劉宇飛，伏 聰，謝雨康，史吉平,3，孫俊松,3,

（1.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.上?？萍即髮W(xué)，上海 201210）

乙醇酸（glycolate，GA）又稱作甘醇酸、羥基乙酸，是最小的α-羥基酸、分子量最小的果酸，最初是由甘蔗萃取所得的天然有機(jī)酸[1]。由分子結(jié)構(gòu)可知，乙醇酸既有羧基又有羥基，擁有羧酸和醇的雙重性質(zhì)，因此，具有易降解吸收、強(qiáng)水溶性和穿透性等特點(diǎn)。乙醇酸及其聚合物具有良好的生物降解性與生物相容性，可以在生物體內(nèi)降解、代謝為水和二氧化碳，從而排除生物體外，所以乙醇酸及其聚合物可用來(lái)釋放多肽和蛋白質(zhì)類藥物[2-5]。乙醇酸還可作為藥物中間體，用于薄荷腦與奎寧的酯類制備及其它藥品的合成；乙醇酸低聚物或衍生物可以作為食品添加劑，通過(guò)酸化方式減少有害微生物繁殖[6]?；谄鋬?yōu)異的化學(xué)性能，乙醇酸被越來(lái)越多地應(yīng)用于食品加工和制藥行業(yè)中。

目前，國(guó)內(nèi)外乙醇酸的生產(chǎn)主要通過(guò)化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)。其中，甲醛氰化法、氯乙酸水解法和甲醛氫羧基化法等化學(xué)合成途徑是目前主要的生產(chǎn)工藝[7-10]。但是，上述工藝存有反應(yīng)條件劇烈、原料含劇毒、成本高、后續(xù)分離困難以及環(huán)境污染等問(wèn)題，這些問(wèn)題限制的乙醇酸生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，也不符合綠色生產(chǎn)理念。因此，迫切需要找到一種綠色可持續(xù)的可以大規(guī)模生產(chǎn)乙醇酸的方法。近年來(lái)，生物法合成乙醇酸引起了越來(lái)越多的關(guān)注。生物法合成乙醇酸的方法分為微生物酶催化法和全生物合成方法。其中，微生物酶催化法[11]需要使用有毒且價(jià)格較高的乙二醇或者乙醇腈為原料，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。相比之下，全生物合成方法在未來(lái)乙醇酸生產(chǎn)市場(chǎng)具有很好的前景。利用微生物代謝工程，已經(jīng)在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和酵母中建立了不同的乙醇酸代謝途徑[12-14]。目前，乙醇酸合成宿主菌研究主要集中于大腸桿菌。Pereira 等[15]在大腸桿菌中構(gòu)建木糖代謝途徑并加強(qiáng)乙醛酸循環(huán)來(lái)合成乙醇酸；Zhu 等[16]通過(guò)引入外源酶解決了NADPH 不平衡問(wèn)題，通過(guò)失活異檸檬酸脫氫酶和過(guò)表達(dá)乙醛酸還原酶等，進(jìn)一步提高了大腸桿菌利用葡萄糖合成乙醇酸的效率。Xu等[17]在大腸桿菌中設(shè)計(jì)并構(gòu)建乙醇酸響應(yīng)的生物傳感器，建立乙醇酸的高通量篩選方法并獲得一株乙醇酸高產(chǎn)菌株。這些研究有望實(shí)現(xiàn)乙醇酸化學(xué)法生產(chǎn)的替代，但是由于生物安全性和純化成本等因素，上述研究合成的乙醇酸在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的大規(guī)模運(yùn)用會(huì)受到限制。

