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計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)在雄激素受體動態(tài)機(jī)制探討和藥物發(fā)現(xiàn)中的研究進(jìn)展

2023-10-20 01:59富煒濤柯迪李丹侯廷軍
藥學(xué)進(jìn)展 2023年8期
關(guān)鍵詞:激活劑拮抗劑激動劑

富煒濤,柯迪,李丹 ,侯廷軍

(1.江蘇威凱爾醫(yī)藥科技有限公司創(chuàng)新藥研發(fā)中心,江蘇 南京 211800;2.浙江大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310058;3.浙江大學(xué)金華研究院,浙江 金華 321000)

雄激素受體(androgen receptor,AR)及其配體雄激素在男性第二性征、肌肉和骨骼等發(fā)育過程中具有重要的作用[1-2]。異常的AR 信號與多種疾病密切相關(guān),如前列腺癌、雄激素不敏感綜合征(androgen insensitivity syndrome,AIS)、脊髓延髓肌萎縮癥等[3-5]。其中,前列腺癌位列男性腫瘤發(fā)病率第2 名,且是男性致死率第5 名的惡性腫瘤[6]。在我國,前列腺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢[7]。作為威脅人類生命健康的重大疾病,前列腺癌的新型治療策略是各大制藥公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)研究的熱點。其中,AR 信號通路在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,靶向AR 的小分子藥物開發(fā)已獲得了巨大的成功,并且已有多款上市藥物在全球范圍內(nèi)使用,包括第1 代的羥基氟他胺(1)、尼魯米特(2)和R-比卡魯胺(3),以及第2 代的恩雜魯胺(4)、阿帕魯胺(5)和達(dá)洛魯胺(6)(見圖1)[3]。

圖1 第1 代和第2 代靶向雄激素受體上市藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structures of the first and second generations of approved androgen receptor antagonists

AR 屬于核受體家族,由920 個氨基酸殘基組成,分為3 個主要結(jié)構(gòu)域:N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain,DBD)和配體結(jié)合域(ligand-binding domain,LBD)。AR 信號通路中,AR 在非活性狀態(tài)下與熱休克蛋白結(jié)合,而當(dāng)有雄激素與AR 結(jié)合時,AR 會從熱休克蛋白解離,并募集共激活劑,以AR 二聚體在核內(nèi)與雄激素響應(yīng)元件相結(jié)合,啟動相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序,發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。

AR 的DBD 和LBD 的6 個結(jié)合位點已經(jīng)有多種新型小分子拮抗劑通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計(computer aided drug design,CADD)相關(guān)技術(shù)被發(fā)現(xiàn)(見圖2),這些位點包括AR-DBD 結(jié)合區(qū)域P-Box 和D-Box 附近的2 個位點,AR-LBD 的配體結(jié)合口袋(ligand-binding pocket,LBP,已上市小分子藥物的結(jié)合位點)、激活功能區(qū)2(activation function 2,AF2)、結(jié)合功能區(qū)3(binding function 3,BF3)和二聚體界面結(jié)合口袋(dimer interface pocket,DIP)[3]。

圖2 雄激素受體的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合域已發(fā)現(xiàn)小分子拮抗劑的6 個結(jié)合位點Figure 2 The 6 binding pockets discovered for the binding of small-molecule antagonists located at AR-DBD and AR-LBD

無論是第1 代還是第2 代上市藥物,在用藥一段時間后,AR基因的擴(kuò)增、藥物分子結(jié)合位點的氨基酸殘基點突變、剪接變異體的出現(xiàn)等,導(dǎo)致這些AR 靶向藥物發(fā)生不同程度的耐藥,甚至從拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧觿?,極大限制了臨床治療效益[8]。為了提供新的治療策略,多種多樣的技術(shù)應(yīng)用于靶向不同新位點的新型拮抗劑的開發(fā)[9-10]。其中,CADD技術(shù)在雄激素受體-配體動態(tài)機(jī)制的探討,特別是在耐藥機(jī)制方面的研究,以及新型拮抗劑的發(fā)現(xiàn)和新位點探索上展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。綜述CADD 技術(shù)在AR 相關(guān)的機(jī)制探討和新位點新活性拮抗劑發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用,為后續(xù)CADD 技術(shù)在AR 藥物開發(fā)中的應(yīng)用以及更多核受體中的應(yīng)用提供重要參考。

