周董華 , 王承昊, 范純新??

(1. 上海海洋大學(xué) 國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

側(cè)線系統(tǒng)為魚類和兩棲類所特有,由廣泛分布于體表的感覺(jué)器官神經(jīng)丘構(gòu)成。側(cè)線系統(tǒng)對(duì)于魚類水下生活極為重要,參與魚類的避敵、捕食、群游和洄游等行為[1]。成魚側(cè)線感受器的分布模式具有顯著的多樣性,為魚類適應(yīng)不同的水流環(huán)境提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[2-4]。但是,目前對(duì)于魚類側(cè)線系統(tǒng)分布模式形成的機(jī)制知之甚少。

斑馬魚(Daniorerio)作為模式生物,在其后側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育研究中取得了許多進(jìn)展,對(duì)于理解魚類側(cè)線發(fā)育調(diào)控機(jī)制和模式形成起到重要作用。斑馬魚后側(cè)線系統(tǒng)源自于耳后的后側(cè)線基板(Posterior lateral line placode)。受精后約20 h時(shí),在側(cè)線基板上特化形成初級(jí)后側(cè)線原基(Prim-Ⅰ),并延水平肌隔向尾部遷移,于受精后約40 h抵達(dá)尾部。原基在遷移路徑上留下少量細(xì)胞形成神經(jīng)丘前體(Proto-neuromast),進(jìn)一步分化為神經(jīng)丘,排布形成體側(cè)中線。在初級(jí)原基遷移過(guò)程中(受精后約36 h),后側(cè)線基板又形成次級(jí)原基,包括Prim-Ⅱ和Prim-D。Prim-Ⅱ沿水平肌隔遷移,Prim-D向背側(cè)遷移形成背線。從約受精后3周開始,位于體側(cè)中線和背線上的神經(jīng)丘開始向腹側(cè)遷移,同時(shí)在原有神經(jīng)丘間形成新的間生神經(jīng)丘(Intercalary neuromast),在仔稚魚轉(zhuǎn)換期產(chǎn)生軀干上的4條線。在發(fā)育至受精后2個(gè)月左右,軀干上的部分神經(jīng)丘開始向周圍遷移出部分細(xì)胞,由這些細(xì)胞增殖分化形成一些附屬神經(jīng)丘,因其排列致密成串,稱為針腳神經(jīng)丘(Stitches neuromast)[5]。綜上,斑馬魚的后側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育存在多個(gè)細(xì)胞遷移過(guò)程。

Sdf1-Cxcr4信號(hào)在胚胎發(fā)育、免疫細(xì)胞動(dòng)員和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Sdf1又稱為Cxcl12,為趨化因子,其受體包括兩類G蛋白偶聯(lián)受體:Cxcr4和Cxcr7。當(dāng)Cxcr4結(jié)合Sdf1時(shí),通過(guò)G蛋白激活胞內(nèi)多種信號(hào)通路引起遷移、增殖和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[6-7],當(dāng)Cxcr7結(jié)合Sdf1時(shí),不會(huì)激活典型的趨化反應(yīng),Cxcr7和Sdf1同時(shí)內(nèi)化,抑制Sdf1-Cxcr4信號(hào)[8]。David等[9]和Valentin[10]發(fā)現(xiàn)初級(jí)側(cè)線原基的遷移受到Sdf1-Cxcr4信號(hào)的調(diào)控。

