古麗米熱·阿巴拜克日，帕爾哈提·柔孜，則拉萊·司瑪依，阿力木·阿布都艾尼，曹 博，楊曉君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

動(dòng)物骨骼是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的天然資源，含有蛋白、脂肪、軟骨素以及礦物質(zhì)等成分，且骨蛋白水解物中包括了人體所需的必需氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白來源[1]。近年來，從海洋動(dòng)物和陸生動(dòng)物副產(chǎn)物骨骼中制取膠原蛋白和制備活性多肽，并將其用于保健品和化妝品領(lǐng)域的研究逐漸深入，這對(duì)全產(chǎn)業(yè)鏈的增值帶來便利。同時(shí)，骨骼提取物在降血壓、免疫調(diào)節(jié)、骨病治療、抗菌、抗氧化等活性[2-4]方面的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了相關(guān)功能產(chǎn)品的研發(fā)和上市。隨著保健食品加工技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的學(xué)者關(guān)注著動(dòng)物骨類蛋白肽與相關(guān)產(chǎn)品的生物活性及應(yīng)用方面的研究。因此，建立骨骼蛋白高值化利用技術(shù)評(píng)價(jià)體系，優(yōu)化有效成分制備工藝，提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量在畜牧副產(chǎn)物循環(huán)利用、健康產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)鏈的升級(jí)等領(lǐng)域具有重要的意義。

較多研究表明動(dòng)物骨骼含有豐富的活性膠原蛋白，且不同的畜禽骨骼含有的膠原蛋白含量有一定的差異。劉泓等[5]研究發(fā)現(xiàn)牦牛腿骨、黃牛腿骨、豬腿骨及雞腿骨富含活性蛋白，蛋白含量在79.18%～90.43%范圍內(nèi)。張巖[6]研究得出，經(jīng)過胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解得到的魷魚多肽分子量小于經(jīng)過氨肽酶水解得到的魷魚多肽，且抗氧化能力較強(qiáng)。由于膠原蛋白的分子量較大，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，導(dǎo)致其攝入人體后難以發(fā)揮本有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能[7]。因此需要對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿附?，從而降低分子量。酶解法制備肽被譽(yù)為21 世紀(jì)營(yíng)養(yǎng)革命的潛在觸發(fā)器[8]。酶解法具有溫和、可控、周期短等特點(diǎn)，能滿足食品經(jīng)濟(jì)發(fā)展和環(huán)保的工藝要求，對(duì)膠原蛋白的破壞作用相對(duì)較少，而且可維持所得膠原蛋白肽的活性。通過酸溶酶法及超聲輔助酶法制備的牛骨膠原肽均顯出較強(qiáng)的抗氧化活性[9]。同時(shí)，多項(xiàng)研究已證實(shí)動(dòng)物來源骨膠原蛋白及肽具有較好的理化性質(zhì)和抗氧化活性，在食品工業(yè)加工中具有較好的應(yīng)用潛力。然而多數(shù)食藥加工業(yè)通常使用全骨，未能將骨質(zhì)和骨髓有效地分離，并且動(dòng)物骨髓有效成分的針對(duì)性研究尚處于初步階段。本課題組前期比較了牛骨質(zhì)及骨髓的營(yíng)養(yǎng)成分，得出牛骨髓蛋白含量顯著高于其骨質(zhì)蛋白，牛骨髓蛋白中的氨基酸含量高達(dá)466.24 mg/g[10]，且含有豐富的Na、K、Ca、P、Mg 等常量元素及Fe、Zn 等微量元素[11]。目前，較多的研究集中于牛骨膠原蛋白肽的制備及生物活性研究，而對(duì)牛骨髓膠原蛋白肽的針對(duì)性研究仍然較少。