1 常用的計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)

1.1 結(jié)構(gòu)預(yù)測和構(gòu)建

當(dāng)靶標(biāo)受體的結(jié)構(gòu)是未知且僅有序列信息的情況下,通過同源建模和人工智能(artificial intelligence,AI)預(yù)測是目前常用的有效方法。同源建模是以實驗獲得的同源受體三維結(jié)構(gòu)信息為模板,構(gòu)建目標(biāo)序列三維結(jié)構(gòu)的方法[11]。AI 結(jié)構(gòu)預(yù)測是通過AI 技術(shù)對已經(jīng)解析的受體三維結(jié)構(gòu)和序列之間的關(guān)系進(jìn)行訓(xùn)練推理,用于預(yù)測未解析的三維結(jié)構(gòu)。AI 結(jié)構(gòu)預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)達(dá)到原子水平的準(zhǔn)確度,代表性的技術(shù)如AlphaFold,RoseTTAFold,ColabFold,Uni-Fold 等[12-15]。

1.2 分子對接

分子對接是依據(jù)結(jié)構(gòu)形狀匹配和能量匹配,預(yù)測受體和配體之間結(jié)合模式的一種技術(shù)。在個人電腦上,分子對接即可快速預(yù)測受體分子和配體分子之間的結(jié)合模式。配體可以是化學(xué)小分子、多肽、蛋白、DNA 和RNA。在蛋白-小分子預(yù)測方面,經(jīng)典的基于搜索的對接方法有AutoDock,Vina,Glide 等,以及新型的基于擴(kuò)散生成模型DiffDock 等[16-17]。

1.3 基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選

基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選是指在有合適受體晶體結(jié)構(gòu)或者構(gòu)建的合理模型結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,運用分子對接技術(shù),將化合物庫(含數(shù)萬到數(shù)億)的分子一一對接到受體,并按照打分函數(shù)進(jìn)行打分排序,優(yōu)選排序靠前、結(jié)構(gòu)新穎的化合物進(jìn)行實驗驗證。這一技術(shù)能夠快速篩選大規(guī)模的化合物庫,優(yōu)選合適的潛在活性化合物,在效率和成本上相比基于實驗的高通量篩選具有明顯的優(yōu)勢[17-18]。

1.4 基于配體的虛擬篩選

基于配體的虛擬篩選依據(jù)作用于特定靶標(biāo)的已知活性分子構(gòu)建合適的活性預(yù)測模型,以篩選出結(jié)構(gòu)多樣且具有生物活性的分子。隨著AI 技術(shù)的不斷發(fā)展,多種多樣活性預(yù)測模型和分子生成等技術(shù)的不斷涌現(xiàn),基于配體的虛擬篩選在定量構(gòu)效關(guān)系分析、藥效團(tuán)模型構(gòu)建等傳統(tǒng)模型基礎(chǔ)上,應(yīng)用范圍得到了極大拓展[19-21]。

1.5 分子動力學(xué)模擬

基于同源建?;蛘逜lphaFold 等AI 技術(shù)構(gòu)建的結(jié)構(gòu)或者晶體結(jié)構(gòu)通常是靜態(tài)結(jié)構(gòu),難以反映研究對象的動態(tài)過程,而分子動力學(xué)(molecular dynamics,MD)模擬是研究這樣動態(tài)過程的重要技術(shù)。MD 模擬基于分子力場,通過在模擬過程中不斷求解牛頓運動方程,以模擬研究對象的動態(tài)過程。對動態(tài)過程的研究,能夠更清晰地了解研究對象的動態(tài)機(jī)制,如受體氨基酸殘基點突變對配體結(jié)合的耐藥機(jī)制、受體-配體結(jié)合解離的機(jī)制等[22]。此外,MD 模擬還能輔助結(jié)構(gòu)相對單一的受體晶體結(jié)構(gòu)或者構(gòu)建的模型結(jié)構(gòu)獲得多樣性的動態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 結(jié)合自由能預(yù)測

