李時勇，韋秋麗，覃瓊慧，李樞妍，陳?；郏纬瑬|，張紅巖，秦 艷，梁 戈，姜明國，申乃坤,

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點實驗室，廣西南寧 530008；2.廣西科學(xué)院，廣西南寧 530007）

作為大宗商品化合物，丁二酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和紡織等領(lǐng)域[1-2]。在食品行業(yè)中，丁二酸可作為風(fēng)味增強劑、強化劑和乳化劑等[3]。同時，丁二酸還是丁內(nèi)酯、己二酸和生物可降解的聚丁烯丁二酸（Polymers butylene succinate,PBS）等重要化學(xué)品的合成前體。預(yù)計到2025 年，全球丁二酸市場可達18 億美元，年復(fù)合增長率為27.4%[4]。目前，丁二酸主要以石油類產(chǎn)品為原料化學(xué)合成法生產(chǎn)，生產(chǎn)過程中需要高溫、高壓反應(yīng)環(huán)境，且排出大量廢液、廢氣。但隨著石化資源的短缺，全球環(huán)境污染的加劇和人們關(guān)于綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展意識的增強，化學(xué)合成法生產(chǎn)受到限制。而微生物發(fā)酵法，具有利用廉價碳源和綠色環(huán)保等優(yōu)點，成為近些年的研究熱點[5]。

丁二酸的生產(chǎn)菌株主要有產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes），產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens），大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等[6-7]。其中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes）因其具有高產(chǎn)丁二酸，固定溫室氣體（CO2）和利用多種碳源等能力，成為最有前景的產(chǎn)丁二酸的菌株之一[8]。先前的研究中，常以葡萄糖為碳源利用A.succinogenes發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，這極大地增加了生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)[9-10]。為降低成本，研究人員探究了以廉價可再生資源（玉米秸稈、甘蔗渣等）替代葡萄糖為碳源來生產(chǎn)丁二酸的方法。Jiang 等[11]以甘蔗渣纖維素水解物為底物，利用A.succinogenesNJ113 發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，丁二酸濃度可達20.0 g/L。在厭氧分批發(fā)酵中，棉花秸稈水解液被用于生產(chǎn)丁二酸，最終丁二酸產(chǎn)量為15.8 g/L，產(chǎn)率為1.23 g/g 葡萄糖[12]。在以玉米纖維為原料的研究中，考察了玉米纖維水解條件對總糖得率的影響，并利用CaCO3中和結(jié)合活性炭吸附的方法去除水解液中的糠醛，最終丁二酸產(chǎn)量可達35.4 g/L，丁二酸產(chǎn)率可達72.5%[13]。以上結(jié)果可知，纖維素原料雖然可以作為碳源生產(chǎn)丁二酸，但其存在預(yù)處理成本高，且丁二酸產(chǎn)量低的缺點，而利用玉米、小麥等糧食原料生產(chǎn)丁二酸會存在“與人爭糧”問題，影響糧食安全。因此，亟需尋找一種含淀粉質(zhì)的“非主糧”類進行丁二酸生產(chǎn)。

甘薯（又叫紅薯，地瓜等）具有易種植，產(chǎn)量大，淀粉含量高（占鮮重15%-30%），價格低等優(yōu)點，是一種理想的微生物發(fā)酵原料[14]。目前，已有許多以甘薯為底物進行生物發(fā)酵的報道，利用甘薯粉和甘薯渣來生產(chǎn)生物能源和有機酸等高附加值產(chǎn)品。Cheng 等[15]對乳酸乳球菌同步糖化發(fā)酵甘薯淀粉產(chǎn)乳酸和乳酸鏈球菌肽進行研究，對淀粉濃度、糖化酶用量等進行了優(yōu)化，最終乳酸和乳酸鏈球菌肽產(chǎn)量分別可達37.06 g/L 和2516.41 IU/mL。在甘薯生產(chǎn)生物乙醇的研究中，釀酒酵母LPB1-93 發(fā)酵100 g 甘薯獲得的乙醇含量可達25.74 g/L[16]。甘薯飲料殘渣和花生殼可以作為底物，利用米曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)動物蛋白飼料，經(jīng)優(yōu)化最終蛋白質(zhì)含量最高可達15.58%[17]。然而，目前關(guān)于A.succinogenes利用甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的報道相對較少。本試驗通過單因素實驗和正交試驗優(yōu)化A.succinogenes發(fā)酵甘薯粉產(chǎn)丁二酸的最佳工藝參數(shù)，同時在2 L 的發(fā)酵罐中進行放大實驗，以期為之后的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes）GXAS137（CCTCCM 2011399）本實驗室前期篩選獲得[18]；甘薯干粉（淀粉含量可達73%以上[19]）市購；耐高溫淀粉酶Liquozyme SC（標(biāo)準(zhǔn)酶活力為120 KNUS/g）、糖化酶Suhong GAⅡ（標(biāo)準(zhǔn)酶活為500 AGU/g）

