免疫吸附法、RT-qPCR法及Western Blot法檢測)。經(jīng)乙醇脫水、置蠟盒中進(jìn)行包埋、切片機(jī)切片(5 μm)、烤片、蘇木精-伊紅(HE)染色、樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理學(xué)變化。其余腎臟組織于液氮中凍存。

1.6 ELISA法檢測各組大鼠腎組織中SOD、MDA含量 取摘除的腎臟,加入冰生理鹽水于超聲勻漿機(jī)中3000 r/min離心制備10%腎組織勻漿液。根據(jù)SOD、MDA試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測各組大鼠腎組織中SOD、MDA的水平。

1.7 TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡 采用TUNEL法對各組大鼠腎組織的細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測。將切片置于染色缸中,經(jīng)二甲苯、無水乙醇、95%乙醇和75%乙醇洗滌后,用PBS洗滌2次,每次5 min。之后加入胰蛋白溶液進(jìn)行水解40 min除蛋白,PBS洗滌3次。切片中滴加50 μL的TUNEL液,于避光濕盒37 ℃孵育1 h,再用PBS洗滌3次。之后加入轉(zhuǎn)化劑POD 50 μL孵育25 min,再用PBS洗滌3次。加入5% DBA底物進(jìn)行顯色,后用蒸餾水洗滌4次,再用蘇木精復(fù)染10 min,再用蒸餾水、正丁醇洗滌。最后加入二甲苯進(jìn)行脫水,用中性樹膠封片。用光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織細(xì)胞凋亡情況。采用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)量,凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 RT-qPCR法檢測腎組織中AMPK、mTOR mRNA的表達(dá)情況 采用Trizol法提取腎組織中的總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,再使用SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。引物設(shè)計(jì)如下:AMPK上游引物:5’-GCTGTGGATCGCCAAATTAT-3’,下游引物:5’-CACGTGCTCATCATCGAAAG-3’;mTOR上游引物:5’-AATACGCCATGAAACACTTCG-3’,下游引物:5’-GGTCTTCCTTGTTTGTGTCCA-3’;GAPDH上游引物:5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’,下游引物:5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’。使用2-ΔΔCT計(jì)算AMPK和mTOR mRNA的相對表達(dá)量。

1.9 Western Blot檢測大鼠腎臟中AMPK/mTOR信號通路和自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.6制備的腎組織勻漿,加入RIPA裂解液提取總蛋白。利用BCA法對蛋白進(jìn)行定量,后經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,將膜與一抗AMPK(1∶500)、p-AMPK(1∶500)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、Beclin-1(1∶1000)、LC3(1∶1000)于4 ℃下孵育過夜。次日復(fù)溫、漂洗后,與相應(yīng)二抗(1∶1000)室溫孵育1 h,TBST清洗后加入ECL顯色液顯影,利用凝膠成像儀成像后,利用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較 造模前1 d各組大鼠的24 h尿蛋白含量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后7 d,Control組大鼠24 h尿蛋白含量與造模前1 d相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);其余各組與Control組相比,24 h尿蛋白含量均顯著升高(P<0.05),說明NS模型建立成功。給藥7 d后,與Control組相比,Model組大鼠24 h尿蛋白含量顯著升高(P<0.05);與Model組相比,TRO-L組、TRO-H組大鼠24 h尿蛋白含量顯著降低(P<0.05);與TRO-L組相比,TRO-H組大鼠24 h尿蛋白含量顯著降低(P<0.05);與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠24 h尿蛋白含量顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較