為了進(jìn)一步提高牛骨的綜合利用率及附加值，本文以牛骨髓為原料，以水解度、蛋白含量、DPPH·清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合結(jié)構(gòu)表征篩選出酶解牛骨髓蛋白的最佳酶種，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，并對(duì)其酶解物的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行研究，為后期分離純化、肽序列鑒定及其食藥功能的開發(fā)等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍牛骨 購買于新疆阿勒泰地區(qū)，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院巴吐爾·阿不力克木教授鑒定為新疆褐牛腿骨；牛血清蛋白E-BC-K318-M Elabscience 公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基自由 上海麥克林生化科技公司；堿性蛋白酶（400 U/mg）、胃蛋白酶（300 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）華邁科公司；花生油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；所有有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FA1004 電子天平 常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；PHS-3CB pH 計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司；BCD-208JDE 冷藏冷凍箱 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；SF-TDL-40D 離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器股份有限公司；XHF-DY 高速分散器 寧波新芝生物有限公司；TGL-16M 高度冷凍離心機(jī) 湖南湘鑫儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 取出冷凍的牛骨，用鋸骨器將牛骨切開，初步洗凈，除去骨髓中的殘留碎片和多余的肉渣并洗去多余的血跡，將所得的牛骨髓冷凍至-20 ℃下硬化，再放置于搗藥罐中按照1:6（g/mL）的固液比加入液氮進(jìn)行冷凍粉碎，粉末保存在-40 ℃冰箱，備用。

1.2.2 牛骨髓蛋白（Bovine bone marrow protein，BBMP）的提取 參照文獻(xiàn)[12]并略作修改，取100 g牛骨髓粉末，以蒸餾水作為溶劑提取BBMP，用磁力攪拌器在45 ℃回流提取3 次，三次提取料液比及提取時(shí)間分別為1:10、1:7、1:5 g/mL 及2、1、0.5 h，合并提取液。用分液漏斗分離油水層，收集水層，用石油醚脫脂3 次，水溶液經(jīng)適當(dāng)濃縮，透析（3500 Da，48 h），真空冷凍干燥得到牛骨髓蛋白粉末。

1.2.3 酶的篩選 參照文獻(xiàn)[9]并略作修改，稱取200 mg 牛骨髓蛋白粉末，加蒸餾水100 mL，再分別加入四種蛋白酶，酶加量均為2%，于各自最適水解條件水解2 h，各蛋白酶的水解條件見表1。待酶解結(jié)束，沸水滅酶15 min，冷卻，pH 調(diào)到7，4000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定其各酶解液的水解度、蛋白含量及DPPH·清除率，通過綜合評(píng)分選擇適宜的酶。

表1 不同蛋白酶水解實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Experimental conditions for different proteases

1.2.4 結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 紫外光譜（Ultraviolet Spectroscopy，UV）分析 將1 mg/mL 的牛骨髓蛋白酶解物溶液在室溫條件下用紫外分光光度計(jì)于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以蒸餾水為空白對(duì)照[13]。

1.2.4.2 紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 取少量牛骨髓蛋白酶解物，與適量溴化鉀混合，用壓片法測(cè)定其4000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜[13]。

1.2.4.3 SDS-PAGE 分析 將20 mg/mL 的牛骨髓蛋白酶解物溶液與4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液3:1 比例混合后煮沸5 min，冷卻后將15 μL 上樣。分離膠15%，濃縮膠5%，采用直壓恒流電源，75 V 開始，在分離0.5 h 后，將電壓調(diào)節(jié)到120 V。結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色2 h，脫色至透明后，拍照并進(jìn)行觀察分析[13]。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 按照酶種篩選結(jié)果得出胃蛋白酶為最佳酶種，固定因素水平為酶解時(shí)間2 h，加酶量2%，pH2，酶解溫37 ℃，在上述工藝條件下，通過測(cè)定酶解液的水解度、蛋白含量及DPPH·清除率來研究酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）、pH（1、2、3、4、5）、酶解溫度（27、32、37、42、47 ℃）等因素對(duì)牛骨髓蛋白酶解效果的影響，重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以酶解時(shí)間（A）、加酶量（B）、pH（C）、酶解溫度（D）為變量，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Response surface test factors and levels

1.2.7.1 水解度的測(cè)定 采用甲醛電位滴定法[14]測(cè)定水解度。吸取10 mL 滅酶后的水解液于燒杯中，加5 滴30%過氧化氫。將燒杯置于磁力攪拌器上，將pH 計(jì)的電極插入燒杯內(nèi)試樣中適當(dāng)位置。先用0.1 mol/L 氫氧化鈉緩慢調(diào)節(jié)pH 至7.5 左右，再用0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH=8.10，并且保持1 min 不變。再緩慢加入15 mL 甲醛溶液，反應(yīng)1 min，用0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH=8.10。記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的體積（V1）。按下式（1）計(jì)算水解度：

