陶瑜,李燕,柏艾梅,虞章紅,侯喜林,李英

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)起源于中國(guó),栽培歷史悠久,性喜冷涼,是中國(guó)南方最重要的葉用蔬菜之一[1]。夏季的高溫和強(qiáng)光照條件會(huì)引發(fā)光氧化脅迫,誘導(dǎo)光合電子傳遞鏈過(guò)度還原,造成葉綠體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)性累積,在很大程度上影響了不結(jié)球白菜的正常生長(zhǎng)發(fā)育而降低不結(jié)球白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。因此,光氧化脅迫下及時(shí)有效地清除葉綠體中產(chǎn)生的ROS對(duì)增強(qiáng)植物抗高溫、強(qiáng)光能力具有明顯的作用效果[3]。為進(jìn)一步滿足消費(fèi)者的市場(chǎng)需求,實(shí)現(xiàn)全年供應(yīng)生產(chǎn),關(guān)于不結(jié)球白菜在耐熱、耐強(qiáng)光等利于夏季反季節(jié)栽培的相關(guān)研究尤為重要。

還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是含有巰基的抗氧化物質(zhì),能夠儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)還原態(tài)硫、調(diào)節(jié)酶活性和參與氧化還原反應(yīng)控制氧化還原狀態(tài)[4-5]。GSH能夠直接有效地清除植物中ROS,防止其積累[6]。在清除ROS的酶促反應(yīng)中,GSH作為還原劑參與抗壞血酸(AsA)的再生,自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),而GSSG在谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)的作用下能夠及時(shí)有效地被還原成GSH[7]。因此,GR對(duì)于維持植物體內(nèi)GSH含量、保持細(xì)胞谷胱甘肽庫(kù)的氧化還原狀態(tài)(GSH/GSSG),以及提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性具有重要影響。

GR是一種黃素蛋白氧化還原酶,其依靠煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)提供電子實(shí)現(xiàn)GSSG向GSH的轉(zhuǎn)變[8]。GR蛋白分布在不同的細(xì)胞器中,在植物的細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體以及過(guò)氧化物酶體中均檢測(cè)到了GR活性[9]。許多高等植物中只能分離鑒定出2種不同類型的GR,根據(jù)亞細(xì)胞定位可分為胞質(zhì)GR和雙向定位于葉綠體和線粒體上的葉綠體GR[10]。在不結(jié)球白菜中,GR也有2種亞細(xì)胞定位類型:BcGR1定位于細(xì)胞質(zhì),BcGR2定位于葉綠體[11]。在高等植物中葉綠體GR活性占細(xì)胞中GR總酶活性的一半以上,參與植物體內(nèi)不同信號(hào)途徑,調(diào)控植物的抗逆性或影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3,12]。

GR作為抗氧化物酶參與植物的生長(zhǎng)調(diào)控,目前對(duì)于該酶的研究大多集中在其對(duì)脅迫處理的響應(yīng)上。例如:在干旱脅迫下,水稻、玉米、小麥等物種的GR活性會(huì)提高[13];在鹽脅迫下,番茄、大豆、棉花和柑橘等物種的GR活性也會(huì)提高,抗氧化能力增強(qiáng),而敲除水稻GR3基因會(huì)導(dǎo)致其對(duì)鹽脅迫的敏感性提高[14];在臭氧和百草枯導(dǎo)致的氧化脅迫下,過(guò)表達(dá)GR基因能夠提高煙草光合作用[15-16];在低溫脅迫下,GR基因表達(dá)被抑制的番茄體內(nèi)H2O2含量上升,更易對(duì)冷害脅迫敏感[17]。在不結(jié)球白菜中,BcGR1.1則可以通過(guò)提高GR、抗氧化酶的活性和對(duì)AsA的利用,來(lái)提高植物對(duì)ROS的清除能力,從而增強(qiáng)植物對(duì)銅脅迫的耐受性[11]。但BcGR2在不結(jié)球白菜中的基因功能及其響應(yīng)光氧化脅迫的機(jī)制尚不清楚。

本研究以不結(jié)球白菜‘蘇州青’為材料,對(duì)BcGR2.1進(jìn)行功能驗(yàn)證。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法和病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)[18]分別獲得了過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和BcGR2.1沉默‘蘇州青’,并對(duì)過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥和BcGR2.1沉默‘蘇州青’采用光下甲基紫精(MV)處理誘導(dǎo)其產(chǎn)生光氧化脅迫[19],以進(jìn)一步研究BcGR2.1的基因功能和其在響應(yīng)光氧化脅迫中的作用,為今后更深入研究植物GR的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為不結(jié)球白菜品種‘蘇州青’,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。將其種子催芽2～3 d后移栽至滅菌基質(zhì)中,置于人工氣候室培養(yǎng),光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h,晝/夜溫度為24 ℃/18 ℃,相對(duì)濕度(80±5)%。

