付鎵榕，胡小靜，馬尚玄，王 芳，郭剛軍,，黃克昌，楊?lèi)傃?，賀熙勇,

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪 666100；2.云南省澳洲堅(jiān)果農(nóng)業(yè)工程研究中心，云南景洪 666100；3.文山學(xué)院三七醫(yī)藥學(xué)院，云南文山壯族苗族自治州 663099）

澳洲堅(jiān)果（MacadamiaSPP.）為山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬的常綠喬木果樹(shù)，原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭東南部和新南威爾士東北部沿岸的亞熱帶雨林地區(qū)，別稱(chēng)夏威夷果、澳洲核桃等[1]。澳洲堅(jiān)果果仁蛋白質(zhì)豐富，含量在8%～20%之間[2]，澳洲堅(jiān)果果仁中氨基酸的總含量平均為81.82 mg/g，種類(lèi)齊全，共富含17 種氨基酸，其中包括7 種人體必需氨基酸[3-4]。近年來(lái)，澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，2020 年末我國(guó)澳洲堅(jiān)果種植面積為26.61 萬(wàn)hm2，云南省澳洲堅(jiān)果種植面積為23.53 萬(wàn)hm2，含水量10%的殼果產(chǎn)量為7.50 萬(wàn)噸[5]，澳洲堅(jiān)果油將成為主要的產(chǎn)品形式[6]，榨油后的副產(chǎn)物澳洲堅(jiān)果粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，其含有蛋白質(zhì)32.25%、氨基酸25.05%、脂肪21.11%、膳食纖維20.98%、碳水化合物17.92%、總糖14.50%、還原糖2.80%、粗多糖0.90%[7]。

蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解可獲得許多具有生物功能的生物活性肽，具有降血壓、抗氧化和抑菌等生理活性[4,8-9]。不同蛋白酶作用肽鍵位點(diǎn)的不同，通過(guò)酶解得到的肽段長(zhǎng)度、氨基酸序列不同，致使多肽的分子量、疏水性不同[10-11]，且分子量、疏水性也會(huì)影響多肽的生物活性[12-13]，因此，選擇適宜的酶是制備高活性抗氧化肽的前提條件。蛋白質(zhì)酶解液中含有多糖、游離氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、不同分子質(zhì)量的肽、蛋白質(zhì)等，均會(huì)影響多肽的生物活性，因此需要對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化，文獻(xiàn)研究表明，超濾、納濾、大孔樹(shù)脂吸附等方法可以有效的對(duì)多肽進(jìn)行分離純化[14-16]。目前，利用生物酶法制備澳洲堅(jiān)果多肽，研究其抑菌活性、抗氧化活性的研究已有少量報(bào)道[17]，但有關(guān)不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽組分的分離純化工藝及其抗氧化活性還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究采用了不同蛋白酶水解澳洲堅(jiān)果粕制備多肽，以ABTS+自由基的清除能力為指標(biāo)篩選適宜的蛋白酶，利用大孔樹(shù)脂吸附、超濾分級(jí)技術(shù)進(jìn)行分離純化，通過(guò)測(cè)定不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力及還原能力評(píng)價(jià)其抗氧化能力，旨在篩選得到抗氧化活性較高的多肽組分，為澳洲堅(jiān)果多肽的深度研究及產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕 西雙版納云墾澳洲堅(jiān)果科技開(kāi)發(fā)有限公司；酸性蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）、中性蛋白酶（30 萬(wàn)U/g）、堿性蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）、木瓜蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）、菠蘿蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）、復(fù)配蛋白酶（20 萬(wàn)U/g）南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；DA201-C 大孔樹(shù)脂 鄭州和成新材料科技有限公司；還原型谷胱甘肽 上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）美國(guó)Sigma 公司；氫氧化鈉、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、硫酸等試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 艾卡儀器設(shè)備有限公司；ME204E 型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DLSB-5L 型低溫冷卻液循環(huán)泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UV754N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精風(fēng)儀器有限公司；TGL-16C 型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；FiveEasy 型pH 計(jì)、HS7 型磁力攪拌器、FiveEasy 型電導(dǎo)儀 梅特勒托利多儀器有限公司；114B 型粉碎機(jī) 浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司；DBS-160 型部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；JLCLM9003 型超濾杯 杭州九齡科技有限公司；玻璃層析柱（φ 3.0 cm×30 cm）江蘇三愛(ài)思科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝及蛋白酶的篩選 參照蛋白酶使用說(shuō)明書(shū)及郭剛軍等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定酶解工藝條件如表1 所示。澳洲堅(jiān)果粕的酶解工藝參照郭剛軍等[7]的實(shí)驗(yàn)方法，將液壓壓榨的澳洲堅(jiān)果果粕進(jìn)行粉碎過(guò)60 目篩（孔徑0.25 mm），取篩下物加水調(diào)漿，沸水浴10 min 后冷卻至酶適合溫度，加入蛋白酶并將pH 調(diào)至酶解條件，然后進(jìn)行恒溫酶解，酶解完成后沸水浴15 min 滅酶，冷卻至室溫后4000 r/min 離心20 min，取上清液調(diào)pH 至4.6（澳洲堅(jiān)果蛋白等電點(diǎn)）靜置30 min，4000 r/min 離心10 min，取上清液調(diào)pH 至7.0 為多肽液備用。將多肽液統(tǒng)一濃度為2.0 mg/mL后進(jìn)行ABTS+自由基清除率測(cè)定，篩選出適宜的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果粕的工藝條件Table 1 Enzymatic hydrolysis process conditions of macadamia nut meal by different proteases