PLLs發(fā)育的第一步是Prim-Ⅰ沿著水平肌間隔遷移,該過(guò)程由Sdf1/Cxcr4信號(hào)的梯度濃度驅(qū)動(dòng)[11]。Sdf1同Cxcr7的親和力幾乎是同Cxcr4的10倍[12]。Cxcr7可以降低Sdf1的胞外濃度,使Sdf1濃度保持在最佳水平,從而形成細(xì)胞遷移所需的趨化因子梯度[13]。斑馬魚的sdf1a在水平肌間隔的尾部表達(dá),cxcr4b表達(dá)在遷移側(cè)線原基的引導(dǎo)區(qū),cxcr7b表達(dá)于遷移側(cè)線原基的尾隨區(qū)。但是,斑馬魚后側(cè)線發(fā)育過(guò)程中其他的細(xì)胞遷移事件是否也受Sdf1-Cxcr4調(diào)控尚不清楚。有研究表明,過(guò)表達(dá)cxcr7b可以沉默斑馬魚后側(cè)線Prim-Ⅰ中后部的sdf1a信號(hào)活性,而敲除或敲降sdf1a或cxcr4b會(huì)抑制側(cè)線Prim-Ⅰ的遷移[14]。本研究中,通過(guò)構(gòu)建熱激啟動(dòng)子控制的過(guò)表達(dá)cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚發(fā)現(xiàn),在不同時(shí)間點(diǎn)過(guò)表達(dá)cxcr7b抑制了Sdf1-Cxcr4信號(hào),檢測(cè)出過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)Prim-Ⅰ和Prim-Ⅱ遷移、神經(jīng)丘腹側(cè)遷移、間生神經(jīng)丘形成和針腳神經(jīng)丘形成的影響,為理解魚類側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用魚為AB品系野生型斑馬魚和ET(gata2:EGFP)189b(簡(jiǎn)稱ET189b) 斑馬魚[15]養(yǎng)殖于上海海洋大學(xué)海洋生物系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所。魚房環(huán)境溫度為26～28 ℃,光周期明∶暗=14 h∶10 h。按照成魚雌、雄比例1∶1進(jìn)行交配產(chǎn)卵,獲得的胚胎用藍(lán)水(0.3 g/L紅海鹽和1 mg/L亞甲基藍(lán))培養(yǎng)于28.5 ℃培養(yǎng)箱中。所有魚類的實(shí)驗(yàn)均符合上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。質(zhì)粒pTol2-hsp70l-Tnfrsfa-P2A-mCherry為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,含Tol2轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒pCS2-TPase來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH) Shawn Burgess實(shí)驗(yàn)室。引物由安升達(dá)公司合成。

1.2 整體胚胎原位雜交

整體原位雜交實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[16]中的流程。野生型斑馬魚受精后32 h胚胎和受精后72 h仔魚經(jīng) 4% 多聚甲醛(PFA) 于4 ℃過(guò)夜進(jìn)行固定,第二天使用甲醇梯度脫水后保存于-20 ℃。保存過(guò)的樣品首先經(jīng)過(guò)含吐溫20的磷酸緩沖液(PBST) 梯度復(fù)水,其次用 10%過(guò)氧化氫溶液脫色至胚胎黑色素消失,然后用不含反義探針的雜交液于70 ℃孵育樣品4 h,后加入含反義探針的雜交液于70 ℃孵育過(guò)夜。樣品依次經(jīng)過(guò)漂洗、封閉、抗體孵育和漂洗等步驟,最后用NBT/BCIP stock solution (Roche)在室溫下顯色。顯色完成后,使用4% PFA 終止顯色反應(yīng),再用PBST 多次漂洗后置于 100%甘油中避光保存,最后用光學(xué)顯微鏡(Nikon)觀察并拍照。

1.3 質(zhì)粒pTol2-hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry的構(gòu)建

以受精后4 d 的野生型斑馬魚cDNA為模板,用引物Cxcr7b-ORF-F和Cxcr7b-ORF-R (見(jiàn)表1)擴(kuò)增得到cxcr7b的開放閱讀框作為插入片段;以質(zhì)粒pTol2-hsp70l-Tnfrsfa-P2A-mCherry為模板,用引物Cxcr7b-VEC-F和Cxcr7b-VEC-R (見(jiàn)表1)擴(kuò)增得到載體骨架,并使插入片段和載體骨架兩末端具有一致的同源序列。根據(jù)ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit (Vazyme)說(shuō)明書中的方法進(jìn)行同源重組連接,將目的片段定向克隆至載體的同源位點(diǎn),將新重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(Vazyme),然后提取質(zhì)粒,送上海生工測(cè)序得到重組質(zhì)粒pTol2-hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry(見(jiàn)圖1)。

