王金龍，王藝蓉，李景全，閆黎，王昊，劉晴，張永芳，董楊

1. 上海中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，上海 201203

2. 上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，上海 201203

3. 上海交通大學醫(yī)學院藥理學與化學生物學系，上海 200025

阿爾茨海默?。ˋD）是由多種原因引起的一種復雜的神經(jīng)退行性疾病，會導致患者記憶障礙、學習能力下降、人格和行為改變等[1]。其發(fā)病機制尚不十分清楚，主要涉及淀粉樣蛋白假說、神經(jīng)遞質假說、神經(jīng)炎癥假說等[2]。目前治療AD 的藥物利凡斯的明、多奈哌齊、美金剛等雖然可以一定程度的減輕認知障礙等癥狀，但都無法真正抑制、逆轉病情進展[3]。地黃飲子作為經(jīng)典的中藥方劑之一，具有補腎填精、化痰開竅的功效，切中AD 的中醫(yī)病機。有臨床研究顯示，地黃飲子能夠改善AD 患者學習記憶及認知功能障礙[4]，但其具體作用機制仍不十分清楚。本研究通過網(wǎng)絡藥理學探討地黃飲子防治AD 的潛在機制，并結合整體動物實驗進行驗證。

1 材料與方法

1.1 地黃飲子有效成分搜集利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/）搜集熟地黃、山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、肉桂、五味子、附子、茯苓、石菖蒲、生姜、大棗、薄荷的化學成分，根據(jù)藥代動力學相關信息篩選有效成分。設置條件為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）≥-0.3[5]；TCMSP 中未包含的中藥遠志、石斛、麥冬則通過HERB 數(shù)據(jù)平臺（http：//herb.ac.cn/）進行化學成分搜集，利用pkCSM 數(shù)據(jù)平臺（http：//biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/）對成分進行分析，收集BBB≥-1 并且滿足Lipinski's法則（LR）中至少4 項的作為有效成分[6]；此外，通過文獻檢索納入部分不符合上述篩選條件但有文獻報道具有抗AD 活性的有效成分。

1.2 有效成分靶點預測與疾病靶點獲取通過TCMSP、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http：//stitch.embl.de/）獲取有效成分潛在靶點。其中SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中選取概率值≥0.5 的預測靶點，STITCH 數(shù)據(jù)庫中選取置信分數(shù)≥0.7 的預測靶點。利用Therapeutic Target Database（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）、Gene-Cards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）3 個數(shù)據(jù)庫以“Alzheimer's disease”為關鍵詞獲取AD 相關靶點。其中DisGeNET數(shù)據(jù)庫選取score≥0.3 的靶點，GeneCards 數(shù)據(jù)庫選擇score≥20 的靶點。

1.3 網(wǎng)絡構建與拓撲分析將地黃飲子和AD 相關靶點導入 bioinformatics 在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）Venn 圖模塊，獲取交集靶點。利用Cytoscape 3.7.1 軟件構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡，CytoNCA 功能模塊對網(wǎng)絡進行拓撲分析。網(wǎng)絡中的節(jié)點代表化學成分、靶點或者中藥，邊表示它們之間的連接，“Degree”用來計算連接到每個節(jié)點的邊的數(shù)量，“Degree”值越高表示給定節(jié)點在網(wǎng)絡中越重要[7]。

1.4 GO 及KEGG 通路富集分析利用Metascape在線工具對關鍵靶點進行GO 和KEGG 通路富集分析，并利用bioinformatics 將結果可視化，P值＜0.05的富集條目具有顯著統(tǒng)計學差異。

1.5 實驗驗證

1.5.1 實驗動物8 周齡SPF 級雄性C57BL/6 小鼠40 只，體質量（22±2）g，均購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物[許可證號：SYXK（滬）2018-0027]飼養(yǎng)于標準條件下[室溫控制在（24±2）℃，12 h 黑暗/光照]，可自由進食和飲水。實驗通過上海交通大學醫(yī)學院倫理審批（A-2021-019）。

1.5.2 藥物及制備地黃飲子處方：熟地黃18 g，山茱萸、巴戟天、肉蓯蓉、石斛各9 g，附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠志各6 g，薄荷2 g，生姜5 片，大棗1 枚。按處方劑量稱取藥材加入8 倍體積的水，砂鍋中浸泡12 h，大火煮沸，轉文火0.5 h；重復煎煮1 次，合并藥液，過濾、濃縮至1.32 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。中藥飲片均購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰尽?/p>