2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較 與Control組相比,Model組大鼠血清中TG、TC、BUN和Scr水平顯著上升(均P<0.05),ALB、TP水平顯著下降(均P<0.05);與Model組相比,TRO-L組和TRO-H組大鼠血清中TG、TC、BUN和Scr水平顯著下降(均P<0.05),ALB、TP水平顯著上升(均P<0.05);與TRO-L組相比,TRO-H組大鼠血清中TG、TC、BUN和Scr水平顯著下降(均P<0.05),ALB、TP水平顯著上升(均P<0.05);與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠血清中TG、TC、BUN和Scr水平顯著上升(均P<0.05),ALB、TP水平顯著下降(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 HE染色提示,Control組大鼠腎臟組織排列整齊規(guī)則,未見明顯病變。Model組大鼠可見腎小球肥大,球囊壁增厚,球囊腔呈擴(kuò)張狀,腎小管排列紊亂,出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤;與Model組相比,TRO-L和TRO-H組大鼠的腎臟損傷有所減輕,細(xì)胞壞死減少,炎性浸潤減輕;與TRO-H組相比,TRO-H+CC組腎臟病理損傷加重,細(xì)胞壞死增多,炎性浸潤增多。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色(400×)

2.4 各組大鼠腎臟中SOD、MDA含量比較 與Control組相比,Model組大鼠腎臟SOD含量顯著減少,MDA含量顯著增加(均P<0.05);與Model組大鼠相比,TRO-L、TRO-H組大鼠腎臟SOD含量顯著增加,MDA含量顯著減少(均P<0.05);與TRO-L組相比,TRO-H組大鼠腎臟SOD含量顯著增加,MDA含量顯著減少(均P<0.05);與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠腎臟中SOD含量顯著減少,MDA含量顯著增加(均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟中SOD、MDA含量比較

2.5 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果提示,與Control組相比,Model組大鼠細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與Model組大鼠相比,TRO-L組、TRO-H組大鼠細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與TRO-L組大鼠相比,TRO-H組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織TUNEL染色(200×)

表4 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率

2.6 各組大鼠腎臟組織中AMPK、mTOR mRNA表達(dá)水平比較 與Control組相比,Model組大鼠腎臟中的AMPK mRNA降低、mTOR mRNA表達(dá)升高(均P<0.05)。與Model組相比,TRO-L、TRO-H組大鼠腎臟AMPK mRNA表達(dá)升高、mTOR mRNA表達(dá)降低(均P<0.05)。與TRO-L組相比,TRO-H組大鼠腎臟AMPK mRNA表達(dá)升高、mTOR mRNA表達(dá)降低(均P<0.05)。與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠腎臟AMPK mRNA表達(dá)降低、mTOR mRNA表達(dá)升高(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎臟組織中AMPK、mTOR mRNA表達(dá)水平比較

2.7 各組大鼠腎臟組織中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與Control組相比,Model組大鼠腎臟組織p-AMPK/AMPK水平、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)降低、p-mTOR/mTOR水平升高(均P<0.05)。與Model組相比,TRO-L、TRO-H組大鼠腎臟p-AMPK/AMPK水平、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)升高、p-mTOR/mTOR水平降低(均P<0.05)。與TRO-L組相比,TRO-H組大鼠腎臟組織p-AMPK/AMPK、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)升高、p-mTOR/mTOR水平降低(均P<0.05)。與TRO-H組相比,TRO-H+CC組大鼠腎臟p-AMPK/AMPK水平、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)降低、p-mTOR/mTOR表達(dá)升高(均P<0.05)。見表6、圖3。

表6 Western Blot檢測大鼠腎臟中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

NS作為臨床上常見的慢性病,會造成患者的腎臟損傷[11]。ADM誘導(dǎo)的NS模型是腎臟損傷的經(jīng)典模型之一,其與人NS的病理改變極其相似[12]。關(guān)于ADM致NS的病理機(jī)制尚不明確,有研究[13]認(rèn)為,ADM及其代謝物大量積累具有腎毒性,會損傷腎小球細(xì)胞,造成脂質(zhì)過氧化物與自由基大量生成,最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能受損,引起蛋白尿。本研究采用尾靜脈注射ADM致大鼠患NS,并檢測造模前后大鼠24 h尿蛋白的含量,結(jié)果顯示造模7 d后,NS大鼠的24 h尿蛋白含量顯著高于Control組,給藥結(jié)束后,Model組大鼠24 h尿蛋白含量顯著高于Control組,TP和ALB比Control組降低,TG、TC、BUN、和Scr比Control組升高,BUN和Scr指標(biāo)升高提示腎功能受損[14],HE染色觀察到腎臟組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理學(xué)變化,這些特征符合NS的臨床特征和病理表現(xiàn)[15]。結(jié)果說明,ADM致大鼠NS模型建立成功。