1.2.2 多肽濃度的測(cè)定 參照郭剛軍等[18]的方法，采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出吸光值為縱坐標(biāo)（Y），酪蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）的回歸方程為Y=0.0461X+0.0053(R2=0.9995)。將樣液與等體積的10%三氯乙酸（TCA）混合，靜置30 min，在4000 r/min 下離心20 min，以除去不溶性的蛋白質(zhì)和長(zhǎng)肽鏈，取1 mL 上清液于試管中，加入4 mL 雙縮脲試劑，混勻后在室溫下靜置30 min，于540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，代入回歸方程計(jì)算得到上清液中的多肽濃度。

1.2.3 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附純化 用大孔樹(shù)脂對(duì)“1.2.1”水解澳洲堅(jiān)果粕制備的多肽液進(jìn)行脫糖、脫鹽純化。大孔樹(shù)脂采用濕法裝柱，參照張巧智等[19]的方法稍作修改，上樣及水洗脫工藝條件為：上樣流速1 mL/min、上樣濃度15 mg/mL，上樣體積200 mL；水洗脫流速2 mL/min，水洗脫體積400 mL。流出液每10 mL 收集為1 管，測(cè)定總糖、無(wú)機(jī)鹽含量（總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[20]，無(wú)機(jī)鹽含量采用電導(dǎo)儀直接測(cè)定），直至總糖含量及無(wú)機(jī)鹽含量趨于穩(wěn)定。用400 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液進(jìn)行解吸，流速為2 mL/min，解吸液每10 mL 收集1 管，測(cè)定解吸液的多肽濃度判定解吸是否完成，收集的解吸液減壓濃縮后備用。

1.2.4 超濾分級(jí) 將“1.2.3”中經(jīng)大孔樹(shù)脂純化的多肽液用10000、5000、1000 Da 分子量的超濾膜分級(jí)，超濾壓力為0.25 MPa，溫度為25 ℃，得到MNAP-1（Mw>10000 Da）、MNAP-2（5000 Da

1.2.5 澳洲堅(jiān)果多肽的抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定 參照Sethi 等[21]的方法稍作修改。用無(wú)水乙醇配制DPPH 溶液0.2 mmol/L，避光保存。精確量取樣液2 mL 于試管中，加入2 mL 的DPPH 溶液并搖勻，在室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度為A1，用2 mL 無(wú)水乙醇代替DPPH 溶液，測(cè)其吸光度為A2，用2 mL 蒸餾水代替樣液，測(cè)其吸光度為A0。按照公式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A0表示空白組的吸光值；A1表示多肽液的吸光值；A2表示對(duì)照組的吸光值。