圖1 質(zhì)粒圖譜

表1 基因引物信息

1.4 Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA的體外轉(zhuǎn)錄

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(Thermo Fisher Scientific) 酶切質(zhì)粒pCS2-TPase。以線性化的pCS2-TPase質(zhì)粒DNA作為模板,采用SP6 mMessage mMachine kit (Ambion)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA。轉(zhuǎn)錄出的Tol2 轉(zhuǎn)座酶mRNA由Quick-RNA MicroPrep Kit (ZYMO RESEARCH)純化回收。

1.5 建立Tg(hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry)轉(zhuǎn)基因魚

顯微注射前一天晚上將AB斑馬魚按照雌、雄比例1∶1放入孵化盒中,用隔板將雌雄分開。第二天早晨抽去隔板,斑馬魚產(chǎn)卵后收集魚卵,用于顯微注射。配制質(zhì)粒pTol2-hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry和 Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA混合液(使每1 μL混合液里含有25 ng質(zhì)粒和50 ng Tol2轉(zhuǎn)座酶 mRNA)。將混合液注射至1-細(xì)胞期胚胎的胞質(zhì),注射劑量為1.4 nL/枚。將經(jīng)過(guò)注射的F0胚胎養(yǎng)至性成熟,并與AB進(jìn)行雜交。選擇其后代胚胎熱激后具有紅色熒光的F0作為建立者(Founder),并將帶有紅色熒光的胚胎養(yǎng)至性成熟,以作為Tg(hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。

1.6 熱激過(guò)表達(dá)cxcr7b

將cxcr7b和ET189b轉(zhuǎn)基因斑馬魚進(jìn)行交配,獲得的胚胎培養(yǎng)在藍(lán)水中。在受精后18 h篩選具有綠色熒光的胚胎,并將這些胚胎分為5組,每組約50顆受精卵,然后按照表2中的時(shí)段進(jìn)行熱激(每間隔12 h,39 ℃熱激1 h,然后轉(zhuǎn)至28.5 ℃培養(yǎng))。完成熱激后,在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)在熒光倒置顯微鏡 (Zeiss, Axio Observer)的GFP通道下,對(duì)后側(cè)線原基所處體節(jié)的位置、神經(jīng)丘數(shù)量和神經(jīng)丘距離水平肌節(jié)的距離進(jìn)行拍照和測(cè)量。同時(shí),在DsRed通道下根據(jù)紅色熒光確定每條魚是否帶有cxcr7b轉(zhuǎn)基因,帶有紅色熒光的作為實(shí)驗(yàn)組,而不帶紅色熒光的作為對(duì)照組。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本量都大于10。使用蔡司公司的ZEN軟件分別對(duì)遷移距離和神經(jīng)丘數(shù)量進(jìn)行測(cè)量和計(jì)數(shù),將所得的數(shù)據(jù)輸入至Graphpad prism 7軟件,以對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)使用t-檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)間差異性,其中p<0.05(用*表示)和p<0.000 1(用****表示)分別表示差異顯著和差異極顯著。顯示遷移距離的柱狀圖也是由Graphpad prism 7 軟件生成的。