TRO又稱維生素P4,是羥基蘆丁中最重要的有效成分,其具有抑制血栓形成、改善微循環(huán)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、防治因血管通透性升高而引起的水腫、抗放射性損傷、抗炎、抗過敏等作用[16]。孫穎超等[5]將TRO與姜黃素聯(lián)用治療小兒急性腎小球腎炎,發(fā)現(xiàn)能減輕小兒急性腎小球腎炎的炎癥反應(yīng),促進(jìn)腎功能修復(fù);張影[17]研究發(fā)現(xiàn),低分子肝素鈣聯(lián)合曲克蘆丁治療原發(fā)性NS,可以改善患者的高凝狀態(tài),具有顯著的臨床效果;Shan等[18]研究發(fā)現(xiàn)TRO可以通過調(diào)節(jié)CXCR4-TXNIP-NLRP3信號通路,保護(hù)腎臟組織免受BDE-47誘導(dǎo)的炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示,與Model組大鼠相比,TRO-L、TRO-H組大鼠24 h尿蛋白含量、血清中TG、TC、BUN和Scr水平、MDA水平、細(xì)胞凋亡率顯著減少,血清中ALB、TP水平、腎臟中SOD水平顯著增加,HE染色觀察到腎臟組織病理學(xué)損傷有所減輕,提示TRO能保護(hù)NS的腎臟損傷。

自噬是一種調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的機(jī)制,它能吞噬衰老細(xì)胞或細(xì)胞器,在某種程度上,促進(jìn)自噬可以減輕組織器官的炎性損傷。腎臟中線粒體自噬較活躍,受損的溶酶體能夠被自噬清除,因此通過自噬來抑制炎癥可以保護(hù)腎臟[19-20]。李燕菊等[21]研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素可以通過調(diào)控AMPK/SIRT1途徑促進(jìn)自噬并抑制凋亡,減輕大鼠的急性腎損傷。AMPK/mTOR信號通路是自噬介導(dǎo)的途徑之一,激活A(yù)MPK可以抑制mTOR的磷酸化而促進(jìn)自噬,可成為治療NS的一個重要靶點(diǎn)[22]。本研究結(jié)果顯示,與Control 組相比,Model組大鼠腎臟組織中AMPK mRNA、p-AMPK/AMPK表達(dá)、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)降低,mTOR mRNA、p-mTOR/mTOR表達(dá)升高;與Model組相比,TRO-L和TRO-H組大鼠腎臟組織中AMPK mRNA、p-AMPK/AMPK表達(dá)、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)升高,mTOR mRNA、p-mTOR/mTOR水平降低。推測TRO可能通過激活A(yù)MPK/mTOR通路減輕ADM誘導(dǎo)的大鼠NS腎損傷。為了驗(yàn)證此猜想,利用AMPK抑制劑Compound C來干預(yù)高劑量TRO處理的大鼠。結(jié)果顯示,Compound C減弱了高劑量TRO對NS大鼠腎損傷的保護(hù)作用,證實(shí)了該猜想。

4 結(jié)論

TRO可能通過激活A(yù)MPK/mTOR通路,減輕ADM誘導(dǎo)的大鼠NS腎損傷。該研究為臨床治療NS提供了新的靶點(diǎn)和方法,然而本研究還存在不足之處,TRO減輕NS大鼠的腎損傷可能還存在其他信號通路和機(jī)制,還有待進(jìn)一步深入研究。