諾維信（中國）有限公司；丁二酸標(biāo)準(zhǔn)品 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸標(biāo)準(zhǔn)品 分析純，重慶川東化工（集團）有限公司；甲醇 色譜純，美國TEDIA 公司；其他試劑均為分析純或生化試劑；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，酵母粉10，玉米漿5，NaHCO32，NaCl 2，NaH2PO48.5，K2HPO415.5，瓊脂15，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，酵母粉10，玉米漿5，NaHCO32，NaCl 2，NaH2PO48.5，K2HPO415.5，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。初始甘薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘薯粉80，酵母粉 5，玉米漿 10，NaHCO32，MgCl2·6H2O 1，CaCl20.3,MnCl20.06,ZnSO40.06，堿式MgCO370，pH 自然，121 ℃滅菌20 min。

LC100 高效液相色譜儀 上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；Epoch 酶標(biāo)儀 美國Bio Tek 公司；BSP-150 生化培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DG250 小型厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific 公司；BLBIO-XABC-D 2 L 發(fā)酵罐 上海百倫生物科技有限公司；AG25 2.5L 厭氧罐 英國OXOID 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1A.succinogenesGXAS137 種子液的制備 菌株的活化：將甘油保藏管中A.succinogenesGXAS137劃線接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，平板放置于厭氧罐中，37 ℃靜置培養(yǎng)2 d。

種子液的制備：將活化后的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。

1.2.2 甘薯粉的糖化 甘薯粉先糖化后發(fā)酵（Separate hydrolysis and fermentation，SHF）[20]：將甘薯粉與蒸餾水混合，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至5.5，添加高溫淀粉酶，85～90 ℃水浴液化30 min；迅速冷卻，將pH 調(diào)為4.2～4.5，再加入糖化酶，在60 ℃水浴鍋中糖化2 h，最后添加其他營養(yǎng)成分及碳酸鎂，其含量與初始甘薯粉發(fā)酵培養(yǎng)基一致，121 ℃高壓滅菌20 min，接種發(fā)酵。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 甘薯粉濃度的選擇 固定接種量為5%（v/v），MgCO3添加量為70 g/L，液化酶用量為0.376 KNUS/g 底物，糖化酶用量為5.07 AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）為15 g/L，初始甘薯粉濃度為80、90、100、110 和120 g/L，在37 ℃培養(yǎng)48 h，收集1 mL 發(fā)酵液，以12000 r/min 離心10 min 取上清液，用于有機酸含量的測定。每組設(shè)置三個平行。

1.2.3.2 MgCO3添加量的選擇 固定接種量為5%（v/v），底物濃度為100 g/L，液化酶用量為0.376 KNUS/g 底物，糖化酶用量為5.07 AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）為15 g/L，初始MgCO3添加量為30、40、50、60、70 和80 g/L，在37 ℃培養(yǎng)48 h，收集1 mL 發(fā)酵液，以12000 r/min 離心10 min 取上清液，用于有機酸含量的測定。每組設(shè)置三個平行。

1.2.3.3 液化酶用量的選擇 固定接種量為5%（v/v），底物濃度為100 g/L，MgCO3添加量為60 g/L，糖化酶用量為5.07 AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）為15 g/L，初始液化酶用量為0.008、0.037、0.188、0.376 和0.564 KNU-S/g 底物，在37 ℃培養(yǎng)48 h，收集1 mL 發(fā)酵液，以12000 r/min 離心10 min取上清液，用于有機酸含量的測定。每組設(shè)置三個平行。