2 結(jié)果

2.1 cxcr4b和sdf1a分別表達(dá)于遷移中的后側(cè)線原基和水平肌間隔

受精后32 h是斑馬魚后側(cè)線Prim-Ⅰ和PrimⅡ的遷移時(shí)間,受精后72 h是斑馬魚后側(cè)線Prim-D的遷移時(shí)間。本研究利用整體原位雜交技術(shù),檢測(cè)了cxcr4b和sdf1a在受精后32 h胚胎和在受精后72 h仔魚中的表達(dá)定位。結(jié)果顯示:在受精后32 h,cxcr4b在整個(gè)Prim-Ⅰ中高表達(dá),且在Prim-Ⅰ引導(dǎo)端的表達(dá)強(qiáng)于后隨端(見(jiàn)圖2A)。sdf1a主要表達(dá)在水平肌隔尾部,且沿著頭部向尾部方向逐漸提高(見(jiàn)圖2C)。在受精后72 h,cxcr4b的表達(dá)則集中在Prim-Ⅱ和Prim-D(見(jiàn)圖2B);sdf1a主要表達(dá)在水平肌隔的前端和軀干的背側(cè)(見(jiàn)圖2D)。由此可見(jiàn),cxcr4b和sdf1a分別表達(dá)于遷移中的后側(cè)線原基和水平肌間隔。

2.2 過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)Prim-Ⅰ遷移的影響

為了檢測(cè)Sdf1-Cxcr4信號(hào)在后側(cè)線Prim-Ⅰ遷移中的作用,本文作者構(gòu)建了cxcr7b轉(zhuǎn)基因魚,通過(guò)熱激過(guò)表達(dá)cxcr7b,進(jìn)而抑制Sdf1-Cxcr4信號(hào)。結(jié)果表明:熱激后的cxcr7b轉(zhuǎn)基因胚胎同野生型在外觀形態(tài)上沒(méi)有明顯的差異。在ET189b背景下,本文作者觀察到野生型的Prim-Ⅰ在32 h遷移至軀干第(9.750 0±0.217 6)個(gè)體節(jié),在受精后48 h遷移至尾部末端。但在cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體中Prim-Ⅰ在受精后32 h僅遷移至第(4.083 0±0.193 0)個(gè)體節(jié),差異顯著(p<0.000 1) (見(jiàn)圖3A、C);在受精后48 h僅遷移至第(10.000 0±0.492 4)個(gè)體節(jié),差異顯著(p<0.000 1) (見(jiàn)圖3B、D)?；赑rim-Ⅰ所處體節(jié)位置,定量分析顯示cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體Prim-Ⅰ的遷移顯著慢于野生型Prim-Ⅰ的遷移。

(A:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后32 h Prim-Ⅰ所處位置。B:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后48 h Prim-Ⅱ所處位置。比例尺=100 μm。C:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后32 h Prim-Ⅰ所處體節(jié)數(shù)定量分析。D:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后48 h Prim-Ⅰ所處體節(jié)數(shù)定量分析。: p <0.000 1。WT: 野生斑馬魚。 Tran-cxcr7b: cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚。A: The position of Prim-Ⅰ in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 32 h post-fertilization. B: The position of Prim-Ⅱ in wild-type and cxcr7b zebrafish at 48 h post-fertilization. Scale bar=100 μm. C: The quantification analysis of the position of Prim-Ⅰ in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at 32 h post-fertilization. D: The quantification analysis of the position of Prim-Ⅰ in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at 48 h post-fertilization. : P <0.000 1. WT: Wild-type zebrafish. Tran-cxcr7b:cxcr7b transgenic zebrafish. )

(A:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后48 h Prim-Ⅱ和Prim-D所處位置。B:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后72 h Prim-Ⅱ和Prim-D所處位置。比例尺=100 μm。C:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后48 h Prim-Ⅱ所處體節(jié)數(shù)定量分析。D:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后72 h Prim-Ⅱ所處體節(jié)數(shù)定量分析。: P <0.05; :P <0.000 1。WT: 野生斑馬魚。 Tran-cxcr7b: cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚。 A: The position of Prim-Ⅱ and Prim D in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 48 h post-fertilization. B: The position of Prim-Ⅱ and Prim D in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 72 h post-fertilization. Scale bar = 100 μm. C: The quantification analysis of the position of Prim-Ⅱ in wild-type and cxcr7b tiansgenic zebrafish at 48 h post-fertilization. D: The quantification analysis of the position of Prim-Ⅱ in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at 72 h post-fertilization. : P< 0.05; : P< 0.000 1. WT: Wild-type zebrafish. Tran-cxcr7b:cxcr7b transgenic zebrafish. )