1.2.5.2 羥基自由基清除率的測(cè)定 參照Li 等[22]的方法稍作修改。取1 mL 樣液于試管中，加入1 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，啟動(dòng)Fenton 反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，在510 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度為A1；用1 mL 蒸餾水代替H2O2，反應(yīng)后測(cè)其吸光度為A2；用1 mL 蒸餾水替代樣液，反應(yīng)后測(cè)其吸光度為A0。按照公式（1）計(jì)算羥基自由基清除率。

1.2.5.3 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 參照Lu 等[23]的方法稍作修改。將配制好的140 mmol/L 過(guò)硫酸鉀440 μL 加入到25 mL 7 mmol/L 的ABTS 溶液中，得到ABTS+自由基工作液，避光反應(yīng)12～16 h。使用時(shí)，用95%的乙醇稀釋?zhuān)蛊湮舛仍?.7±0.02。取2.85 mL ABTS 稀釋液加入0.15 mL 樣液，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度為A1，2.85 mL ABTS 稀釋液加入0.15 mL 乙醇溶液，測(cè)其吸光度為A0。按照公式（2）計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：A0表示空白組的吸光值；A1表示多肽液的吸光值。

1.2.5.4 還原能力的測(cè)定 參照盧柏山等[24]的方法。量取1 mL 樣液（空白用1 mL 蒸餾水代替，其他試劑依次同下）于燒杯中，依次加入2.5 mL pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后4000 r/min 離心10 min，取2.5 mL 上清液于試管中，依次加入0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和2.5 mL 蒸餾水，搖勻靜置15 min 后在700 nm 波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。吸光度與樣品的還原能力有關(guān)，A 值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.2.5.5 抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算 以樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抗氧化能力為縱坐標(biāo)，計(jì)算得出線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r（r值越接近1，相關(guān)性越好），利用回歸方程計(jì)算50%的清除率對(duì)應(yīng)的樣品濃度為半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）（IC50越小，抗氧化能力越強(qiáng)），回歸方程中的斜率越大則抗氧化能力隨質(zhì)量濃度增加越快[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、處理與計(jì)算線(xiàn)性回歸方程；采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異用多重比較分析（LSD）、單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行處理，P<0.05 表示差異顯著；用皮爾森法（Pearson’s）進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.01 為極顯著性相關(guān)。使用Origin 2021 對(duì)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類(lèi)的篩選

多肽C 端具有大分子疏水性氨基酸會(huì)使其具有較高的抗氧化活性，不同蛋白酶對(duì)肽鍵的作用位點(diǎn)不同，產(chǎn)生的多肽C 端、N 端及相對(duì)分子質(zhì)量不盡相同，所以對(duì)蛋白酶進(jìn)行篩選是極為重要的[26]。如圖1所示，復(fù)配蛋白酶制備的粗多肽對(duì)ABTS+自由基的清除率為96.23%±0.57%，顯著高于其它蛋白酶（P<0.05）；其次是堿性蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶，清除率分別為91.87%±0.76%、91.57%±1.07%、92.46%±0.31%，它們之間差異不顯著（P>0.05）；酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶的清除率最低，分別為88.79%±0.56%、89.24%±0.45%，兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。因此選擇復(fù)配蛋白酶水解制備澳洲堅(jiān)果粗多肽。

2.2 DA201-C 大孔樹(shù)脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的純化效果

2.2.1 大孔樹(shù)脂吸附過(guò)程中多糖和無(wú)機(jī)鹽的變化不同型號(hào)的樹(shù)脂適用于分離不同極性的物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中采用對(duì)多肽吸附能力較好的DA201-C 大孔吸附樹(shù)脂[19]。如圖2 所示，在多肽上樣及蒸餾水洗脫過(guò)程中，流出液的總糖及無(wú)機(jī)鹽含量均為先上升后下降的一個(gè)趨勢(shì)，當(dāng)蒸餾水洗脫體積達(dá)到300 mL 時(shí)，流出液中總糖及無(wú)機(jī)鹽含量分別為0.03、0.16 mg/mL，且趨于穩(wěn)定。

圖2 DA201-C 大孔樹(shù)脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)Fig.2 Dynamic adsorption curve of macadamia nut polypeptides on DA201-C macroporous resin