考察受體與配體結(jié)合強(qiáng)度的關(guān)鍵表征指標(biāo)即兩者的結(jié)合自由能。結(jié)合自由能常用的方法有打分函數(shù)(傳統(tǒng)的和新型基于機(jī)器學(xué)習(xí)的打分函數(shù))、基于過程的能量計算(傘形采樣、拉伸分子動力學(xué)模擬等)和兩點式自由能計算[分子力學(xué)/廣義波恩表面積(molecular mechanics/generalized Born surface area,MM/GBSA)、分子力學(xué)/泊松-波爾茲曼表面積(molecular mechanics/Poisson Boltzmann surface area,MM/PBSA)、煉金術(shù)自由能(熱力學(xué)積分、自由能微擾)][23-26]。不同的自由能預(yù)測方法有不同的適用范圍,如打分函數(shù)預(yù)測速度快,常用于大規(guī)模虛擬篩選;煉金術(shù)自由能由于計算速度慢且對計算分子間結(jié)構(gòu)的相似性要求高,同時精度較高,因此,常用于苗頭分子的理性設(shè)計;而能夠較好平衡計算精度和效率的MM/GBSA 和MM/PBSA方法在基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選重打分和基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計中被廣泛應(yīng)用[27]。

2 計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)在雄激素受體靶標(biāo)機(jī)制探索方面的應(yīng)用

由于AR-LBD 的晶體結(jié)構(gòu)解析相對完整以及AR-LBD 的重要作用,CADD 技術(shù)在基于AR 靶標(biāo)機(jī)制的研究方面主要是圍繞AR-LBD 展開。ARLBD 二聚體由2 個同源AR-LBD 組成,每個單體具有3層折疊結(jié)構(gòu),包括由螺旋H1和H3形成的第1層,由螺旋H4,H5,H8 和H9 形成的中間層,以及由螺旋H6,H7,H10-11 和H12 形成的第3 層(見圖3A)。

圖3 AR-LBD 二聚體結(jié)構(gòu)以及雄激素不敏感綜合征相關(guān)點突變位置Figure 3 The structure of AR-LBD dimer and the location of androgen insensitivity syndrome-related mutation

2.1 雄激素不敏感綜合征機(jī)制的研究

AIS 屬于罕見的46XY 性發(fā)育異常疾病,主要表現(xiàn)為染色體46XY,但表現(xiàn)女性的第二性征。依據(jù)AIS不同的嚴(yán)重程度,分為輕型、部分型和完全型。AR作為關(guān)鍵基因,其無義突變、錯義突變、剪接變異體、基因缺失、基因插入與AIS 密切相關(guān)[28]。僅在AR-LBD,就存在40 余個與AIS 相關(guān)的點突變[29]。作為實驗驗證的重要補(bǔ)充,MD 模擬在機(jī)制闡明方面發(fā)揮了重要作用,有助于探究這些突變?nèi)绾斡绊慉R 的結(jié)構(gòu)或者雄激素的結(jié)合。

Arg774 突變?yōu)镃ys774(R774C)是導(dǎo)致AIS 的重要點突變,而該突變并不在AR 的LBP 位點,即不在雄激素結(jié)合位點,而R774C 如何影響AR 的功能,尚無法解釋(見圖3B)。為此,Wu 等[30]設(shè)置不同的模擬溫度,通過MD 模擬檢測AR-LBD 野生型(AR-LBDWT)和R774C(AR-LBDR774C)的構(gòu)象變化。結(jié)果顯示:1)AR-LBDR774C導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)紊亂,從而影響AR-LBD LBP 口袋形狀;2)AR-LBDR774C改變AR-LBD 動態(tài)性質(zhì),進(jìn)而誘導(dǎo)更多的AR-LBD LBP 構(gòu)象分布;3)蛋白的構(gòu)象通過降低溫度能夠逆轉(zhuǎn),這與分子生物學(xué)實驗結(jié)果是吻合的。

AR-LBD 二聚體界面間的氨基酸殘基突變,是導(dǎo)致AIS 的重要原因之一,而機(jī)制尚不清楚。Fu 等[31]構(gòu)建了2 個代表性的AIS 相關(guān)突變AR-LBDW751R和AR-LBDF754V,以及AR-LBDWT的二聚體的MD 模擬,結(jié)果顯示AR-LBDW751R和AR-LBDF754V二聚體在模擬中非常容易被分離,AR-LBDWT則在模擬過程中始終保持穩(wěn)定。隨后的實驗驗證支持了模擬結(jié)果,即AR-LBDWT能保持二聚體,AR-LBDW751R和ARLBDF754V則以單體形式存在。即AR-LBD 二聚體界面間的突變導(dǎo)致AR 無法二聚化,因此雄激素?zé)o法發(fā)揮正常功能。