2.3 過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)Prim-Ⅱ遷移的影響

在Prim-Ⅰ遷移至尾部后,耳后的側(cè)線基板處形成新的原基(Prim-Ⅱ和Prim-D),它們分別向尾部和背部遷移。為了探究Sdf1-Cxcr4信號(hào)在Prim-Ⅱ和Prim-D遷移過(guò)程中的作用,本文作者從受精后45 h開始熱激,然后在受精后48和72 h對(duì)野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體的Prim-Ⅱ和Prim-D的遷移位置進(jìn)行觀察。對(duì)于野生型而言,在受精后48 h,Prim-Ⅱ和Prim-D剛剛開始從后側(cè)線基板處遷出,遷移至第(1.417 0±0.148 6)體節(jié);在受精后72 h,Prim-Ⅱ大致到達(dá)第(9.786 0±0.238 6)體節(jié),Prim-D已接近背中線。在受精后48 h,cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體的Prim-Ⅱ和Prim-D遷移至第1體節(jié),差異顯著(p=0.010 4) (見(jiàn)圖3A、C);在受精后72 h,cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體的Prim-Ⅱ大約遷移至第(8.000 0±0.209 7)體節(jié),差異顯著(p<0.000 1) (見(jiàn)圖3B、D)。Prim-D距離背側(cè)中線還存在一定的距離,它們的遷移速度均顯著慢于對(duì)照組。

2.4 過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)體側(cè)中線神經(jīng)丘腹側(cè)遷移和神經(jīng)丘生成數(shù)量的影響

從受精后3 d開始,斑馬魚軀干中線的神經(jīng)丘開始向腹側(cè)遷移。本文作者在斑馬魚受精后3 d對(duì)cxcr7b轉(zhuǎn)基因和野生型進(jìn)行熱激,受精后6和10 d分別測(cè)量體側(cè)中線神經(jīng)丘與水平肌隔的距離。結(jié)果顯示:在受精后6 d,野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組兩組體側(cè)中線神經(jīng)丘的腹側(cè)遷移距離分別為(76.980 0±1.760 0)和(76.410 0±1.783 0) μm,兩者差異不顯著(p=0.822 3) (見(jiàn)圖5A、C);在受精后10 d,野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組體側(cè)中線神經(jīng)丘的腹側(cè)遷移距離分別為(74.520 0± 1.958 0)和(71.970 0±3.044 0) μm,兩者差異不顯著(p=0.532 9) (見(jiàn)圖5B、E)。

(A:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后6 d側(cè)線神經(jīng)丘所處位置。B:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后10 d側(cè)線神經(jīng)丘所處位置。比例尺=500 μm。C、E:表示野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后6和10 d體側(cè)中線神經(jīng)丘與水平肌隔的距離比較。D、F:分別表示野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后6和10 d的側(cè)線神經(jīng)丘總數(shù)比較。ns:無(wú)顯著性差異。WT: 野生斑馬魚。 Tran-cxcr7b: cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚。A: The position of lateral line neuromast in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 6 d post-fertilization. B: The position of lateral line neuromast in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 10 d post-fertilization. Scale bar = 500 μm. C,E: The comparison of the distance between the lateral midline neuromast and the horizontal myoseptum in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at 6 and 10 d post-fertilization. D, F: The comparison of the total number of lateral line neuromasts in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at 6 and 10 d post-fertilization. ns: No significant difference. WT: Wild-type zebrafish. Tran-cxcr7b:cxcr7b transgenic zebrafish. )