2.2.2 大孔樹(shù)脂解吸過(guò)程中多肽含量的變化 多肽液經(jīng)吸附平衡、蒸餾水洗滌層析柱除去無(wú)機(jī)鹽和糖類(lèi)物質(zhì)后，用乙醇溶液進(jìn)行解吸，流出液每10 mL 收集為1 管測(cè)定其多肽含量，多肽含量變化曲線(xiàn)如圖3所示。從圖3 可以看出，解吸體積為250 mL 時(shí)，解吸液中多肽濃度小于1.0 mg/mL，且趨于穩(wěn)定。陳麗麗等[27]在利用大孔樹(shù)脂對(duì)草魚(yú)蛋白水解液純化處理中認(rèn)為解吸曲線(xiàn)拖尾的原因是部分多肽組分不能很好的溶解在乙醇溶液中，因此在本實(shí)驗(yàn)中將洗脫體積選擇為400 mL，這樣既能避免多肽的損失保證多肽的回收，也能減少解吸液的體積。DA201-C 大孔樹(shù)脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽具有較好的吸附效果，本研究的純化工藝可用于澳洲堅(jiān)果多肽的純化，可以有效去除酶解液中的多糖和無(wú)機(jī)鹽。

圖3 DA201-C 大孔樹(shù)脂對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽的動(dòng)態(tài)解吸曲線(xiàn)Fig.3 Dynamic desorption curve of macadamia nut polypeptides on DA201-C macroporous resin

2.3 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抗氧化活性

以谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，利用多重抗氧化評(píng)估體系（DPPH、羥基、ABTS+自由基清除率、還原能力）研究不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽的抗氧化活性。

2.3.1 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)DPPH 自由基的清除作用 DPPH 自由基的清除能力廣泛應(yīng)用于研究物質(zhì)的體外抗氧化活性[28]。由圖4 及表2 可見(jiàn)，4 種不同分子量的多肽及谷胱甘肽對(duì)DPPH 自由基均有較強(qiáng)的清除作用，且清除率隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，有較好的量-效關(guān)系。在相同濃度下，MNAP-4的清除能力優(yōu)于MNAP-1、MNAP-2、MNAP-3，4 種不同分子量的多肽對(duì)DPPH 的清除率具有顯著性差異（P<0.05），且均低于谷胱甘肽。在濃度0.2 mg/mL時(shí)，MNAP-4 的清除率最優(yōu)為35.29%±0.13%，其后依次為MNAP-3（34.77%±0.17%）、MNAP-2（32.35%±0.14%）、MNAP-1（30.72%±0.51%）。隨著濃度的增加，MNAP-4 清除率的增加速率高于其它組分及谷胱甘肽。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，MNAP-4 的清除率最優(yōu)為82.55%±0.22%。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)DPPH 自由基清除能力大小順序?yàn)椋汗入赘孰模↖C500.01 mg/mL）>MNAP-4（IC500.36 mg/mL）>MNAP-3（IC500.37 mg/mL）>MNAP-2（IC500.45 mg/mL）>MNAP-1（IC500.55 mg/mL），不同分子量多肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力不同，分子量越小清除能力越強(qiáng)。分子量較小的多肽因其具有較小的空間位阻，能更好的與自由基發(fā)生反應(yīng)，表現(xiàn)出較好的DPPH 自由基清除率，這與不同分子量的核桃、紅花籽多肽的抗氧化活性研究結(jié)果相同，均表現(xiàn)為分子量較小的多肽對(duì)DPPH 自由基清除效果較好[29-30]。

圖4 不同分子量多肽對(duì)DPPH 自由基的清除率Fig.4 Scavenging rates of different molecular weight polypeptides on DPPH radical

表2 不同分子量多肽對(duì)DPPH 自由基清除率的回歸方程分析Table 2 Regression equation on scavenging rates of DPPH radical of different molecular weight polypeptides