2.2 市售小分子藥物耐藥機(jī)制的研究

市售的AR 拮抗劑,在用藥一段時間后,都會發(fā)生不同程度的耐藥,甚至部分藥物會從拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧觿?。其中,AR 的點突變是最具代表性的耐藥機(jī)制[3,8]。然而,點突變?nèi)绾斡绊懯荏w結(jié)構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致藥物耐藥,這一現(xiàn)象難以從單一的實驗現(xiàn)象解釋,計算機(jī)模擬則給出了重要的補(bǔ)充解釋。

R-比卡魯胺(3)和化合物7 結(jié)構(gòu)高度相似(見圖1 和圖4)。有趣的是,R-比卡魯胺在ARLBDWT情況下顯示具有拮抗活性,在AR-LBD 點突變Trp741 突變?yōu)長eu741(AR-LBDW741L)情況下,則表現(xiàn)為激動活性,類似物7 則無論是否發(fā)生ARLBDW741L突變,均表現(xiàn)為激動活性。Bisson 等[32]對化合物3 和7 分別在AR-LBDWT和AR-LBDW741L突變體中進(jìn)行MD 模擬以探討機(jī)制。結(jié)果顯示,ARLBDW741L中H3,H5,H11 和H12 的氨基酸殘基表現(xiàn)更為穩(wěn)定,而在AR-LBDWT中,R-比卡魯胺通過降低氨基酸殘基Met895 和Trp741 的穩(wěn)定性而達(dá)到拮抗效果。即Trp741 通過穩(wěn)定AR 構(gòu)象在激活狀態(tài)導(dǎo)致耐藥。Osguthorpe 等和Liu 等隨后在對R-比卡魯胺和類似物7 的模擬研究中也得到了類似的結(jié)論,即AR-LBDW741L影響H12 的構(gòu)象是拮抗劑和激動劑變化的關(guān)鍵點[33-34]。除了AR-LBDW741L,Liu等[35]對多種耐藥突變W741C,W741L,W741C_T877A,T877A,F(xiàn)876L,F(xiàn)876L_T877A 和L701H的模擬研究顯示,這些耐藥突變的共同點是會誘導(dǎo)Met895 對R-比卡魯胺結(jié)合的能量貢獻(xiàn)增加,進(jìn)而穩(wěn)定H12 的構(gòu)象以形成有利于共激活劑結(jié)合的AF2 位點。

圖4 化合物7~11 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及化合物3,7,10 與AR-LBD 的結(jié)合模式Figure 4 Structures of compounds 7-11 and the binding modes of compounds 3,7 and 10 with AR-LBD

突變影響AR-LBD H12 構(gòu)象作為拮抗劑和激動劑轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵點,除了在化合物3 和7 中被觀察到,在其他拮抗劑中同樣有類似的現(xiàn)象。如羥基氟他胺(1,見圖1)在AR-LBD 的Thr877 突變?yōu)锳la877(AR-LBDT877A)時,會由拮抗劑轉(zhuǎn)變?yōu)榧觿?。Bisson 等和Liu 等的常規(guī)MD 模擬、Zhou 等的副本交換MD 模擬同樣顯示,AR-LBDT877A突變導(dǎo)致AR-LBD H12 的構(gòu)象外移,進(jìn)而影響AF2 位點的構(gòu)象,是誘導(dǎo)化合物1 轉(zhuǎn)變?yōu)榧觿┑年P(guān)鍵[32,36-37]。

第2 代拮抗劑面臨類似問題,如AR-LBD 的Phe876 突變?yōu)長eu876(AR-LBDF876L)。由于第2 代拮抗劑與AR-LBD的結(jié)合模式類似于第1代拮抗劑,兩者的藥物轉(zhuǎn)變機(jī)制也類似。如Balbas 等和Liu 等的MD 模擬顯示,AR-LBDF876L導(dǎo)致恩雜魯胺(4)的耐藥與AR-LBD H12 構(gòu)象的變化密切相關(guān)[38-39]。Gim 等[40]對雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT,天然激動劑)、RU59063(AR 激動劑)以及AR 拮抗劑3~ 5 的加速MD 模擬,也進(jìn)一步驗證了ARLBD H12 的動態(tài)波動是拮抗劑和激動劑互相轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。