1.2.3.4 糖化酶用量的選擇 固定接種量為5%（v/v），底物濃度為100 g/L，MgCO3添加量為60 g/L，液化酶用量為0.037 KNU-S/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）為15 g/L，初始糖化酶用量為0、1.69、3.38、5.07 和6.75 AGU/g 底物，在37 ℃培養(yǎng)48 h，收集1 mL 發(fā)酵液，以12000 r/min 離心10 min 取上清液，用于有機酸含量的測定。每組設(shè)置三個平行。

1.2.3.5 氮源種類及濃度的選擇 固定接種量為5%（v/v），底物濃度為100 g/L，MgCO3添加量為60 g/L，液化酶用量為0.037 KNU-S/g 底物，糖化酶用量為1.69 AGU/g 底物，設(shè)定總氮含量為1.4 g/L，分別選取混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2，15 g/L）、混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:3，15.72 g/L）、酵母粉（10.92 g/L）、玉米漿（18.45 g/L）、牛肉膏（10.42 g/L）、蛋白胨（10.75 g/L）、尿素（2.92 g/L）作為氮源，并設(shè)置對照組（不添加任何氮源），在37 ℃培養(yǎng)48 h，收集1 mL發(fā)酵液，以12000 r/min 離心10 min 取上清液，用于有機酸含量的測定。每組設(shè)置三個平行。在最佳氮源的基礎(chǔ)上，其他條件不變，以3、9、15、21、27 和33 g/L 的濃度進行優(yōu)化，選出最適氮源濃度。

1.2.3.6 發(fā)酵時間的選擇 固定接種量為5%（v/v），底物濃度為100 g/L，MgCO3添加量為60 g/L，液化酶用量為0.037 KNU-S/g 底物，糖化酶用量為1.69 AGU/g 底物，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）為27 g/L，發(fā)酵時間為36、48、60、72 和84 h，在37 ℃環(huán)境下進行培養(yǎng)。收集發(fā)酵液離心取上清液，測定有機酸含量。每組設(shè)置三個平行。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對丁二酸發(fā)酵有較大影響的5 個因素：甘薯粉（A）、混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）（B）、液化酶（C）、糖化酶（D）和MgCO3（E）進行優(yōu)化，選用L16（45）正交設(shè)計表進行試驗。正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因子與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

1.2.5 2 L 發(fā)酵罐放大試驗 在2 L 發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，裝液量為1.5 L，所用培養(yǎng)基成分與正交試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基一致。發(fā)酵溫度設(shè)為37 ℃，接種量為5%（v/v），攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min，以0.2 L/min 的通氣量通入100% CO2，發(fā)酵72 h，并對樣品進行測定。

1.2.6 分析測定方法

1.2.6.1 樣品處理 取1 mL 發(fā)酵液12000 r/min 離心10 min，取上清，再使用0.22 μm 孔徑無菌濾膜過濾。

1.2.6.2 有機酸測定 使用高效液相色譜法[21]（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測發(fā)酵液中有機酸含量（丁二酸、乙酸）。其中，乙酸是A.succinogenes丁二酸發(fā)酵時產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，對其含量的檢測有利于了解該菌株利用甘薯粉水解液生產(chǎn)丁二酸的效率。色譜條件為：色譜柱（Ultimate?LP-C18 4.6×250 mm），流動相0.05 mol/L Na2HPO4·12H2O，等度洗脫，pH1.8（使用磷酸調(diào)pH），柱溫22 ℃，進樣量20 μL，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長210 nm。

1.2.6.3 還原糖含量測定 使用3,5-二硝基水楊酸法[22]（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）測定還原糖含量。