另外,本文作者通過(guò)計(jì)數(shù)后側(cè)線單側(cè)的神經(jīng)丘總數(shù)反映后側(cè)線神經(jīng)丘的數(shù)量。結(jié)果顯示:在受精后6 d,野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組單側(cè)側(cè)線神經(jīng)丘總數(shù)分別為(15.200 0±0.279 5)和(15.870 0±0.236 4)個(gè),兩者差異不顯著(p=0.079 2) (見(jiàn)圖5A、D);在受精后10 d,野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組單側(cè)側(cè)線神經(jīng)丘總數(shù)分別為(16.310 0±0.262 7)個(gè)和(16.630 0± 0.221 3)個(gè),兩者差異不顯著(p=0.360 4) (見(jiàn)圖5B、 F)。綜上表明:過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)體側(cè)中線神經(jīng)丘腹側(cè)遷移和神經(jīng)丘生成總數(shù)均沒(méi)有明顯的影響。

2.5 過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)體側(cè)中線間生神經(jīng)丘生成的影響

從受精后約15 d開始,原始神經(jīng)丘間的丘間細(xì)胞增殖分化形成間生神經(jīng)丘,間插在原始神經(jīng)丘之間。在受精后15 d時(shí)對(duì)cxcr7b轉(zhuǎn)基因和野生型進(jìn)行熱激,在受精后21 d時(shí)計(jì)數(shù)體側(cè)中線神經(jīng)丘的總數(shù)。結(jié)果顯示:野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組的體側(cè)中線神經(jīng)丘總數(shù)分別為(18.100 0±1.100 0)個(gè)和(16.300 0±1.012 0)個(gè),差異不顯著(p=0.244 0) (見(jiàn)圖6A、B)。體側(cè)中線神經(jīng)丘包含原始神經(jīng)丘和間生神經(jīng)丘。由于原始神經(jīng)丘不受過(guò)表達(dá)cxcr7b的影響,本文作者推測(cè)間生神經(jīng)丘也不受過(guò)表達(dá)cxcr7b的影響。

(A:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在21 d post-fertilization側(cè)線神經(jīng)丘所處位置。比例尺=500 μm。B:野生型和cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在受精后21 d體側(cè)中線神經(jīng)丘總數(shù)比較。ns:無(wú)顯著性差異。WT: 野生斑馬魚。 Tran-cxcr7b: cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚。A: The position of lateral line neuromast in wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 21 d post-fertilization. Scale bar = 500 μm. B:The comparison of the total number of lateral midline neuromasts between wild-type and cxcr7b transgenic zebrafish at the 21 d post-fertilization. ns: No significant difference. WT: Wild-type zebrafish. Tran-cxcr7b:cxcr7b transgenic zebrafish. )

2.6 過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)針腳神經(jīng)丘生成的影響

從受精后約1個(gè)月開始,后側(cè)線系統(tǒng)的神經(jīng)丘套細(xì)胞開始向背、腹方向遷移,隨之增殖分化形成針腳神經(jīng)丘。在受精后1個(gè)月時(shí)對(duì)cxcr7b轉(zhuǎn)基因個(gè)體和野生型個(gè)體均進(jìn)行持續(xù)熱激,在受精后1.5個(gè)月時(shí)對(duì)胸鰭和腹鰭間的體側(cè)中線和腹側(cè)線針腳神經(jīng)丘計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示:在受精后1.5個(gè)月時(shí),野生型組與過(guò)表達(dá)cxcr7b組后側(cè)線針腳神經(jīng)丘分別為(4.817 0±0.224 9)和(5.029 0±0.215 7)個(gè),兩者數(shù)量差異不顯著(p=0.504 2) (見(jiàn)圖7A、B)。結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)cxcr7b對(duì)針腳神經(jīng)丘的生成無(wú)明顯影響。