1.5.3 試劑與儀器小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、小鼠白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，批號：EK282、EK206）；乙酰膽堿酯酶（AChE）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：EEL-M2637c）；核因子κB（NF-κB）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）（Cell Signaling Technology 公司，批號：3033S、8242S）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體（碧云天生物技術有限公司，批號：A0208）；氫溴酸東莨菪堿（批號：xw080081），購自國藥集團化學試劑有限公司。Y 迷宮設備購自張家港市生物醫(yī)學儀器廠，新物體識別設備、水迷宮設備購自上海移數(shù)信息科技有限公司。

1.5.4 動物分組與給藥實驗將小鼠隨機分為4 組，每組10 只。分別為對照組、模型組、地黃飲子低劑量（6 g/kg）組和高劑量組（12 g/kg）。地黃飲子的劑量根據(jù)臨床等效劑量進行換算[8]。小鼠適應環(huán)境5 d后，地黃飲子低、高劑量組分別按照6 g/kg 和12 g/kg灌胃24 d（直到行為學實驗結束），對照組和模型組同時灌胃等量0.9 % 氯化鈉溶液。在中藥灌胃14 d后，模型組和地黃飲子低、高劑量組按照3 mg/kg 腹腔注射劑量東莨菪堿，對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，30 min 后進行行為學實驗[9]。

1.5.5 Y 迷宮實驗用Y 迷宮觀察小鼠自發(fā)交替行為，不設置獎勵或懲罰，評估小鼠短期空間工作記憶[10]。迷宮架分為3 個臂（30 cm×8 cm×15 cm），夾角為120°。將小鼠隨機置于1 個臂，進入每1 個臂且不同于前2 個臂則標記為正確選擇（例：A-B-C 或A-C-B），否則標記為錯誤選擇。自發(fā)交替行為=正確進臂次數(shù)/（總進臂次數(shù)-2）×100%。

1.5.6 新物體識別實驗Y 迷宮實驗結束后第2 天進行新物體識別實驗，評估小鼠對新舊物體的識別記憶能力[11]。第1 天適應階段，小鼠在實驗箱中自由活動5 min。第2 天熟悉階段，在箱底部一條對角線上間隔相同距離放置2 個相同物體，小鼠面朝實驗箱壁放入，自由活動5 min，期間記錄小鼠對2 個物體的探索次數(shù)。第3 天測試階段，用1 個新物體替換舊物體，同樣方法放入箱體并自由探索5 min，記錄小鼠分別對兩物體的探索次數(shù)。識別指數(shù)（RI）=探索新物體次數(shù)/（探索新物體次數(shù)+探索舊物體次數(shù)）×100%。

1.5.7 Morris 水迷宮實驗新物體識別實驗結束后第2 天進行水迷宮實驗，評估小鼠學習和空間記憶能力[12]。水迷宮系統(tǒng)由攝像記錄設備和圓形水池組成。水面分為4 個象限，平臺置于第Ⅱ象限水下1 cm，依次從第Ⅰ～Ⅳ象限放入小鼠。定位航行階段，記錄60 s 內小鼠尋找平臺所需時間，即逃避潛伏期，每天每個象限各訓練1 次。第6 天撤掉平臺進行空間探索實驗，記錄60 s 內小鼠在目標象限停留時間。

1.5.8 ELISA 檢測AChE 及相關促炎細胞因子水平行為學實驗全部結束，處死小鼠。將小鼠海馬組織勻漿于混有PMSF 的4 ℃預冷的PBS 中（質量∶體積=1∶9），12 000 r/min 離心15 min 后取上清，按照ELISA 試劑盒說明檢測AChE、IL-6、TNF-α 的水平。

1.5.9 Western Blot 檢測NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達將小鼠海馬組織勻漿于含有PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液中，離心后取上清，BCA 法測定蛋白濃度。將等量的蛋白在SDS-PAGE 凝膠上電泳分離，將蛋白轉移到PVDF 膜（Millipore）上，快速封閉液封閉1 h 后加入NF-κB 和一抗（1∶1 000，CST）4 ℃孵育過夜，洗膜3 次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，采用ECL 化學發(fā)光劑顯影，Image Studio Lite軟件對蛋白條帶進行灰度值分析并定量。

1.6 統(tǒng)計學方法使用GraphPad Prism 8.0.2 版本對上述實驗結果進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并通過方差檢驗后，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Bonferroni 檢驗進行多組間比較。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 地黃飲子有效成分及靶點信息見圖1。利用TCMSP、HERB 數(shù)據(jù)平臺篩選有效成分。剔除未獲得潛在靶點的成分后剩余89 個有效成分，文獻檢索補充50 個有效成分，共獲得地黃飲子有效成分139 個。結合TCMSP、SwissTargetPrediction 和STITCH 數(shù)據(jù)平臺獲得上述有效成分對應的832 個潛在靶點。從TTD、DisGeNET、GeneCards 數(shù)據(jù)平臺共獲取570 個AD 相關靶點，取地黃飲子與AD 共有靶點197 個，即地黃飲子防治AD 的潛在靶點。