1.2.6.4 丁二酸產(chǎn)率的計算 根據(jù)公式（1）計算丁二酸產(chǎn)率，計算公式如下：

式中：C—最終的丁二酸濃度，g/L；C1—經(jīng)甘薯粉糖化后產(chǎn)生的初始糖濃度，g/L。

1.2.6.5 丁二酸生產(chǎn)強度的計算 根據(jù)公式（2）計算丁二酸生產(chǎn)強度，計算公式如下：

式中：C—最終的丁二酸濃度，g/L；t—發(fā)酵過程的總時間，h。

1.2.6.6 糖利用率的計算 根據(jù)公式（3）計算糖利用率，計算公式如下：

式中：C1—經(jīng)甘薯粉糖化后產(chǎn)生的初始糖濃度，g/L；C2—發(fā)酵后的剩余的糖濃度，g/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用Microsoft 2021 Excel 進行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS statistics 21.0 對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性分析，用GraphPad Prism 8 進行圖形的繪制，每個實驗均設(shè)三次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁二酸和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別將不同濃度的丁二酸和乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣，通過HPLC 進行分析。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2 所示。

表2 丁二酸、乙酸的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及決定系數(shù)Table 2 Linear range,standard curve and determination coefficient of succinic acid and acetic acid

2.2 甘薯粉濃度對發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

甘薯粉作為唯一碳源，為菌體的生長和代謝過程提供重要的能量和物質(zhì)。如圖1 所示，隨著甘薯粉濃度的增加，丁二酸產(chǎn)量呈先增后降的趨勢，而副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量也呈增長趨勢。當(dāng)甘薯粉的濃度為100 g/L 時，丁二酸產(chǎn)量最高為42.46 g/L，乙酸產(chǎn)量為11.39 g/L，此時丁二酸/乙酸比值最大為3.73，而對應(yīng)糖濃度為62.91 g/L。當(dāng)甘薯粉濃度過低（低于100 g/L），隨著甘薯粉濃度的增加，丁二酸和乙酸產(chǎn)量呈上升趨勢；當(dāng)甘薯粉濃度過高（超過100 g/L），隨甘薯粉濃度的增加，丁二酸產(chǎn)量呈下降趨勢，而乙酸產(chǎn)量也稍有降低。這可能是當(dāng)甘薯粉濃度過高時，在酶水解作用下產(chǎn)生的糖增加，從而使發(fā)酵液中的滲透壓和粘度升高，導(dǎo)致菌體細(xì)胞失水和萎縮，從而抑制了菌體生長并降低丁二酸的產(chǎn)量[23]。李億等[24]研究也表明，當(dāng)糖濃度超過60 g/L 后會對菌株生長和丁二酸形成產(chǎn)生抑制作用。因此，甘薯粉丁二酸發(fā)酵的適宜濃度為100 g/L。

圖1 甘薯粉濃度對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of sweet potato powder concentration on succinic acid fermentation

2.3 MgCO3 添加量對甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

MgCO3既可以作為pH 中和劑，中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸，使得發(fā)酵液的pH 維持在接近7.0 的范圍內(nèi)，同時在與弱酸（丁二酸、乙酸等）反應(yīng)過程中，產(chǎn)生的CO2可以作為丁二酸合成的底物[25]。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌作為嗜CO2的兼性厭氧菌，在厭氧狀態(tài)下（100%，CO2）有利于丁二酸的生成[26]。此前，Zou 等[27]探究了以MgCO3作為CO2供體對A.succinogenes產(chǎn)丁二酸的影響，結(jié)果表明添加過量MgCO3可以替代氣體CO2作為發(fā)酵所需的唯一CO2供體，為發(fā)酵液提供充足的溶解性的CO2，用于丁二酸的合成。由圖2 可知，丁二酸的產(chǎn)量隨MgCO3添加量的增加呈先增加而后基本保持不變的趨勢，而乙酸產(chǎn)量隨MgCO3添加量的增加呈增長趨勢。當(dāng)MgCO3添加量由30 g/L 增加到60 g/L 時，丁二酸的產(chǎn)量由26.51 g/L 增加到43.57 g/L，丁二酸的產(chǎn)量增加了64.35%，而乙酸產(chǎn)量從10.17 g/L 增加到11.65 g/L。而當(dāng)MgCO3添加量由60 g/L 增加到80 g/L 時，丁二酸濃度并沒有顯著增加（P>0.05），而乙酸產(chǎn)量依舊在增加，這可能是當(dāng)MgCO3添加量超過60 g/L 后，發(fā)酵液中的溶解性CO2濃度達到飽和，即使再增加MgCO3的含量也不會顯著提高丁二酸的產(chǎn)量[27]。因此，MgCO3的適宜添加量為60 g/L。