哥倫比亞野生型擬南芥種子在消毒后均勻平鋪在1/2 MS上培養(yǎng)。種子消毒過(guò)程:75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇清洗1 min,無(wú)菌水清洗3～5次,每次5 min;用10%(體積分?jǐn)?shù))次氯酸鈉洗滌種子10 min,無(wú)菌水洗滌3～5次,每次5 min。整個(gè)過(guò)程都是在超凈工作臺(tái)中完成。對(duì)于萌發(fā)15 d的擬南芥幼苗,選擇生長(zhǎng)狀態(tài)整齊一致的移栽到含有滅菌基質(zhì)的穴盤中,培養(yǎng)條件與‘蘇州青’一致,并在開花期進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染。

1.2 不結(jié)球白菜BcGR2.1基因克隆

取不結(jié)球白菜‘蘇州青’4葉1心時(shí)期的葉片0.1 g,用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行葉片總RNA的提取,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中AtGR2(AT3G54660)和大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)中BraGR2(Bra007087)序列,在不結(jié)球白菜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tbir.njaμ.edu.cn/NhCCDbHubs/index.jsp)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì),查找同源基因,根據(jù)同源基因序列設(shè)計(jì)特異性引物BcGR2.1-F/R(表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

以不結(jié)球白菜‘蘇州青’的cDNA為模板,利用BcGR2.1-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):模板1 μL,Prime STAR Max Premix(2×)(TaKaRa)10 μL,正、反引物各1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在12 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳20 min,確定片段的長(zhǎng)度和單一性。目的片段用凝膠回收試劑盒(AG)回收,連接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)載體。連接體系(5 μL):pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 1 μL,膠回收產(chǎn)物 4 μL。反應(yīng)程序:37 ℃ 30 min,4 ℃保存。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α后涂布于含50 mg·L-1卡那霉素(Kanamycin)的LB培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將陽(yáng)性單克隆的菌液送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序,獲得目的基因。

1.3 BcGR2.1生物信息學(xué)分析

利用Bioxm2.7軟件比對(duì)測(cè)序得到的核酸序列和翻譯不結(jié)球白菜BcGR2.1基因編碼的氨基酸序列,并計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)BcGR2.1氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì),下載比對(duì)結(jié)果中不同物種的GR2氨基酸序列。采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析用GeneDoc 2.7.0.0完成。

1.4 光氧化脅迫處理

待不結(jié)球白菜‘蘇州青’生長(zhǎng)至4葉1心時(shí)期,選擇長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的植株,采用光下MV處理誘導(dǎo)其產(chǎn)生光氧化脅迫。于光期開始時(shí)使用小噴壺將150 μmol·L-1MV(含0.01%吐溫-20)均勻噴灑在‘蘇州青’葉片上,對(duì)照組噴灑等量含0.01%吐溫-20的清水,培養(yǎng)溫度為22 ℃,光照周期為16 h光照、8 h黑暗。分別在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h時(shí)取樣,取0.1 g葉片提取RNA。同樣用150 μmol·L-1MV均勻噴灑在BcGR2.1沉默‘蘇州青’和PTY空載葉片上,待出現(xiàn)植株葉片開始變白和萎蔫時(shí)統(tǒng)一取樣。每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

將野生型(WT)和T3代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥(35S∷BcGR2.1)移栽至滅菌基質(zhì)中生長(zhǎng)21 d左右,用40 μmol·L-1MV噴施處理轉(zhuǎn)基因擬南芥(35S∷BcGR2.1)和WT植株葉片。觀察植株生長(zhǎng)狀況及葉片形態(tài),在處理后12 h取樣。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

用RNA Simple Total RNA Kit(TianGen)提取總RNA,使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR(AG)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA模板稀釋5倍,RT-qPCR體系(20 μL):模板2 μL,HieffqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)10 μL,正、反引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT方法[20]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果使用Prism 6以及Excel 2016軟件進(jìn)行誤差分析和差異顯著性分析。