圖1 地黃飲子與AD 共有靶點Venn 圖

2.2 共有靶點的網(wǎng)絡構建與分析見圖2、表1。利用Cytoscape 3.7.1 構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡共包含339 個節(jié)點，涉及1 336 條邊，其中123 個中藥化學成分節(jié)點連接了197 個AD 相關靶點。利用網(wǎng)絡拓撲分析上述網(wǎng)絡節(jié)點之間的聯(lián)系，根據(jù)中位數(shù)度值進行限定，獲得61 個地黃飲子防治AD 的關鍵有效成分，展示其中度值最高的前20 個成分。對關鍵有效成分對應靶點進行中位數(shù)度值限定，獲得度值最高的前106 個靶點，作為地黃飲子防治AD 的關鍵靶點。

表1 地黃飲子關鍵有效成分TOP 20

圖2 地黃飲子防治AD 的中藥-成分-靶點網(wǎng)絡

2.3 地黃飲子防治AD 關鍵靶點GO 及KEGG 通路富集分析見圖3。GO 分子功能富集分析結果顯示，關鍵靶點與肽結合（淀粉樣蛋白）、膽堿能結合、神經(jīng)遞質受體的活動等有關；GO 生物過程富集分析結果表明，這些靶點主要與炎癥反應的調節(jié)、行為活動調控等相關。KEGG 通路富集分析結果發(fā)現(xiàn)，關鍵靶點主要富集在AD、膽堿能突觸、NF-κB等與AD 相關的信號通路中，其中膽堿突觸通路富集靶點有AChE、CHRNA7 等；NF-κB 通路富集的靶點有TNF、RELA 等。

圖3 地黃飲子防治AD 關鍵靶點富集分析

2.4 地黃飲子對AD 小鼠短期空間工作記憶的影響見表2。Y 迷宮實驗結果顯示，模型組較對照組小鼠迷宮臂的正確選擇次數(shù)降低（P＜0.05），地黃飲子低劑量和高劑量能夠增加AD 模型小鼠的正確交替行為（P＜0.05）。提示地黃飲子可以改善小鼠短期空間工作記憶能力。

表2 地黃飲子對AD 小鼠短期空間工作記憶的影響（）

表2 地黃飲子對AD 小鼠短期空間工作記憶的影響（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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2.5 地黃飲子對AD 小鼠識別記憶的影響見表3。熟悉階段各組小鼠對2 個相同物體的識別指數(shù)約50%，組間無顯著差異，提示各組小鼠對2 個相同物體的位置及環(huán)境無選擇性偏好。新物體識別測試階段，模型組小鼠對新物體識別能力下降（P＜0.05）；與模型組比較，地黃飲子低劑量和高劑量組給藥后小鼠對新物體識別指數(shù)均升高（P＜0.05）。表明地黃飲子能夠一定程度改善AD 模型小鼠對新物體和舊物體的識別記憶能力，恢復小鼠對新物體的正常偏好。

表3 地黃飲子對AD 小鼠識別記憶的影響（） %

表3 地黃飲子對AD 小鼠識別記憶的影響（） %

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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2.6 地黃飲子對AD 小鼠學習及空間記憶能力的影響見圖4。在5 d 的定位航行訓練過程中，各組小鼠找到平臺的逃避潛伏期逐漸縮短；第5 天，模型組小鼠的逃避潛伏期相較于對照組增加（P＜0.05），與模型組相比，地黃飲子低、高劑量組的逃避潛伏期縮短（P＜0.05）；空間探索階段，模型組小鼠與對照組小鼠相比目標象限活動時間減少（P＜0.05），地黃飲子高劑量組小鼠目標象限停留時間增加（P＜0.05）。以上結果表明，地黃飲子可以改善AD 模型小鼠學習和空間記憶能力。

圖4 地黃飲子對AD 小鼠學習及空間記憶能力的影響（，n=7）

2.7 各組小鼠海馬組織中AChE 及促炎細胞因子比較見表4。ELISA 檢測結果顯示，模型組AChE 的水平高于對照組（P＜0.05），地黃飲子低、高劑量組AChE 的水平低于模型組（P＜0.05）。模型組IL-6、TNF-α 水平高于對照組（P＜0.05），地黃飲子高劑量組IL-6 水平低于模型組（P＜0.05），低、高劑量組TNF-α 水平低于模型組（P＜0.05）。提示“膽堿能抗炎途徑”可能與地黃飲子改善小鼠認知功能障礙有關。