3 討論

本研究利用熱激啟動(dòng)子控制的cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚在側(cè)線發(fā)育的特定階段阻斷Sdf1-Cxcr4信號(hào)通路,研究了Sdf1-Cxcr4信號(hào)在斑馬魚后側(cè)線系統(tǒng)發(fā)育中的細(xì)胞遷移中的作用。斑馬魚的后側(cè)線發(fā)育中的Prim-Ⅰ、Prim-Ⅱ和Prim-D的遷移受到過(guò)表達(dá)cxcr7b的抑制,但中線神經(jīng)丘向腹側(cè)的遷移、間生神經(jīng)丘和針腳神經(jīng)丘的形成均不受Sdf1-Cxcr4信號(hào)的影響。成體金槍魚和斑馬魚側(cè)線模式的差異同仔魚期中線神經(jīng)丘的遷移方向有關(guān)[17]。這暗示發(fā)育階段的原基遷移和神經(jīng)丘遷移均參與了魚類側(cè)線生成的最終模式。Sdf1-Cxcr4信號(hào)對(duì)后側(cè)線Prim-Ⅰ、Prim-Ⅱ和Prim-D遷移的調(diào)控,為理解魚類多樣的側(cè)線模式形成機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

注射反義嗎啡啉敲降cxcr4b或sdf1a可抑制斑馬魚側(cè)線原基的遷移[9]。但是1-細(xì)胞期的敲降無(wú)法展示發(fā)育后期的細(xì)胞遷移事件。研究表明:cxcr4b和cxcr7b分別表達(dá)在側(cè)線原基的引導(dǎo)區(qū)和后隨區(qū),這也與原基尾端沉積神經(jīng)丘相一致[5]。另外,cxcr7b可作為清道夫結(jié)合Cxcl12,抑制Sdf1-Cxcr4信號(hào)的活性[8]。根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道,過(guò)表達(dá)cxcr7b可以抑制斑馬魚后側(cè)線Prim-Ⅰ遷移。本研究中建立的Tg(hsp70l:cxcr7b-P2A-mCherry)轉(zhuǎn)基因魚不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)Prim-Ⅰ遷移的抑制,也可以抑制同樣表達(dá)cxcr4b的Prim-Ⅱ和Prim-D的遷移,這表明過(guò)表達(dá)cxcr7b也可以在側(cè)線原基遷移中抑制Sdf1-Cxcr4信號(hào)。這提供了一個(gè)在斑馬魚發(fā)育過(guò)程中可控的抑制細(xì)胞遷移的工具。另外,在魚類的原始生殖細(xì)胞歸巢和白細(xì)胞尋找病灶過(guò)程中都有Sdf1-Cxcr4信號(hào)的參與[18-19]。因此,cxcr7b轉(zhuǎn)基因魚對(duì)于研究Sdf1-Cxcr4信號(hào)在以上過(guò)程中的作用具有重要意義。

后側(cè)線系統(tǒng)Prim-Ⅰ和Prim-Ⅱ受到Sdf1-Cxcr4信號(hào)的調(diào)控,體側(cè)中線神經(jīng)丘向腹側(cè)、間生神經(jīng)丘和針腳神經(jīng)丘等遷移的過(guò)程雖然有細(xì)胞遷移發(fā)生,但它們沒(méi)有受到過(guò)表達(dá)cxcr7b的影響?？赡苁怯捎诔墒焐窠?jīng)丘中cxcr4b的表達(dá)相對(duì)更弱。本研究匯中確實(shí)發(fā)現(xiàn)cxcr4b僅在Prim-Ⅰ,Prim-Ⅱ和Prim-D上有較強(qiáng)的表達(dá),而在成熟的神經(jīng)丘中未檢測(cè)到明顯的表達(dá)。另外,也可能是由于成熟神經(jīng)丘周圍組織沒(méi)有形成sdf1的濃度梯度。從受精后20 h開始過(guò)表達(dá)cxcr7b,盡管看到Prim-Ⅰ的遷移明顯慢于對(duì)照組,但仍然看到了Prim-Ⅰ的部分遷移。這暗示cxcr7b轉(zhuǎn)基因斑馬魚對(duì)Sdf1-Cxcr4信號(hào)的抑制并不徹底,丘間細(xì)胞和體側(cè)中線神經(jīng)丘的遷移距離都比較短,其同野生型斑馬魚的差異并不顯著。