式中：V1為1 mL 水解液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；V0為1 mL 空白液消耗的氫氧化鈉溶液體積，mL；V 為配料用水體積，mL；C 為滴定用氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；14.01 為氮的摩爾質(zhì)量，g/mol；6.25 為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；M 為牛骨髓蛋白水解產(chǎn)物的質(zhì)量，g；pro 為牛骨髓蛋白水解產(chǎn)物的蛋白含量，%。

1.2.7 指標(biāo)測(cè)定

1.2.7.2 蛋白含量的測(cè)定 1 mL 不同濃度的（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）牛血清蛋白質(zhì)溶液中分別加入3 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液，避光靜置反應(yīng)5 min，在595 nm 處測(cè)吸光度。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]，得到回歸方程：Y=1.0139X+0.692（R2=0.9996）。取濃度為1 mg/mL的樣品溶液，按照上述蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)步驟測(cè)定其蛋白含量。

式中：C1是樣品起始濃度，mg/mL；C2是供試品溶液中蛋白濃度，mg/mL。

1.2.7.3 抗氧化活性的測(cè)定 BBMP-PH 對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+自由基清除率及總還原能力的測(cè)定采用文獻(xiàn)[16-17]的方法，以維生素C 為對(duì)照品。

1.2.7.4 綜合評(píng)分的計(jì)算 基于綜合評(píng)分選擇適宜的酶，由于貢獻(xiàn)值大小未知，因此綜合評(píng)分設(shè)定總值為100%，水解度為主要考察指標(biāo)占50%，蛋白含量占25%，DPPH·清除率占25%。按下式（3）～（6）計(jì)算綜合評(píng)分：

1.2.7.5 等電點(diǎn)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取牛骨髓蛋白酶解物10 mg 于離心管中，溶解于10 mL 蒸餾水，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別調(diào)pH（2、4、6、8、10、12），測(cè)定不同pH 條件下BBMPPH 在660 nm 處的透光率，繪制pH 與透光率的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖[18]。

1.2.7.6 溶解性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取牛骨髓蛋白酶解物10 mg 于離心管中，溶解于10 mL 蒸餾水，加入鹽酸（0.5 mol/L）或氫氧化鈉（0.5 mol/L）分別調(diào)pH（2、4、6、8、10、12），混合6 min，離心（3500 r/min）25 min，測(cè)定上清液蛋白含量，按下式（7）計(jì)算溶解性[18]。

式中：M1：懸浮液中加入的蛋白含量；M2：離心后上清液蛋白含量。

1.2.7.7 蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]測(cè)定其BBMP-PH 的乳化性（EAI）與乳化穩(wěn)定性（ESI）。準(zhǔn)確稱取牛骨髓蛋白酶解物10 mg 于燒杯中，加入10 mL 蒸餾水，分別將溶液pH 調(diào)至2、4、6、8、10、12，再加5 mL 花生油，10000 r/min的條件下高速均質(zhì)2 min。分別在0 min（A0）和靜置10 min（A10）時(shí)從燒杯底部取50 μL 乳濁液與5 mL SDS（1%）溶液混合均勻，在500 nm 處測(cè)定吸光度。用式（8）、式（9）計(jì)算EAI 和ESI[18]：

式中：DF為樣品稀釋倍數(shù)；C 為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；Φ為光程，設(shè)定為0.01；θ為乳狀液的油體積分?jǐn)?shù)，0.25。

1.2.7.8 持水性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取10 mg 牛骨髓蛋白酶解物記錄為m0，將樣品稱入離心管中記錄重量為m1，加10 mL 蒸餾水溶解，將溶液pH 分別調(diào)至2、4、6、8、10、12，漩渦混合6 min 并于30 ℃恒溫箱恒溫30 min，離心（4000 r/min、30 min），除去上層清液，稱重記為m2，按下式（10）計(jì)算持水性[19]。

1.2.7.9 持油性的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取10 mg 牛骨髓蛋白酶解物記錄為m0，將樣品稱入離心管中記錄重量為m1，加入10 mL 花生油，再漩渦混合5 min，直到樣品持油量達(dá)到飽和，靜置30 min，離心（4000 r/min、20 min），將上清液的油去掉，稱離心管重量記為m2，按下式（11）計(jì)算持油性[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，采用SPSS 26.0、Origin 9.0、Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選結(jié)果