前述研究在對AR-LBD單體和拮抗劑的模擬中,共同得到了AR-LBD H12 是拮抗態(tài)和激動態(tài)轉(zhuǎn)變的核心結(jié)構(gòu)這一啟示。而隨著AR-LBD 的二聚體晶體結(jié)構(gòu)被解析,基于AR-LBD 二聚體的模擬成為可能,Cavaliere 等[41]提出了不一樣的耐藥機(jī)制。他們構(gòu)建了AR-LBD 二聚體與化合物3 的構(gòu)象,即每個單體都結(jié)合化合物3,2 個單體形成二聚體。MD 模擬研究結(jié)果顯示,化合物3 結(jié)合到AR-LBD 的2 個單體中會導(dǎo)致同源二聚體解離,抑制AR 轉(zhuǎn)錄因子活性而發(fā)揮拮抗活性;但當(dāng)AR-LBDW741L突變發(fā)生,同源二聚體則具有類似激動劑的行為,即2 個單體緊密結(jié)合,這一現(xiàn)象為AR-LBDW741L的耐藥機(jī)制提供了可能的新的解釋。

2.3 微小的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致截然不同的拮抗/激動活性的機(jī)制研究

在AR 的藥物設(shè)計,特別是AR-LBD LBP 的藥物設(shè)計中,微小的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異便會導(dǎo)致截然不同的拮抗和激動活性。為了闡明這一現(xiàn)象的機(jī)制,Nagata 等[42]對DHT 和4 個結(jié)構(gòu)相近(四氫喹啉,8~ 11,見圖4A),但性質(zhì)極為不同的ARLBD LBP 配體進(jìn)行MD 模擬。其中,化合物8 為弱AR 結(jié)合,化合物9 和10 對AR 具有高活性激動效應(yīng),化合物11 則是高效拮抗劑。特別是相較于化合物8,化合物9 增加了羥基從而極大增強(qiáng)了激動活性。硝基轉(zhuǎn)變?yōu)榍杌鶗r(化合物9 轉(zhuǎn)變到化合物11),結(jié)構(gòu)相近的分子從激動劑轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓箘?。模擬結(jié)果顯示,化合物10 的羥基和AR-LBD H3 的Asn705 形成氫鍵相互作用,而形成的氫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定Asp890,進(jìn)而穩(wěn)定H12 的構(gòu)象(見圖4C)。拮抗劑11 則是影響H12 的穩(wěn)定性,達(dá)到拮抗效應(yīng)。

2.4 計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)在環(huán)境污染物機(jī)制預(yù)測中的應(yīng)用

工業(yè)污染、燃燒產(chǎn)物或農(nóng)藥釋放所產(chǎn)生的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)在環(huán)境中持久存在。POPs 的持續(xù)暴露與各種生殖障礙密切相關(guān),如精液質(zhì)量下降、睪丸癌和性別比例失衡等[43-44]。其中,二氯二苯基二氯乙烯(dichlorodiphenyldichloroethylene,p,p'-DDE,12)和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是被最廣泛研究的POPs。化合物12 和13(CB-153)是AR拮抗劑(見圖5),然而,其拮抗機(jī)制尚未得到合理解釋。Xu 等[45]采用分子對接、MD 模擬以及基于MM/GBSA 的結(jié)合自由能預(yù)測研究了化合物12和13 與AR-LBD 的結(jié)合模式和拮抗機(jī)制。作者對幾個潛在結(jié)合位點進(jìn)行了分析,總結(jié)出3 個潛在位點,包括AR-LBD 的LBP,AF2 以及N 端的裂口。

圖5 化合物12~ 17 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 5 Structures of compounds 12 -17

溴系阻燃劑如多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是家用和工業(yè)產(chǎn)品中常用的添加劑,由于這些添加劑長期暴露問題,其代謝產(chǎn)物的毒性問題備受關(guān)注[46]。PBDEs 最常見的代謝產(chǎn)物14 [(羥基-PBDEs(HO-PBDEs)和甲氧基-PBDEs(MeO-PBDEs),見圖5],可在人類血液、海洋生物和野生動物中等被檢測到[46-48]。研究顯示HO-PBDEs和MeO-PBDEs 能夠抑制AR 活性,然而其抑制機(jī)制尚不清楚[49-50]。Wang 等[50]通過細(xì)胞水平實驗檢測、分子對接和MD 模擬相結(jié)合研究了多種HO-PBDEs和MeO-PBDEs 抑制AR 活性的機(jī)制。結(jié)果顯示,ARLBD H12 構(gòu)象的變化是PBDEs 代謝產(chǎn)物具有拮抗活性的重要指標(biāo),為評估PBDEs代謝產(chǎn)物提供了預(yù)測模型。