圖2 MgCO3 添加量對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of MgCO3 addition on succinic acid fermentation

2.4 液化酶對甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

淀粉質(zhì)原料糖化過程中，需要添加適量的液化酶和糖化酶進行雙酶水解。液化酶可以切割淀粉分子間的α-1,4-糖苷鍵，在液化酶的作用下大分子的淀粉物質(zhì)被降解為小分子的α-糊精和糖類，同時降低溶液粘度[28]。從圖3 可以看出，當(dāng)液化酶添加量低于0.037 KNU-S/g 底物時，丁二酸和乙酸的產(chǎn)量隨著液化酶量的增加而增加，而當(dāng)液化酶添加量高于0.037 KNU-S/g 底物時，丁二酸和乙酸濃度隨液化酶量的增加而降低并趨于不變。這是因為當(dāng)液化酶添加量過低時，甘薯淀粉酶解不充分，水解液粘度高，不利于后續(xù)的糖化過程，導(dǎo)致丁二酸含量偏低。而當(dāng)液化酶添加量過高時，過量的液化酶在水解淀粉的過程中，會產(chǎn)生超短鏈分子糖（如麥芽三糖，極限糊精等），這類糖與糖化酶結(jié)合困難，因而無法被糖化酶進一步水解為被菌株利用的葡萄糖，從而影響最終的丁二酸產(chǎn)量[29]。因此，液化酶的適宜用量為0.037 KNU-S/g底物。

圖3 液化酶添加量對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of liquefaction enzyme dose on succinic acid fermentation

2.5 糖化酶對甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

糖化是淀粉水解產(chǎn)生葡萄糖的主要步驟，在糖化酶的作用下將糊精等類低聚寡糖水解為葡萄糖，用于后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的過程[30]。如圖4 所示，當(dāng)糖化酶量低于1.69 AGU/g 底物時，丁二酸和乙酸濃度隨糖化酶添加量的增加而增加，而當(dāng)糖化酶量高于1.69 AGU/g 底物時，丁二酸的產(chǎn)量沒有顯著性差異（P>0.05），而乙酸產(chǎn)量呈先降低后趨于不變的趨勢。這說明當(dāng)糖化酶量過低（低于1.69 AGU/g 底物）時，醪液糖化程度過低，產(chǎn)生的糖不足以供應(yīng)菌體的生產(chǎn)及代謝，因此隨著糖化酶用量的增加，丁二酸的產(chǎn)量也隨之增大。而當(dāng)糖化酶過多時（高于1.69 AGU/g 底物）時，醪液中的低聚糖被充分降解，因而添加更多的糖化酶只會增加發(fā)酵的成本，而不會使丁二酸的產(chǎn)量有顯著增加[31]。因此，糖化酶的適宜用量為1.69 AGU/g底物。

圖4 糖化酶添加量對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of saccharifying enzyme concentration dose on succinic acid fermentation

2.6 氮源對甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

氮源物質(zhì)不僅為微生物提供氮元素，用于合成細(xì)胞中必需的含氮物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等，同時還可為微生物補充生產(chǎn)所需的氨基酸、生物素和煙酸等生長因子[32]。先前的研究表明丁二酸發(fā)酵的最佳氮源是酵母粉，但其價格昂貴，不利于丁二酸的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，因而尋找可替代酵母粉的廉價氮源是非常必要的。如圖5 所示，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）丁二酸產(chǎn)量為45.81 g/L，且乙酸產(chǎn)量為14.28 g/L，與酵母粉相比（丁二酸為47.16 g/L，乙酸為16.47 g/L），丁二酸和乙酸產(chǎn)量沒有顯著性差異（P>0.05），混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:3）的丁二酸產(chǎn)量為41.85 g/L，而單以玉米漿作為氮源時，丁二酸產(chǎn)量僅為27.95 g/L。以尿素為氮源時，丁二酸產(chǎn)量僅有6.81 g/L，略高于對照組（6.54 g/L）。由此可知，雖然玉米漿無法完全替代酵母粉作為氮源，但使用玉米漿與酵母粉作為混合氮源也可以極大的節(jié)約生產(chǎn)成本。在先前的文獻中，Xi 等[33]探究了以玉米漿為氮源取代酵母粉進行發(fā)酵，在含有血紅素的情況下，A.succinogenesNJ113利用 50 g/L 的葡萄糖進行發(fā)酵，最終丁二酸產(chǎn)量可達37.9 g/L，與酵母粉相比，丁二酸產(chǎn)量十分接近。因此，適宜的氮源為混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）。