2.1.1 不同酶對(duì)牛骨髓蛋白酶解效果的影響 由表3可知，牛骨髓蛋白通過四種蛋白酶進(jìn)行酶解，結(jié)果表明胃蛋白酶水解物的水解度達(dá)到31.68%，顯著高于木瓜蛋白酶水解物和中性蛋白酶水解物（P<0.05），可能是由于不同蛋白酶對(duì)肽鍵的作用部位不同，所以酶解產(chǎn)物的水解度有所不同[9]；堿性蛋白酶水解物的蛋白含量達(dá)到38.91%，顯著高于胃蛋白酶水解物和中性蛋白酶水解物（P<0.05）；胃蛋白酶水解物的DPPH·清除率達(dá)到29.85%，顯著高于其它三種蛋白酶（P<0.05）。代亞民[20]采用胃蛋白酶酶解牛骨蛋白，水解度僅為14.4%。因此，根據(jù)綜合評(píng)分初步確定胃蛋白酶為最適用酶。

表3 不同蛋白酶對(duì)牛骨髓蛋白酶解效果的影響Table 3 Effect of protease type on hydrolysis efficiency

2.1.2 紫外光譜分析 四種蛋白酶水解物的紫外掃描圖譜如圖1 所示。四種蛋白酶水解物分別在229、230、223、237 nm 處有最大的吸收峰，均符合膠原蛋白肽的特征吸收峰，280 nm 附近也有微弱的吸收峰，說明牛骨髓膠原肽含有一定的酪氨酸[18]。綜上，四種蛋白酶能夠有效酶解牛骨髓蛋白。

圖1 牛骨髓蛋白酶解物的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectra of BBMP hydrolysates

2.1.3 傅里葉紅外光譜分析 FT-IR 是一種常用于闡明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)官能團(tuán)的定性分析技術(shù)[17]，四種蛋白酶水解物的FT-IR 光譜圖如圖2 所示。

圖2 牛骨髓蛋白酶解物的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of BBMP hydrolysates

圖2 可知，四種蛋白酶水解物均在4000～400 cm-1呈現(xiàn)出蛋白類化合物的特征吸收峰，在3200～3300 cm-1處附近均出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，是典型的因N-H 伸縮振動(dòng)形成的酰胺A 帶的特征峰；出現(xiàn)在2900～2950 cm-1處的吸收峰是因C-N 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的酰胺B 帶的特征峰，分別在2924.21、2918.29 cm-1處有吸收峰；1600～1700 cm-1處歸屬于蛋白酰胺Ⅰ帶的吸收峰，由C=O 的伸縮振動(dòng)引起，四種蛋白酶水解物的酰胺Ⅰ帶分別在1655.79 和1650.21 cm-1；1540 和1450 cm-1左右出現(xiàn)的振動(dòng)是酰胺II 帶，是由N-H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)和C-N 鍵的伸縮振動(dòng)引起的；在1380.86 和1388.74 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是因C-N 伸縮振動(dòng)引起的酰胺Ⅲ帶，1239.74 和1236.37 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是因N-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)引起的酰胺Ⅲ帶。同時(shí)，1646～1664 cm-1處的吸收峰為α螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。綜上，牛骨髓蛋白四種蛋白酶水解物均顯出了典型的蛋白吸收峰。

2.1.4 SDS-PAGE 凝膠電泳分析結(jié)果 牛骨髓蛋白及其四種蛋白酶水解物的SDS-PAGE 結(jié)果如圖3所示。如圖所示，BBMP 及其水解物的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在4.1～66.0 kDa。其中，水提蛋白的分子量較大，集中在66.0 kDa 左右，也有10 kDa 左右的亞基。經(jīng)酶解處理后，胃蛋白酶水解物分子量降低較明顯，肽段亞基降低到4.1～14.4 kDa 處，主要在10 kDa 以下較為集中。尹玉文等[21]對(duì)骨膠蛋白酶處理的牛骨制備酶解液，電泳顯示其分子量為7.8～20.1 kDa，本實(shí)驗(yàn)得出經(jīng)胃蛋白酶處理后能夠得到分子量更小的牛骨髓膠原多肽。