2.3.2 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)羥基自由基的清除作用 羥基自由基是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種自由基，是氧自由基中最活潑的自由基，羥基自由基會(huì)引起生物體損傷，羥基自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[31]。從圖5 及表3 可以看出，4 種不同分子量的多肽及谷胱甘肽對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除能力，且清除率與其濃度呈正相關(guān)。MNAP-4 對(duì)羥基自由基的清除率最大，在濃度2.0 mg/mL 時(shí)，MNAP-4 的清除率最優(yōu)為28.78%±0.16%，MNAP-1、谷胱甘肽的清除率最低分別為9.75%±0.56%、10.31%±0.28%，且兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序?yàn)镸NAP-3、MNAP-2、MNAP-4、MNAP-1、谷胱甘肽。當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mg/mL，4 種多肽的清除率均高于谷胱甘肽且具有顯著性差異（P<0.05），MNAP-4 的清除率最優(yōu)為58.50%±0.28%。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)羥基自由基清除能力大小順序?yàn)椋篗NAP-4（IC506.75 mg/mL）>MNAP-3（IC508.37 mg/mL）>MNAP-2（IC5015.35 mg/mL）>MNAP-1（IC5023.94 mg/mL）>谷胱甘肽（IC5054.78 mg/mL），不同分子量多肽對(duì)羥基自由基的清除能力不同，分子量越小清除能力越強(qiáng)，這與桃仁多肽的研究結(jié)果相同[32]，這是由于分子量較小的多肽可阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促使自由基轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的物質(zhì)，表現(xiàn)出更好的羥基自由基清除能力。

圖5 不同分子量多肽對(duì)羥基自由基的清除率Fig.5 Scavenging rates of different molecular weight polypeptides on hydroxyl radical

表3 不同分子量多肽對(duì)羥基自由基清除率的回歸方程分析Table 3 Regression equation on scavenging rates of hydroxyl radical of different molecular weight polypeptides

2.3.3 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽對(duì)ABTS+自由基的清除作用 ABTS+自由基清除率廣泛運(yùn)用于體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)[33-34]。由圖6 及表4 可見(jiàn)，4 種不同分子量的多肽及谷胱甘肽對(duì)ABTS+自由基的清除能力均隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增大。MNAP-4、谷胱甘肽的清除率高于MNAP-1、MNAP-2、MNAP-3，濃度為0.2、0.4 mg/mL 時(shí)，4 種不同分子量多肽的清除率低于谷胱甘肽，MNAP-2 與MNAP-3 的清除率無(wú)顯著差異（P>0.05）。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序?yàn)镸NAP-3、MNAP-2、MNAP-1、MNAP-4、谷胱甘肽。當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mg/mL 時(shí)，MNAP-4 的清除率為93.25%±0.25%，高于谷胱甘肽的清除率91.37%±0.08%。當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，MNAP-4 的清除率為97.05%±0.18%優(yōu)于其它評(píng)價(jià)樣品，MNAP-2 與MNAP-3 的清除率分別為88.14%±0.42%、89.47%±0.58%，兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對(duì)ABTS+自由基清除能力大小順序?yàn)椋汗入赘孰模↖C500.00003 mg/mL）>MNAP-4（IC500.08 mg/mL）>MNAP-2、MNAP-3（IC500.24 mg/mL）>MNAP-1（IC500.45 mg/mL），MNAP-4對(duì)ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng)，這可能是由于ABTS+自由基是一種親水性自由基，分子量小的多肽的親水性較好，更易與ABTS+自由基發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出更好的ABTS+自由基清除能力，這與油茶餅粕多肽的研究結(jié)果相同[35]。MNAP-2、MNAP-3 的清除能力相近，這可能是由于MNAP-2、MNAP-3 兩者的親水性相似，導(dǎo)致兩者對(duì)ABTS+自由基的清除能力相近[36]。

圖6 不同分子量多肽對(duì)ABTS+自由基的清除率Fig.6 Scavenging rates of different molecular weight polypeptides on ABTS+ radical

表4 不同分子量多肽對(duì)ABTS+自由基清除率的回歸方程分析Table 4 Regression equation on scavenging rates of ABTS+radical of different molecular weight polypeptides