圖5 不同氮源對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on succinic acid fermentation

在此基礎(chǔ)上，考察不同質(zhì)量濃度（3、9、15、21、27、33 g/L）的混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）對產(chǎn)丁二酸的影響。由圖6 可知，隨著氮源濃度的增加，丁二酸產(chǎn)量呈先增加而后保持不變的趨勢，而副產(chǎn)物乙酸含量呈增加趨勢。當(dāng)?shù)礉舛鹊陀?7 g/L 時，丁二酸和乙酸產(chǎn)量隨氮源濃度的增加而增加，而當(dāng)?shù)礉舛雀哂?7 g/L 時，乙酸濃度依然隨氮源濃度的增加而增加，但丁二酸產(chǎn)量沒有顯著性差異（P>0.05）。因此，100 g/L 甘薯粉經(jīng)雙酶解后產(chǎn)生的糖（82.14 g/L），至少需要添加27 g/L 的混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）才能被完全利用，此時丁二酸濃度可達54.85 g/L。所以，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）的適宜添加量為27 g/L。

圖6 氮源濃度對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of nitrogen source concentration on succinic acid fermentation

2.7 發(fā)酵時間對甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

發(fā)酵時間對于丁二酸和乙酸的產(chǎn)量有顯著（P<0.05）影響，發(fā)酵時間過短（36 h），則菌體對底物代謝不充分，所得目的產(chǎn)物（丁二酸）濃度偏低（45.39 g/L），但發(fā)酵時間過長（高于72 h），既增加生產(chǎn)成本，又降低生產(chǎn)效率。如圖7 所示，當(dāng)發(fā)酵時間低于72 h 時，丁二酸、乙酸含量和糖利用率隨發(fā)酵時間的增加而增加，當(dāng)發(fā)酵72 h 后，丁二酸和乙酸濃度分別為60.74 和19.08 g/L，丁二酸產(chǎn)率為73.23%，糖利用率可達92.82%（糖濃度為82.94 g/L），即使再增加發(fā)酵時間，丁二酸產(chǎn)量和糖利用率基本保持不變（P>0.05）。這可能是由于發(fā)酵72 h 后，培養(yǎng)基中的糖基本被消耗完。因此，適宜的發(fā)酵時間為72 h。

圖7 發(fā)酵時間對丁二酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of fermentation time on succinic acid fermentation

2.8 正交試驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計L16（45）正交試驗，選取對丁二酸發(fā)酵有較大影響的5 個因素：甘薯粉（A）、混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）（B）、液化酶（C）、糖化酶（D）和MgCO3（E）進行優(yōu)化，設(shè)計了16 組實驗，每組設(shè)三個平行重復(fù)。正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 L16（45）正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of L16(45)

表4 A.succinogenes 菌株正交實驗方差分析Table 4 Orthogonal experimental analysis of variance of A.succinogenes strain