圖3 牛骨髓蛋白及其酶解物的SDS-PAGE 凝膠電泳圖Fig.3 SDS-PAGE profile of BBMP and its hydrolysates

因此，經(jīng)結(jié)合不同酶種對(duì)水解度、蛋白含量、DPPH·清除能力的影響及UV、FT-IR、SDS-PAGE結(jié)果，得出胃蛋白酶能夠更有效的制備分子量較低的牛骨髓膠原肽。綜上，進(jìn)一步選用響應(yīng)面法優(yōu)化BBMP 的胃蛋白酶酶解工藝，為其生產(chǎn)應(yīng)用能提供依據(jù)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)BBMP 酶解效果的影響 由圖4A所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，在1～2 h 范圍內(nèi)蛋白含量、DPPH·清除率和水解度不斷增加，當(dāng)酶解時(shí)間為2 h 時(shí)，蛋白含量、DPPH·清除率及水解度分別為34.11%、27.47%、32.83%達(dá)到最高值（P<0.05）。此后，各指標(biāo)緩慢下降，可能由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致酶失活。因此，選擇1～3 h 作為響應(yīng)面分析的最佳時(shí)間范圍。

圖4 酶解時(shí)間、加酶量、pH、酶解溫度對(duì)BBMP酶解效果的影響Fig.4 Effects of time,enzyme concentration,pH and enzymatic hydrolysis temperature on the hydrolysis efficiency of BBMP

2.2.2 加酶量對(duì)BBMP 酶解效果的影響 由圖4B所示，隨著加酶量的增加，蛋白含量、DPPH·清除率和水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，加酶量達(dá)到2%時(shí)蛋白含量、DPPH·清除率及水解度分別為31.64%、23.40%、30.44% 達(dá)到最高值（P<0.05）。酶加量過高時(shí)可能導(dǎo)致酶解物的進(jìn)一步降解。因此，選擇1%～3%作為響應(yīng)面分析的最佳酶用量范圍。

2.2.3 pH 對(duì)BBMP 酶解效果的影響 由圖4C 所示，酶解物的蛋白含量、DPPH·清除率和水解度隨著pH 的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，pH 為3 時(shí)蛋白含量、DPPH·清除率及水解度分別為34.86%、27.64%、32.45% 達(dá)到最高值（P<0.05）。此后隨著pH 增加各指標(biāo)逐漸降低。因此，選擇pH2～4 作為響應(yīng)面分析的最佳pH 范圍。

2.2.4 酶解溫度對(duì)BBMP 酶解效果的影響 由圖4D所示，隨著酶解溫度的升高，酶解物蛋白含量及DPPH·清除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，水解度呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)蛋白含量、DPPH·清除率及水解度分別為35.28%、30.83%、33.81% 達(dá)到最高值（P<0.05）。考慮到溫度的升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性及酶失活，選擇溫度為32～42 ℃作為響應(yīng)面分析的最佳溫度范圍。

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面優(yōu)化酶法制備牛骨髓膠原蛋白工藝試驗(yàn)結(jié)果見表4。水解度、蛋白含量和抗氧化活性是蛋白酶解的重要屬性，對(duì)上述3 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮，分別以水解度、蛋白含量及DPPH·清除率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.5、0.25、0.25 得出綜合評(píng)分。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design with experimental results

2.3.2 方差分析 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表4 中綜合評(píng)分的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程Y=91.55+2.81A–4.79B-0.096C+0.68D+0.42AB+0.13AC+1.60AD+0.86BC-0.18BD-3.44CD-19.88A2-18.19B2-21.06C2-18.71D2。

綜合評(píng)分回歸方程方差分析結(jié)果見表5，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著，回歸系數(shù)R2=0.9203，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值所建立的酶法制備牛骨髓膠原肽工藝模型是合理的。通過方差分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，B、A2、B2、C2、D2均對(duì)Y 影響顯著（P<0.05），表明酶解時(shí)間、酶添加量、pH、酶解溫度對(duì)酶法制備牛骨髓膠原蛋白的水解度、蛋白含量及DPPH·清除率均有一定的影響。F值的大小反映因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)（因變量）的重要程度為，F(xiàn)B>FA>FD>FC。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

各因素影響綜合評(píng)分的交互作用見圖5。圖5中酶解時(shí)間、酶添加量、pH、酶解溫度兩兩交互作用的等高線接近橢圓，說明交互作用明顯。

圖5 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of different variables on comprehensive score of BBMP-PH