枯草芽孢桿菌作為“公認(rèn)安全”、“食用安全”的工業(yè)生產(chǎn)微生物，具有生長(zhǎng)快、蛋白分泌能力強(qiáng)、不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素以及不易受噬菌體感染等優(yōu)點(diǎn)[18-20]，被廣泛運(yùn)用于食品酶、N-乙酰氨基葡萄糖、透明質(zhì)酸、巖藻糖基乳糖等工業(yè)應(yīng)用產(chǎn)品的微生物制造[21-25]。本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，通過(guò)表達(dá)外源異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構(gòu)建完成了以甘油為碳源，經(jīng)三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)途徑合成乙醇酸的生物代謝途徑，對(duì)乙醇酸的綠色安全生產(chǎn)和大規(guī)模全生物法合成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質(zhì)粒、菌株 如表1 所示，菌株均保藏于-80 ℃冰箱。PCR 所用模板為Bacillus subtilis164MCT 基因組和質(zhì)粒pMK4-T7；PCR 清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒 杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；2×Phanta Flash Max Master Mi、2×Rapid Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA合成 上海生工生物工程公司；DNA 測(cè)序 北京擎科生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨OXOID；瓊脂粉 上海麥克林生化科技股份有限公司；甘油、硫酸、氯化鈉以及其他培養(yǎng)基成分 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

PCR 儀器 美國(guó)BIO-RAD 公司；RID-10A/SPD-20A 高效液相色譜儀 日本島津公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；WFJ-2100可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 菌株構(gòu)建過(guò)程使用的培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，其組分為10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl 以及5 g/L 酵母粉，在LB 培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%的瓊脂粉得到固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基為M9Y 培養(yǎng)基[26]，其組分為6.8 g/L Na2HPO4,3 g/L KH2PO4,0.5 g/L NaCl,1 g/L NH4Cl,0.015 g/L CaCl2·2H2O,0.49 g/L MgSO4·7H2O、2.8×10-4g/L FeSO4·7H2O、2 g/L 酵母粉?？莶菅挎邨U菌抗生素篩選時(shí)，在培養(yǎng)基中添加抗生素的終濃度為紅霉素10 μg/mL，氯霉素10 μg/mL。

1.2.2 基因表達(dá)盒構(gòu)建 基因表達(dá)盒構(gòu)建主要是通過(guò)融合PCR 方法獲得用于整合到基因組的DNA 片段[27]。首先，以PCR 擴(kuò)增方式獲取目的基因片段、抗性基因片段、上游同源臂片段和下游同源臂片段，PCR 擴(kuò)增獲取DNA 片段時(shí)，使用高保真酶2×Phanta Flash Master Mix。菌株改造過(guò)程所用引物見(jiàn)表2。

擴(kuò)增條件如下，PCR 配置體系為：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，上游引物（10 μmol/L）2.5 μL，下游引物（10 μmol/L）2.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 19.5 μL，共計(jì) 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃5 min，然后變性95 ℃ 15 s，退火55 ℃ 15 s，延伸時(shí)間據(jù)片段的長(zhǎng)度來(lái)設(shè)置溫度為72 ℃，循環(huán)數(shù)30。擴(kuò)增得到的DNA 片段添加限制性內(nèi)切酶Dpn I 以消除模板DNA。接著，用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行目的DNA 片段的純化回收。

測(cè)定回收DNA 片段濃度后，通過(guò)overlap PCR對(duì)DNA 片段進(jìn)行拼接組裝：第一步，PCR 反應(yīng)配置體系為10 μL 2×Phanta Flash Master Mix，片段添加量200 ng，加入ddH2O 至終體積為20 μL，進(jìn)行第一輪PCR 反應(yīng)，循環(huán)數(shù)10。將第一步來(lái)獲取DNA 片段拼接模板進(jìn)行新一輪PCR 反應(yīng)，循環(huán)數(shù)30。然后通過(guò)DNA 凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，根據(jù)PCR 條帶的大小來(lái)鑒定片段融合情況。