化合物15(二苯甲酮-1,benzophenone-1,BP-1,見圖5)是常用的紫外線過濾材料之一,廣泛應(yīng)用于化妝品和防曬霜等個人護(hù)理品中。BP-1 殘留物在多種水體如泳池水中被頻繁檢出,對內(nèi)分泌有一定影響但作用機(jī)制尚不明確。為此,Zhan 等[51]研究了BP-1 在泳池中的氯化過程,并通過高斯加速MD 模擬評估了BP-1 氯化產(chǎn)物對AR-LBD 的影響。體外實驗結(jié)果顯示BP-1 在泳池中的氯化產(chǎn)物16(一氯代BP-1)和17(二氯代BP-1)(見圖5)對AR具有抑制作用;MD 模擬顯示兩者通過疏水和非極性相互作用與AR 穩(wěn)定結(jié)合,表現(xiàn)出強(qiáng)于化合物15的拮抗活性。研究結(jié)果提示個人護(hù)理產(chǎn)品會阻斷AR 信號通路,進(jìn)而具有潛在的健康風(fēng)險。

2.5 計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)在共激活劑機(jī)制闡明中的應(yīng)用

共激活劑與AR-LBD 的結(jié)合是AR 調(diào)控男性發(fā)育過程中必不可少的環(huán)節(jié),不同組織中不同的共激活劑與AR-LBD 的結(jié)合導(dǎo)致AR 的構(gòu)象變化進(jìn)而發(fā)揮不同的生理功能[52]。然而,共激活劑和受體兩者結(jié)合的動態(tài)激活機(jī)制尚未明確闡明。

為了探討共激活劑和激動劑協(xié)同結(jié)合AR-LBD的機(jī)制,Xu 等[53]構(gòu)建了AR-apo(無配體的ARLBD)、AR 結(jié)合DHT、AR 結(jié)合類固醇受體共激活劑(steroid receptor coactivator,SRC)、AR 結(jié)合DHT 和SRC 這4 個不同的結(jié)構(gòu)。通過MD 模擬探討共激活劑和激動劑在AR 轉(zhuǎn)錄中潛在的相互作用模式。模擬結(jié)果顯示:1)當(dāng)共激活劑結(jié)合AR-LBD時,會增加AR-LBD 結(jié)構(gòu)的動態(tài)穩(wěn)定性,并誘導(dǎo)增大AR-LBD LBP 位點的體積,促進(jìn)激動劑的結(jié)合(見圖6A);2)類似地,當(dāng)激動劑結(jié)合到AR-LBD 時,會引起AF2 位點區(qū)域的重排,進(jìn)而誘導(dǎo)出適合共激活劑結(jié)合的結(jié)合區(qū)域(見圖6B)。總的來說,激活劑和激動劑兩者結(jié)合AR-LBD是雙向作用,互相促進(jìn)。

圖6 共激活劑和激動劑協(xié)同結(jié)合AR-LBD 的機(jī)制示意圖Figure 6 Schematic diagram of the dynamic communication between coactivators and agonists bound to AR-LBD

為了探討激動劑和拮抗劑與AR-LBD 結(jié)合后對AR-LBD 與共激活劑結(jié)合的影響,Liu 等[54]對多種共激活劑和多種拮抗劑與AR-LBDWT和ARLBDF876L進(jìn)行了MD 模擬,結(jié)果表明不同激動劑和拮抗劑結(jié)合AR-LBD 會調(diào)控與AF2 位點相關(guān)的配體-共激活劑變構(gòu)路徑。自由能計算表明,共激活劑與AR-apo 之間的結(jié)合親和力大于AR 結(jié)合拮抗劑,小于AR 結(jié)合激動劑。此外,AR-LBD 的F876L 突變影響配體-共激活劑的變構(gòu)途徑,可能是點突變誘導(dǎo)拮抗劑(如化合物4)耐藥的重要原因。Jin 等對AR-LBD 結(jié)合激動劑、拮抗劑以及共激活劑的模擬與Xu 等和Liu 等的模擬結(jié)果類似[53-55]。激動劑的結(jié)合促進(jìn)了AF2 位點的構(gòu)象形成,拮抗劑則干擾AF2 位點的形成,進(jìn)而減弱與共激活劑結(jié)合[55]。