2.3.3 最優(yōu)工藝確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件分析，最終得到最優(yōu)酶解工藝為酶解時(shí)間2.04 h、酶添加量1.92%、pH2.95、酶解溫度37.23 ℃，此時(shí)預(yù)測(cè)的水解度、蛋白含量及DPPH·清除率分別為35.47%、37.68%及37.13%?？紤]到實(shí)際運(yùn)用時(shí)的可操作性，將酶解工藝參數(shù)修正為酶解時(shí)間2 h、酶添加量2%、pH3、酶解溫度37 ℃，做3 次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到的水解度為36.07%±1.17%、蛋白含量為37.05%±1.29%、DPPH·清除率為39.57%±1.69%，此結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，說明水解度、蛋白含量及DPPH·清除率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)胃蛋白酶酶解牛骨髓蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是行之有效的。

2.4 牛骨髓蛋白酶解物的理化特性

2.4.1 等電點(diǎn)分析 膠原蛋白是一種兩性電解質(zhì)，等電點(diǎn)與其結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，尤其是與其側(cè)鏈上的酸性和堿性氨基酸數(shù)量有關(guān)[22]。膠原蛋白在等電點(diǎn)時(shí)，分子之間沒有靜電排斥，導(dǎo)致溶液的渾濁程度增加，透光率降低[16]。如圖6A 所示，BBMP-PH 在不同的pH 條件下透光率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)pH 為6 時(shí)最低為19.57%。因此，可初步推斷BBMPPH 的等電點(diǎn)在pH6 左右。馮建慧等[23]研究報(bào)道采用酸法和酶法提取的鰱魚魚皮和魚骨膠原蛋白的等電點(diǎn)在pH6.7 左右，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖6 BBMP-PH 的理化特性研究Fig.6 Functional properties of BBMP-PH

2.4.2 溶解性分析 如圖6B 所示，BBMP-PH 的pH 偏酸或偏堿時(shí)，溶解性較好。當(dāng)pH 為6 時(shí)溶解性最低為79.02%，這是由于等電點(diǎn)附近的蛋白分子表面電荷幾乎為零，極易導(dǎo)致蛋白顆粒聚集，溶解性降低并形成沉淀[24]，這與楊恒[25]報(bào)道的雞肺膠原蛋白在等電點(diǎn)附近溶解度最小，偏離等電點(diǎn)溶解度增大的結(jié)果一致。當(dāng)pH 為2 時(shí)，BBMP-PH 溶解性達(dá)到94.72%，表明在酸性環(huán)境中的溶解性高于堿性環(huán)境，可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境有利于蛋白質(zhì)與水的相互作用，結(jié)果與張?chǎng)蝃26]研究的牛鼻膠原蛋白在酸性環(huán)境中的溶解度較高一致。

2.4.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性的分析 蛋白質(zhì)在界面上的吸附能力對(duì)食品加工中乳劑的形成和穩(wěn)定起著重要的作用[26]。如圖6C，BBMP-PH 的乳化性及乳化穩(wěn)定性均隨pH 的增加先降后升再降，當(dāng)pH 在等電點(diǎn)6 時(shí)最低為0.27 m2/g 和69.23%，和溶解性表現(xiàn)出相似的曲線圖，在等電點(diǎn)附近乳化性及乳化穩(wěn)定性較差。當(dāng)pH 為8 時(shí)乳化性和乳化穩(wěn)定性最高1.11 m2/g 和101.37%，與烏日古莫樂[27]報(bào)道吉爾利閣蒙古牛骨膠原蛋白在pH 為8 時(shí)乳化性及乳化穩(wěn)定性最好的結(jié)果相似。

2.4.4 持水性的分析 如圖6D 所示，BBMP-PH 的持水性呈現(xiàn)出先降后升的變化，強(qiáng)堿性環(huán)境下持水性下降。當(dāng)pH 達(dá)到等電點(diǎn)時(shí)持水性最低為3.81 g/g，這是由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的總電荷值為零，分子之間的交互作用最強(qiáng)，結(jié)合和收縮蛋白的水化和膨脹率最低[28]。在pH8 時(shí)，BBMP-PH 的持水性最高為4.59 g/g，是因?yàn)檫h(yuǎn)離等電點(diǎn)后蛋白間的相互作用變小，結(jié)合水的能力增大，表現(xiàn)為持水性增強(qiáng)[29]。

2.4.5 持油性的分析 BBMP-PH 的持油性為13.65 g/g，大于駝?wù)颇z原蛋白（6.22 g/g），可作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑。