2.3.4 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽還原能力分析 還原能力是指其將Fe3+還原為Fe2+的能力，也是評(píng)估抗氧化活性的重要指標(biāo)之一，吸光值越大還原力越強(qiáng)[37]。從圖7 及表5 可以看出，不同分子量的多肽及谷胱甘肽均具有還原能力，還原能力與濃度呈正相關(guān)。MNAP-4 的還原能力優(yōu)于MNAP-1、MNAP-2、MNAP-3 及谷胱甘肽。在濃度2.0 mg/mL 時(shí)，MNAP-4的還原能力為0.366±0.001，優(yōu)于其它評(píng)價(jià)樣品，谷胱甘肽還原能力最弱為0.224±0.002。隨著濃度的增加，還原能力的增加速率大小順序?yàn)镸NAP-4、MNAP-3、谷胱甘肽、MNAP-1、MNAP-2。當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mg/mL 時(shí)，4 種不同分子量多肽的還原能力均優(yōu)于谷胱甘肽，MNAP-4 的還原能力最優(yōu)為1.006±0.003，MNAP-1、MNAP-2 的還原能力分別為0.880±0.005、0.885±0.003，兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。從評(píng)價(jià)樣品對(duì)自由基清除能力的IC50值來(lái)看，不同分子量多肽及谷胱甘肽還原能力大小順序?yàn)椋篗NAP-4（IC503.19 mg/mL）>MNAP-2（IC503.45 mg/mL）>MNAP-3（IC503.61 mg/mL）>MNAP-1（IC504.08 mg/mL）>谷胱甘肽（IC504.35 mg/mL），MNAP-4 表現(xiàn)出最強(qiáng)的還原能力，這是由于肽段越短使具有較多電子的基團(tuán)暴露越充分，因此還原能力最強(qiáng)，這與松仁、核桃、桃仁等多種植物蛋白的研究結(jié)果相同[16,29,32]。而分子質(zhì)量相對(duì)較高的MNAP-2 可能是因?yàn)榫哂休^多電子致密的基團(tuán)暴露在外，轉(zhuǎn)移電子的能力也較強(qiáng)而表現(xiàn)出高于MNAP-3 的還原能力[32]。

圖7 不同分子量多肽的還原能力Fig.7 Reducing power of different molecular weight polypeptides

表5 不同分子量多肽還原能力的回歸方程分析Table 5 Regression equation on reducing power of different molecular weight polypeptides

2.4 不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽與抗氧化活性相關(guān)性分析

用皮爾森法（Pearson’s）對(duì)不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽與抗氧化活性指標(biāo)的IC50值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如表6 所示，不同分子量澳洲堅(jiān)果多肽與清除DPPH 自由基（r=0.947，P<0.01）、羥基自由基（r=0.964，P<0.01）、ABTS+自由基（r=0.948，P<0.01）及還原能力（r=0.856，P<0.01）之間存在極顯著相關(guān)。多肽分子量的大小對(duì)其抗氧化活性影響巨大，結(jié)合2.3 中的分析可知分子量小于1000 Da 的澳洲堅(jiān)果多肽抗氧化活性最好，這可能是分子量小的多肽空間位阻較小，活性基團(tuán)（巰基、酚羥基）暴露，更好的與自由基發(fā)生反應(yīng)，表現(xiàn)出更好的抗氧化活性。Feng 等[38]認(rèn)為多肽的抗氧化活性與分子量大小、氨基酸組成種類(lèi)及排列順序有關(guān)，Lin 等[39]研究水解蛋清蛋白發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1000 Da 的組分抗氧化活性明顯高于其他分子質(zhì)量組，Zou 等[40]發(fā)現(xiàn)的不同來(lái)源的42 種抗氧化肽在1000 Da 以下的3～6 肽具有更好的自由基清除活性。

3 結(jié)論

本文研究了不同蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果粕的ABTS+自由基清除能力，采用DA201-C 大孔吸附樹(shù)脂、超濾分級(jí)等技術(shù)對(duì)澳洲堅(jiān)果多肽進(jìn)行分離純化得到不同分子量多肽，考察其清除DPPH、羥基、ABTS+自由基能力及還原能力，分析得出不同分子量多肽與抗氧化活性之間存在顯著相關(guān)性。篩選得到了抗氧化活性高的多肽組分MNAP-4（Mw<1000 Da），后續(xù)可對(duì)其進(jìn)一步純化，研究其多肽結(jié)構(gòu)及體內(nèi)抗氧化活性，為新型抗氧化肽功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，促進(jìn)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。