1.2.3 枯草芽孢桿菌重組菌株構(gòu)建 枯草芽孢桿菌的感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化方法如文獻(xiàn)所述[28]。但是感受態(tài)的誘導(dǎo)物為甘露醇。感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后，將其孵育菌液涂在相應(yīng)抗性平板上進(jìn)行篩選；長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子菌落PCR 后，送至公司測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗性基因消除，以獲得無(wú)抗突變株，以便于后續(xù)的遺傳改造，消除抗性的具體方法如下：把質(zhì)粒pMK4-cre 轉(zhuǎn)化到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中，涂布于有氯霉素的抗性平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜；接著，挑取氯霉素平板上長(zhǎng)出的菌落，接種在裝有3 mL 液體LB 的試管中。傳代4 次后，將菌液梯度稀釋并涂布到固體LB 平板上。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，用接種環(huán)挑取在長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，同時(shí)印章到氯霉素抗性平板和紅霉素抗性平板上。篩選在兩種抗性平板上均不能生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步通過(guò)菌落PCR 鑒定抗性是否敲除或者送至公司測(cè)序驗(yàn)證，最后將陽(yáng)性菌株命名保藏。

1.2.4 重組菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 挑取單菌落接種到裝有3 mL 新鮮液體LB 培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h；然后將上述菌液轉(zhuǎn)接至裝有50 mL M9Y 培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為1%。在37 ℃、200 r/min 的條件下，振蕩培養(yǎng)6 h 后，添加甘油至終濃度為5 g/L。培養(yǎng)過(guò)程中，每12 h 取一次樣并進(jìn)行甘油和乙醇酸濃度測(cè)定。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè) 樣品制備：發(fā)酵液樣品經(jīng)12000 r/min 高速離心10 min 后，取上清液稀釋（稀釋倍數(shù)根據(jù)預(yù)計(jì)產(chǎn)量不同進(jìn)行調(diào)整）。用0.22 μm 的水相濾膜過(guò)濾至液相襯管內(nèi)并放入液相小瓶中。

樣品分析條件：標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均使用高效液相色譜儀檢測(cè)。色譜柱型號(hào)為Aminex HPX-87H（安捷倫），檢測(cè)器為RID-10A 折光示差檢測(cè)器（島津），色譜柱溫箱溫度為65 oC，流動(dòng)相為5.0 mmol/L 的H2SO4，流速為0.8 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間為20 min。

乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。首先，稱量乙醇酸標(biāo)品，用去離子水稀釋得到0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 十個(gè)濃度，根據(jù)上述檢測(cè)方法進(jìn)行液相分析。收集數(shù)據(jù)后，以乙醇酸濃度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的液相色譜峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液樣品經(jīng)上述同樣的方法測(cè)定后，根據(jù)公式將峰面積換算得出對(duì)應(yīng)乙醇酸濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并利用OriginPro 2022 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P≤0.05）和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌中乙醇酸合成途徑構(gòu)建與優(yōu)化

乙醇酸合成相關(guān)的代謝通路如圖1 所示，枯草芽孢桿菌理論上可以通過(guò)其內(nèi)源乙醛酸還原酶（YvcT）將乙醛酸還原成乙醇酸，但其缺乏乙醛酸的合成能力。因此，實(shí)驗(yàn)首先將來(lái)自地衣芽孢桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA）轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌164MCT，同時(shí)敲除乙醇酸氧化酶基因（glcD、glcF），在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了乙醇酸合成通路，獲得菌株164MCT-GA，作為出發(fā)菌株。具體的改造菌株構(gòu)建過(guò)程如下：a.利用融合PCR 的方法構(gòu)建了T7-aceA（B）表達(dá)盒（圖2A）：首先，以U-glc-F、U-glc-R 為上下游引物擴(kuò)增得到片段U-glc（1000 bp），如圖2B 泳道1 所示；以D-glc-F、D-glc-R 為上下游引物擴(kuò)增得到片段D-glc（1000 bp），如圖2B 泳道4 所示；以erm-T7-F1、erm-T7-R1 為上下游引物擴(kuò)增得到片段ermC-T7（1500 bp），如圖2B 泳道2 所示；以aceA（B）-F、aceA（B）-R 為上下游引物擴(kuò)增得到片段aceA（B）（1300 bp），如圖2B 泳道3 所示；b.將PCR擴(kuò)增所得片段U-glc、D-glc、ermC-T7 和aceA（B）按照方法1.2.2 通過(guò)融合PCR 手段構(gòu)建T7-aceA（B）表達(dá)盒（4800 bp），融合片段驗(yàn)證如圖2C 泳道1 和2所示；c.按照1.2.3 的方法將構(gòu)建好的T7-aceA（B）表達(dá)盒轉(zhuǎn)化至菌株164MCT，將轉(zhuǎn)化菌液涂布至紅霉素抗性平板篩選。隨機(jī)挑取8 個(gè)轉(zhuǎn)化子，以U-glc-F 和D-glc-R 分別為上下游引物進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子會(huì)擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為4800 bp 的片段，如圖2D 的泳道2、4、6、7 所示，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證獲得有紅霉素抗性的突變菌株164MCT-GA。d.按照方法1.2.3，利用cre/lox系統(tǒng)將164MCT-GA 的抗性基因消除，將轉(zhuǎn)化子印章到無(wú)抗、紅霉素抗性和氯霉素抗性平板上，抗性基因敲除的轉(zhuǎn)化子只能在不含抗生素的LB 平板上生長(zhǎng)，如圖2E 所示。將轉(zhuǎn)化子1 送至測(cè)序公司進(jìn)一步驗(yàn)證，最終可得到無(wú)抗的突變菌株164MCT-GA。