2.5 牛骨髓蛋白酶解物的抗氧化活性

2.5.1 DPPH·清除能力 DPPH 為測(cè)定物質(zhì)體外抗氧化活性的重要指標(biāo)[30]，不同濃度的BBMP-PH 與維生素C 對(duì)DPPH·清除能力如圖7A 所示。在0.1～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，清除能力與濃度均呈正比關(guān)系。當(dāng)濃度1 mg/mL 時(shí)清除率達(dá)到69.93%，其半抑制濃度IC50值為0.65 mg/mL。郭佳俊等[31]利用堿性蛋白酶提取牛骨膠原蛋白肽的DPPH·清除率為37.33%，其清除能力顯著小于BBMP-PH。

圖7 BBMP-PH 的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of BBMP-PH

2.5.2 羥自由基（·OH）清除能力 ·OH 是體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，能帶給細(xì)胞很大的傷害，因此清除·OH 是很有必要的[32]。如圖7B 所示，BBMP-PH 在0.1～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)的·OH 清除能力隨著濃度的升高逐漸增強(qiáng)，其半抑制濃度IC50值為1.16 mg/mL。魏潔瓊等[9]比較了不同蛋白酶對(duì)牛骨膠原蛋白肽酶解效果的影響，得出濃度為5 mg/mL 時(shí)堿性蛋白酶處理后的牛骨蛋白酶解物對(duì)·OH 清除率達(dá)到70.86%。本研究中，經(jīng)胃蛋白酶水解所得的BBMP-PH 在濃度為1 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH 的清除能力達(dá)到51.23%，表明其具有較強(qiáng)的清除·OH 的能力。

2.5.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力 如圖7C所示，BBMP-PH 在0.1～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增高，O2-·清除率也增高，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時(shí)，BBMP-PH 的O2-·清除率達(dá)到最高值為66.92%，其半抑制濃度IC50值為0.35 mg/mL。郭佳俊等[31]研究表明，酶解法提取的牛骨膠原蛋白肽濃度為5 mg/mL 對(duì)O2-·的清除率為64.74%，由此可知，BBMPPH 的O2-·清除率高于牛骨蛋白酶解產(chǎn)物。

2.5.4 ABTS+·清除能力 如圖7D 所示，BBMP-PH在0.1～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增高，ABTS+·清除率也增高。當(dāng)濃度為1 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到62.16%。徐紅萍等[33]經(jīng)超聲波輔助酶解制備東海海參膠原蛋白低聚肽，當(dāng)?shù)途垭臐舛葹? mg/mL，其對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)87.20%。本研究結(jié)果得出BBMPPH 清除ABTS+·的IC50值為0.57 mg/mL，說明具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.5.5 總還原能力 生物大分子化合物的總還原能力與抗氧化活性之間具有顯著的相關(guān)性[34]。如圖7E 所示，0.1～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)BBMP-PH 總還原能力明顯低于陽性對(duì)照維生素C。當(dāng)濃度1.0 mg/mL 時(shí)BBMP-PH 總還原能力最高為0.88，表明被測(cè)蛋白的總還原能力較弱。隨著濃度的升高BBMP-PH 總還原能力有所提高。

3 結(jié)論

胃蛋白酶較適合于牛骨髓蛋白的酶解，酶解后理化性質(zhì)及抗氧化活性進(jìn)一步增強(qiáng)。最優(yōu)條件為：酶解時(shí)間2 h、酶添加量2%、pH3、酶解溫度37 ℃，此時(shí)膠原肽的水解度為36.07%、蛋白含量為37.05%、DPPH·清除率為39.57%。pH 對(duì)牛骨髓膠原蛋白溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性及持水性的影響較為顯著。當(dāng)pH 接近其等電點(diǎn)時(shí)，BBMP-PH 的溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性、持水性最低。BBMP-PH 在非等電點(diǎn)的酸性和堿性條件下的理化特性相應(yīng)得到提升，隨pH 的增大其乳化性及乳化穩(wěn)定性、持水性提高，當(dāng)pH 為8 時(shí)乳化性及乳化穩(wěn)定性達(dá)到1.11 m2/g 和101.37%，持水性最高為4.59 g/g，持油性為13.65 g/g。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BBMP-PH 對(duì)DPPH·、·OH、O2-·、ABTS+·均具有清除能力和還原能力，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。酶解處理可有效提高牛骨髓蛋白的理化特性及抗氧化能力，進(jìn)一步擴(kuò)大其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用范圍。