研究發(fā)現(xiàn),新型的共激活劑Leupaxin(LPXN)與AR 相互作用,并在前列腺癌的侵襲和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[56]。Khan 等[57]對LPXN 與AR-LBDWT以及臨床常見的突變AR-LBDH874Y,AR-LBDT877A和AR-LBDT877S的相互作用進(jìn)行了MD 模擬研究。結(jié)果表明,LPXN 能與AR-LBDWT以及突變體穩(wěn)定結(jié)合,并且結(jié)合自由能計算結(jié)果顯示AR-LBDWT為(-32.95±0.17)kcal·mol-1,而AR-LBDH874Y,ARLBDT877A和AR-LBDT877S分別為(-36.69±0.11),(-38.78±0.17)和(-41.16±0.12)kcal·mol-1,表明這些突變潛在增加了LPXN 的結(jié)合,從而促進(jìn)前列腺癌侵襲和遷移。

3 計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)在發(fā)現(xiàn)雄激素受體新位點、新母核方面的應(yīng)用

CADD 技術(shù)除了在機(jī)制探索方面被廣泛應(yīng)用,在尋找靶標(biāo)新位點、新母核方面也具有獨特的優(yōu)勢[58-59]。靶標(biāo)新位點的發(fā)現(xiàn)、鑒定以及全新分子的發(fā)現(xiàn),通常需要消耗大量的人力和物力。傳統(tǒng)模式一般是通過生物實驗對實體化合物庫進(jìn)行高通量篩選,以發(fā)現(xiàn)苗頭分子。這種模式雖能有效發(fā)現(xiàn)苗頭分子,但會消耗極大量的資源,并存在高假陽性率問題。隨著靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)被不斷解析,基于CADD 技術(shù)以及融合AI 技術(shù)的結(jié)合口袋探測、基于受體(或配體)的高通量虛擬篩選的應(yīng)用,為制藥行業(yè),特別是新分子發(fā)現(xiàn),帶來了前所未有的變革[59-61]。

如表1 所示,僅對于AR 這一靶標(biāo),就有多個位點和新型母核小分子(18~ 41)的發(fā)現(xiàn)與CADD 技術(shù)密切相關(guān)。以下就CADD 技術(shù)在AR多個位點中的“首次應(yīng)用”加以重點描述,以更好地闡述CADD 技術(shù)在AR 新位點、新分子發(fā)現(xiàn)中的重要作用。

表1 通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)發(fā)現(xiàn)的靶向雄激素受體的小分子拮抗劑Table 1 The small-molecule antagonists of androgen receptor discovered by computer-aided drug design

Axerio-Cilies 等[63]在2011 年報道了通過高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)AR-LBD AF2 位點拮抗劑的研究結(jié)果。通過對約400 萬的ZINC 類藥庫進(jìn)行層級式虛擬篩選、共識打分結(jié)合投票(結(jié)合多種打分技術(shù),構(gòu)象分析等預(yù)測技術(shù)共同優(yōu)選候選分子)、人工挑選相結(jié)合,不斷縮小候選分子的范圍,最終選擇68個分子進(jìn)行活性評價。實驗驗證結(jié)果顯示,6 個化合物具有抑制AR 轉(zhuǎn)錄活性的作用。其中,化合物19 通過與AR-LBD 共晶(PDB 編號:2YHD)驗證了篩選的結(jié)果。

BF3 位點的發(fā)現(xiàn)最早源于高通量篩選發(fā)現(xiàn)的苗頭分子,然而,靶標(biāo)位點親和力不足的問題,促使更多的研究采用不同策略發(fā)掘新型母核和具有更高親和力的分子[64,81]。Lack 等[64]采用與Axerio-Cilies等[63]類似的虛擬篩選策略,最終挑選了213 個候選分子進(jìn)行活性測試,其中化合物20~ 23 通過與AR-LBD 共晶(PDB 編號:2YLP,2YLQ,2YLO,3ZQT)驗證了篩選的結(jié)果。