圖1 乙醇酸代謝通路Fig.1 Metabolic pathways related to the synthesis of glycolate

圖2 164MCT-GA 的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig.2 Construction and verification of 164MCT-GA

基于出發(fā)菌株164MCT-GA，本研究開(kāi)展了進(jìn)一步代謝優(yōu)化，具體菌株構(gòu)建流程及驗(yàn)證方法與出發(fā)菌株164MCT-GA 的構(gòu)建類似，并且所有菌株均經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，后續(xù)不再贅述。首先，因?yàn)槿人嵫h(huán)到乙醛酸循環(huán)需要充足的前體代謝物供應(yīng)，所以用強(qiáng)啟動(dòng)子T7 替換檸檬酸合酶基因（citA）的原始啟動(dòng)子，促進(jìn)檸檬酸合酶的表達(dá)以增加流向三羧酸循環(huán)的乙酰輔酶A（乙酰-CoA）的通量，從而增加檸檬酸的供應(yīng)，獲得了工程菌株GA3-1，菌株可以用引物對(duì)Ucita-F、D-cita-R 驗(yàn)證（圖3A），突變株的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為3631 bp，對(duì)照組為2110 bp，如圖3B 泳道1 和2 所示；由于乳酸脫氫酶催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸，會(huì)帶來(lái)碳源轉(zhuǎn)換過(guò)程中的碳流失，所以敲除了乳酸脫氫酶基因（ldh），得到工程菌株GA3-2，菌株可以用引物對(duì)U-ldh-F、D-ldh-R 驗(yàn)證（圖3A），突變株的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為3319 bp，對(duì)照組為2936 bp，如圖3B 泳道3 和4 所示；在此基礎(chǔ)上，為減少乙酰-CoA 的損耗，使其更多的流向三羧酸途徑，進(jìn)一步敲除了枯草芽孢桿菌胞內(nèi)的乙酰-CoA 轉(zhuǎn)乙酰酶基因（mmgA、yhfs），鑒于該酶有兩個(gè)同工酶，先敲除mmgA（驗(yàn)證見(jiàn)圖3B 泳道 5、6、7），后敲除yhfs，得到了工程菌株GA3-3 菌株，菌株可以用引物對(duì)U-yhfs-F、D-yhfs-R 驗(yàn)證（圖3A），突變株的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為3411 bp，對(duì)照組為3052 bp，如圖3B 泳道8 和9 所示；敲除磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（pta）完成GA3-4 的構(gòu)建，菌株可以用引物對(duì)U-pta-F、D-pta-R 驗(yàn)證（圖3A），變突株的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為3361 bp，對(duì)照組為3028 bp，如圖3B 泳道10 和11 所示；過(guò)表達(dá)乙醛酸還原酶基因（yvcT）以提高枯草芽孢桿菌合成乙醇酸的效率，最終獲得工程菌株GA3-5，菌株可以用引物對(duì)U-yhfs-F、D-yhfs-R 驗(yàn)證（圖3A），變突株的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度為4628 bp，對(duì)照組為2200 bp，如圖3B 泳道12 和13 所示。