極差分析與方差分析表明，A、B、C、D、E 五個因素都達到極顯著水平，各因素主次順序為D>A>C>B>E，即糖化酶添加量>甘薯粉濃度>液化酶添加量>混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）濃度>碳酸鎂添加量。根據(jù)表2 可知，最佳發(fā)酵條件為A4B4C1D3E2，即甘薯粉濃度為115 g/L，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）濃度為33 g/L，液化酶添加量為0.008 KUN-S/g底物，糖化酶添加量為3.09 AGU/g 底物，碳酸鎂添加量為60 g/L。此組合在正交表中，且丁二酸含量最高為69.89 g/L，生產(chǎn)強度為0.97 g/（L·h），經(jīng)優(yōu)化后與初始條件相比（42.46 g/L），丁二酸濃度提高了64.6%。進一步對最優(yōu)組合進行了揺瓶發(fā)酵驗證實驗，丁二酸產(chǎn)量達70.24±0.31 g/L，與正交表中結(jié)果無顯著差異，優(yōu)化結(jié)果可信。在先前報道的利用A.succinogenes發(fā)酵不同廉價碳源（角豆樹豆莢、大型海藻和甘蔗糖蜜）產(chǎn)丁二酸的研究中，丁二酸濃度和生產(chǎn)強度的范圍分別為18.97～55.2 g/L 和0.70～3.9 g/（L·h）[34-36]。與之相比，利用紅薯粉為碳源發(fā)酵有較高的丁二酸產(chǎn)量。所以，甘薯粉可作為A.succinogenes的一種淀粉質(zhì)的“非主糧”類發(fā)酵底物，具有良好的發(fā)展前景。

2.9 2 L 發(fā)酵罐放大試驗

為更好地探究甘薯粉深層發(fā)酵的規(guī)律，在2 L 發(fā)酵罐中進行放大試驗。由圖8 可知，隨著糖的不斷消耗，丁二酸及副產(chǎn)物乙酸濃度在不斷增加。當(dāng)發(fā)酵時間超過64 h 后，丁二酸及乙酸含量基本保持不變，此時葡萄糖基本耗盡。丁二酸的濃度最高可達71.42 g/L，乙酸濃度為18.74 g/L，丁二酸產(chǎn)率可達79.87 %，生產(chǎn)強度0.99 g/（L·h）。相較于在厭氧瓶中培養(yǎng)結(jié)果，丁二酸的濃度和生產(chǎn)強度都有所提高，這可能是由于發(fā)酵過程中連續(xù)泵入的CO2直接滲透到細(xì)胞膜，并與磷酸烯醇式丙酮酸進行羧基化反應(yīng)生成草酰乙酸，隨后草酰乙酸通過還原性三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為丁二酸[37]。同時，發(fā)酵罐的攪拌和混合能力促進了菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，從而提高丁二酸的產(chǎn)量。這為后續(xù)的中試試驗及大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

圖8 甘薯粉發(fā)酵產(chǎn)丁二酸2 L 發(fā)酵罐放大實驗過程曲線Fig.8 Experimental process curve of 2 L fermenter for succinic acid production by fermentation of sweet potato powder

3 結(jié)論

本研究以甘薯粉為底物，對A.succinogenesGXAS 137 發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)參數(shù)分別為：甘薯粉115 g/L，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）33 g/L，液化酶0.008 KUN-S/g 底物，糖化酶3.09 AGU/g 底物，碳酸鎂60 g/L。在最優(yōu)條件下，厭氧瓶中丁二酸濃度可達69.89 g/L，與初始條件相比（42.46 g/L），丁二酸濃度提高了64.6%。之后，在2 L 發(fā)酵罐中進行放大試驗，丁二酸產(chǎn)量最終為71.42 g/L，丁二酸產(chǎn)率可達79.87 %，生產(chǎn)強度0.99 g/（L·h）。以甘薯粉作為底物，具有原料成本低、易獲取、丁二酸產(chǎn)量高等優(yōu)點；此外，混合氮源（酵母粉:玉米漿=1:2）的使用也可以大大的減少生產(chǎn)成本。

我國作為甘薯種植大國，至2014 年以后，每年甘薯產(chǎn)量維持在7000 萬噸以上[38]。其中，甘薯消費結(jié)構(gòu)主要在飼料、鮮食和加工方面，而工業(yè)應(yīng)用不多，尤其是用于丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)。本研究證明甘薯粉可作為A.succinogenes發(fā)酵的優(yōu)良底物，用于丁二酸的生產(chǎn)，具有工業(yè)生產(chǎn)的前景。但是，后續(xù)的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)及中試實驗都未進行，相關(guān)培養(yǎng)條件及參數(shù)還需進一步的研究。