除了在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)位點的實驗基礎(chǔ)上通過高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)新型母核,在實驗沒有發(fā)現(xiàn)的新位點時,通過CADD 技術(shù),發(fā)現(xiàn)潛在位點,并對發(fā)現(xiàn)的新位點進(jìn)行高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)新型候選分子是CADD 技術(shù)高效優(yōu)勢的重要體現(xiàn)。Li 等[70]通過Molecular Operating Environment 軟件的Site Finder模塊對AR-DBD 區(qū)域進(jìn)行了深入探索,發(fā)現(xiàn)ARDBD 的P-box 區(qū)域與DNA 結(jié)合區(qū)域間存在1 個結(jié)合口袋(見圖2A)。接著,通過高通量虛擬篩選以及對苗頭分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化,最終得到化合物29。由于與上市藥物恩雜魯胺不在同一結(jié)合區(qū)域,因此化合物29 能夠有效抑制恩雜魯胺耐藥細(xì)胞株的增殖。除了在P-box 區(qū)域發(fā)現(xiàn)候選分子,Dalal 等[72]在AR-DBD 的D-box 發(fā)現(xiàn)存在小分子結(jié)合位點(見圖2A),并在該區(qū)域通過高通量虛擬篩選發(fā)現(xiàn)候選分子31(結(jié)構(gòu)未公布),該化合物能夠阻斷AR-DBD的二聚化,并抑制AR 轉(zhuǎn)錄活性。

除了在AR-DBD 區(qū)域利用CADD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)新位點、新分子,F(xiàn)u 等[31]通過CADD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了AR-LBD 區(qū)域的第4 個新位點(DIP 位點,見圖2),并在此基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了全新的高活性候選分子。他們通過MD 模擬和實驗驗證確定了AR-LBD 二聚體易被破壞,而如果有小分子阻斷AR-LBD 二聚化,則可能是靶向治療前列腺癌的新策略。幸運的是,他們發(fā)現(xiàn)了二聚體界面間存在1 個較大的空腔,能夠容納小分子。隨后,他們對商業(yè)化合物庫進(jìn)行了高通量虛擬篩選,并在發(fā)現(xiàn)苗頭分子的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,最終得到具有進(jìn)一步開發(fā)潛力的候選分子41。

4 結(jié)語與展望

CADD 技術(shù)在現(xiàn)代新藥研發(fā)中,特別是在前期發(fā)現(xiàn)階段,在機(jī)制研究、靶標(biāo)新位點、新母核發(fā)現(xiàn)方面,相比經(jīng)典實驗方式具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢。然而,CADD 技術(shù)在不同研發(fā)階段,需要使用不同的方法和技術(shù)。例如,在靶標(biāo)新位點發(fā)現(xiàn)方面,MD 模擬結(jié)合新口袋檢測技術(shù);在動態(tài)檢測新位點方面,相比經(jīng)典實驗更易找到一些變構(gòu)位點以及隱藏的位點;在位點新母核發(fā)現(xiàn)方面,基于受體/配體的發(fā)現(xiàn)方式,結(jié)合多種評分機(jī)制能夠有效篩選大量的化合物數(shù)據(jù)庫,提高苗頭分子發(fā)現(xiàn)的效率;在經(jīng)典位點發(fā)現(xiàn)新母核分子方面,最新的基于大數(shù)據(jù)的分子生成技術(shù),能夠快速生成性質(zhì)相似,但母核結(jié)構(gòu)不一樣的分子,為快速獲得新母核提供了技術(shù)支持;在已有苗頭分子的基礎(chǔ)上,CADD 技術(shù)也提供了相關(guān)的技術(shù)方案,包括高精度自由能計算方法(熱力學(xué)積分和自由能微擾等),以及基于AI 的ADMET 預(yù)測工具,為成藥性開發(fā)提供了技術(shù)支持??傊?,CADD 技術(shù)貫穿新藥研發(fā)的早期研發(fā)階段,是現(xiàn)代新藥開發(fā)不可或缺的輔助技術(shù)。隨著CADD技術(shù)的不斷發(fā)展和實踐應(yīng)用,該技術(shù)對包括AR 在內(nèi)的多個傳統(tǒng)靶標(biāo),以及一些新興潛力靶標(biāo),在未來新藥開發(fā)中必將發(fā)揮舉足輕重的作用。

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