圖3 改造菌株驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Verification results of modified strains

2.2 改造菌株搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

在搖瓶中利用M9Y 培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌改造菌株，驗(yàn)證乙醇酸的合成能力，發(fā)酵結(jié)果如圖4 所示。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)基因citA后，菌株GA3-1 的乙醇酸產(chǎn)量相較于出發(fā)菌株164MCTGA 提高了81.8%，證明增加乙酰輔酶A 進(jìn)入三羧酸循環(huán)的流量，可以間接增強(qiáng)乙醛酸循環(huán)支路；而敲除基因ldh、mmgA和yhfs并沒(méi)有顯著提高改造菌株的乙醇酸產(chǎn)量（P>0.05），這可能是由于在以甘油為碳源發(fā)酵過(guò)程中，枯草芽孢桿菌本身乳酸合成途徑不活躍，也沒(méi)有大量乙酰-CoA 流失；發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有少量乙酸累積，敲除基因pta后，菌株GA3-4 乙醇酸產(chǎn)量相較于菌株GA3-1 提高了28.4%；而過(guò)表達(dá)基因yvcT則會(huì)顯著提高枯草芽孢桿菌乙醇酸合成量（P<0.05），菌株GA3-5 乙醇酸產(chǎn)量相較于菌株GA3-4 進(jìn)一步提高了29.8%，最終產(chǎn)量為0.352 g/L，是出發(fā)菌株164MCT-GA 的3 倍左右。綜合上述分析，乙醛酸還原酶和異檸檬酸裂解酶是枯草芽孢桿菌乙醇酸合成的關(guān)鍵酶；增加檸檬酸合酶表達(dá)量，可以增加前體的供給提高乙醇酸產(chǎn)量。

圖4 不同重組菌株在M9Y 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵乙醇酸產(chǎn)量對(duì)比Fig.4 Comparison of glycolate production by different recombinant strains in shake flask fermentation in M9Y medium

2.3 表達(dá)不同來(lái)源異檸檬酸裂解酶

異檸檬酸裂解酶在乙醇酸的合成中十分重要，但是枯草芽孢桿菌缺乏表達(dá)該酶的基因（aceA），以致于利用三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)合成乙醇酸的途徑不完整，因此，外源異檸檬酸裂解酶的表達(dá)或匹配度是需要進(jìn)一步了解的關(guān)鍵因素。Kabisch 等[29]證明地衣芽孢桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA）可以在枯草芽孢桿菌中正常表達(dá)，所以本研究首先選擇了地衣芽孢桿菌來(lái)源的外源基因aceA。鑒于枯草芽孢桿菌對(duì)外源基因的包容性很高，大腸桿菌的基因也常被用于枯草芽孢桿菌的異源表達(dá)，因此，本研究進(jìn)一步在枯草芽孢桿菌GA3-5 基因組上整合了來(lái)源于大腸桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構(gòu)建了菌株GA3-52，基因表達(dá)盒如圖5A 所示。重組菌株GA3-52和GA3-5 的發(fā)酵對(duì)比結(jié)果，如圖5B 所示，兩株菌的生長(zhǎng)情況和甘油消耗情況區(qū)別不大，但GA3-52 的乙醇酸的最高積累量達(dá)到0.572 g/L，產(chǎn)率約為0.175 g/g甘油，相較于GA3-5，其產(chǎn)量提高了62.5%。這一現(xiàn)象可能是不同來(lái)源的異檸檬酸裂解酶在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)后的酶學(xué)性能的差異造成的，也可能是aceA拷貝數(shù)增加引起的。因此，研究又將GA3-52 中整合的大腸桿菌來(lái)源的aceA替換為地衣芽孢桿菌來(lái)源的aceA，所獲得的菌株GA3-53 乙醇酸產(chǎn)量沒(méi)有顯著變化（P>0.05），如圖5C 所示，說(shuō)明GA3-52 的乙醇酸產(chǎn)量的提高只是因?yàn)閍ceA基因拷貝數(shù)的增加。