表4 各組小鼠海馬組織中AChE 及促炎細胞因子比較（）

表4 各組小鼠海馬組織中AChE 及促炎細胞因子比較（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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2.8 各組小鼠海馬組織中磷酸化NF-κB 蛋白表達比較見圖5、表5。Western Blot 檢測結果表明，模型組p-NF-κB 蛋白表達高于對照組（P＜0.05）。低、高劑量地黃飲子均可以降低p-NF-κB 蛋白的表達（P＜0.05）。

表5 各組小鼠海馬組織中磷酸化NF-κB 蛋白表達比較（）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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3 討論

本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)地黃飲子防治AD 有效成分中度值較高的包括槲皮素、芹菜素、染料木素、反式肉桂醛等。有研究表明，槲皮素具有神經(jīng)保護作用，包括抑制AChE 和BChE 活性，減輕膽堿能系統(tǒng)功能障礙[13]。芹菜素、染料木素能夠調節(jié)膽堿能系統(tǒng)，對α7 煙堿乙酰膽堿受體（α7nAChR）具有正向變構調節(jié)的作用，抑制TFN-α、IL-6 的產(chǎn)生[14-15]。反式肉桂醛是肉桂中的一種醛類有機化合物，Zhao Y 等[16]發(fā)現(xiàn)其可以阻斷NF-κB 的激活，抑制神經(jīng)炎癥反應，改善早老素1 和2 條件雙敲除（PS cDKO）小鼠認知功能障礙。GO 和KEGG 通路富集分析表明，地黃飲子防治AD 的關鍵靶點參與肽結合（淀粉樣蛋白）、膽堿能結合、炎癥反應調節(jié)、行為活動調控等；AChE、CHRNA7、RELA、TNF 等關鍵靶點富集于膽堿能突觸、NF-κB 等與AD 相關的信號通路中。提示地黃飲子防治AD 的作用與調控膽堿能和神經(jīng)炎癥途徑有關。

東莨菪堿是一種公認的抗膽堿能藥物，常被用作誘發(fā)動物認知障礙的實驗標準藥物[17]。本研究借助東莨菪堿誘導小鼠AD 模型，通過行為學實驗發(fā)現(xiàn)地黃飲子可以有效改善小鼠的認知功能障礙。膽堿能突觸普遍存在于人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，膽堿能傳遞在學習記憶和其他高級大腦功能中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明，配體門控的α7 煙堿乙酰膽堿受體（α7nAChR）是炎癥反應的效應點，參與突觸功能、神經(jīng)保護、神經(jīng)元存活和炎癥反應的調節(jié)[18]。迷走神經(jīng)通過主要的神經(jīng)遞質乙酰膽堿（Ach）調節(jié)α7nAChR 在炎癥細胞中的激活減弱TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子的釋放，這種效應被稱為“膽堿能抗炎途徑”[19-20]。存在于膽堿能突觸間的AChE 是生物神經(jīng)傳導中的一種關鍵性酶，可將ACh 水解成膽堿和乙酸。一旦膽堿能系統(tǒng)功能障礙，AChE 與ACh 之間平衡被打破，“膽堿能抗炎途徑”將遭到破壞。而膽堿酯酶抑制劑可以抑制AChE，防止ACh 的分解，進而保護膽堿能突觸的活性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，地黃飲子能夠顯著降低東莨菪堿AD 模型小鼠海馬組織中異常升高的AChE 水平，可能恢復“膽堿能抗炎途徑”。

膽堿能抗炎途徑能夠通過影響促炎細胞因子的產(chǎn)生與釋放，以及抑制NF-κB 的活化發(fā)揮作用。NF-кB 是細胞內重要的核轉錄因子，能夠引起膠質細胞激活，增加炎癥介質的釋放并進一步誘發(fā)神經(jīng)炎癥[22]。有研究表明，NF-κB 通路參與神經(jīng)炎癥的調控，與認知功能的損傷有關[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，地黃飲子可以降低AD 小鼠海馬組織中IL-6、TNF-α水平以及p-NF-κB 蛋白的表達水平，提示地黃飲子可能通過抑制NF-κB 蛋白的磷酸化進而抑制神經(jīng)炎癥反應。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡藥理分析結合動物實驗驗證發(fā)現(xiàn)，地黃飲子可以改善東莨菪堿AD 模型小鼠的認知功能障礙，其作用機制可能是通過抑制小鼠海馬AChE 的水平，減輕膽堿能損傷，抑制NF-κB介導的神經(jīng)炎癥，恢復“膽堿能抗炎途徑”，從而改善小鼠認知功能障礙。