圖5 重組菌株GA3-5、GA3-52 和GA3-53 在M9Y 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Results of shake flask fermentation of recombinant strains GA3-5,GA3-52 and GA3-53 in M9Y medium

3 討論與結(jié)論

本研究首次在枯草芽孢桿菌中通過(guò)表達(dá)外源異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構(gòu)建了以甘油為碳源，經(jīng)過(guò)三羧酸和乙醛酸循環(huán)途徑合成乙醇酸的生物途徑。研究通過(guò)加強(qiáng)三羧酸循環(huán)、過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶基因，增加關(guān)鍵基因拷貝數(shù)，獲得一株乙醇酸產(chǎn)量為0.572 g/L，產(chǎn)率為0.175 g/g 甘油的枯草芽孢桿菌，完成了枯草芽孢桿菌中乙醇酸生物合成的初步研究，為后續(xù)該化學(xué)品的綠色安全生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)一步完善奠定了基礎(chǔ)。

雖然本研究通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌碳代謝途徑的改造和加強(qiáng)，大幅提升了其乙醇酸的合成能力，但是目前相比大腸桿菌的合成效率還有較大差距。例如，Alkim 等[30]以大腸桿菌為宿主，以D-木糖和葡萄糖為混合底物，通過(guò)乙醛酸途徑生產(chǎn)乙醇酸，最終糖酸轉(zhuǎn)化率分別為 0.31 g/（g 葡萄糖），0.29 g/（g 木糖），0.37 g/（g 葡萄糖+木糖）（混合比例為33:66%）;馬寧等[31]在大腸桿菌 MG1655（DE3）中敲除了ldhA（乳酸脫氫酶基因），通過(guò)調(diào)節(jié)乙醇酸合成途徑的關(guān)鍵酶，乙醇酸產(chǎn)率為0.24 g/g 葡萄糖（占理論產(chǎn)率的 28.2%）。然后在過(guò)量表達(dá)檸檬酸合成酶基因（gltA），并敲除基因glcB和aceB（蘋果酸合成酶基因），最終獲得的工程菌株Mgly335 的乙醇酸產(chǎn)率達(dá)到 0.522 g/g 葡萄糖（占理論產(chǎn)率的 61.4%）；Xu 等[17]在大腸桿菌中建立乙醇酸生物傳感器，篩選得到的菌株Mgly6-H1 可在5 L 發(fā)酵罐中產(chǎn)出40.9 g/L 左右的乙醇酸，產(chǎn)率為0.66 g/g 葡萄糖。上述研究表明，本研究只在枯草芽孢桿菌建立并初步優(yōu)化了乙醇酸合成途徑，后續(xù)需要進(jìn)一步提高菌株代謝合成效率。接下來(lái)，可以對(duì)乙醛酸還原酶基因和異檸檬酸裂解酶的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，以提高乙醇酸的生物轉(zhuǎn)化量及底物轉(zhuǎn)化率；還需要開(kāi)展宿主細(xì)胞三羧酸循環(huán)的微調(diào)，嘗試調(diào)節(jié)異檸檬酸脫氫酶的表達(dá)[32]，減少異檸檬酸流向α-酮戊二酸，間接促進(jìn)異檸檬酸流向乙醛酸循環(huán)。此外，還可以利用代謝組學(xué)分析，探明乙醇酸合成途徑中的碳源分配，從而針對(duì)性地開(kāi)展代謝改造，增加乙醇酸合成途徑的代謝流/碳通量[33]。同時(shí)，高密度培養(yǎng)及發(fā)酵優(yōu)化也是本研究后續(xù)為提高乙醇酸生物合成所需要進(jìn)行的研究。