1.6 BcGR2.1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及過(guò)表達(dá)植株獲得

將BcGR2.1的CDS插入過(guò)表達(dá)載體 pTCK303,限制性內(nèi)切酶為BamHⅠ和KpnⅠ。利用農(nóng)桿菌凍融法將過(guò)表達(dá)載體pTCK303-BcGR2.1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101(吐露港),再通過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)入開花期的擬南芥中,待種子成熟后混合收種并記為T0代。將T0種子消毒后鋪在含有30 μg·L-1潮霉素和16 mg·L-1特美汀的1/2 MS平板上篩選,15 d后區(qū)分出陽(yáng)性苗并移栽至滅菌基質(zhì)中培養(yǎng)。通過(guò)PCR、RT-qPCR和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)化學(xué)染色檢驗(yàn)出陽(yáng)性植株,將T1代陽(yáng)性苗單株收種后再次篩選得到T2及T3代。

1.7 病毒誘導(dǎo)基因沉默載體構(gòu)建及植株接種

根據(jù)之前的報(bào)道[21],采用VIGS方法獲得了BcGR2.1沉默不結(jié)球白菜植株?；贐cGR2.1編碼序列選取40 bp(5′-TTGATCGAAGGCCGTGGAAAGGTTATAGACCCACACACTG-3′),另一條鏈反向互補(bǔ),共80 bp,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用金粉包裹50 μg的PTY和PTY-BcGR2.1質(zhì)粒,基因槍轟擊生長(zhǎng)2周的‘蘇州青’,使質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)。將被基因槍轟擊的‘蘇州青’置于人工氣候室培養(yǎng),培養(yǎng)條件同1.1節(jié)。15 d后取發(fā)病植株葉片提取RNA,熒光定量PCR分析基因表達(dá)量,方法同1.5節(jié)。

1.8 AsA和T-AsA含量測(cè)定

采用Fontannaz等[22]的方法測(cè)定葉片中AsA含量。0.1 g葉片加入750 μL 0.1%草酸,振蕩混勻,4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min。22 μm濾膜(水系)過(guò)濾上清液后,用0.1%草酸稀釋2倍,使用超高效液相色譜儀(ultiMate 3000)測(cè)定AsA含量。AsA測(cè)定結(jié)束后加入二硫蘇糖醇(DTT)測(cè)定T-AsA含量。色譜條件:流動(dòng)相0.1%乙酸,流速1 mL·min-1,進(jìn)樣10 μL,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

1.9 H2O2和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

根據(jù)過(guò)氧化氫(H2O2)含量檢測(cè)試劑盒(Solarbio)說(shuō)明書測(cè)定光氧化脅迫條件下植物葉片中的H2O2含量。使用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(Image-Pam)觀測(cè)光氧化脅迫下植物葉片中的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3～4個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù),使用Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜BcGR2.1基因克隆和系統(tǒng)進(jìn)化分析

以不結(jié)球白菜‘蘇州青’葉片cDNA為模板,用特異性引物BcGR2.1-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1 600 bp左右的目的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果分析表明:不結(jié)球白菜BcGR2.1基因含有1個(gè)1 626 bp的開放閱讀框(ORF),編碼541個(gè)氨基酸。

圖1 不結(jié)球白菜BcGR2.1基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of the BcGR2.1 genein non-heading Chinese cabbageM:Marker 2000. The same below.

根據(jù)克隆所得的BcGR2.1基因編碼的氨基酸序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLASTp對(duì)BcGR2.1同源性進(jìn)行檢索,共選擇11個(gè)物種的GR2蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,BcGR2.1蛋白與蕪菁蛋白同源關(guān)系最近(圖2-a)。蛋白保守區(qū)域分析結(jié)果表明,BcGR2.1的保守區(qū)域和其他物種基本相同,僅蕪菁蛋白最前端比BcGR2.1蛋白多一個(gè)區(qū)域6(圖2-b)。

圖2 BcGR2.1與其他物種GR2蛋白的進(jìn)化樹(a)和保守區(qū)域分析(b)Fig.2 Phylogenetic tree(a)and conserved domain analysis(b)of BcGR2.1in non-heading Chinese cabbage and other species

2.2 不結(jié)球白菜BcGR2基因?qū)庋趸{迫的響應(yīng)

由圖3-a可見:MV處理12 h后,‘蘇州青’葉片出現(xiàn)白色塊狀斑駁,該現(xiàn)象隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇;48 h時(shí),葉片呈現(xiàn)大范圍失綠,且明顯萎蔫。RT-qPCR結(jié)果表明,不結(jié)球白菜‘蘇州青’中2個(gè)GR2同源基因的相對(duì)表達(dá)量在光氧化脅迫下有不同的變化。由圖3-b、c可見:BcGR2.1的基因表達(dá)量呈現(xiàn)先逐步上升后逐漸下降的趨勢(shì),在8 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值,為對(duì)照的11倍。BcGR2.2的基因表達(dá)量在0～12 h 亦呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),在4 h時(shí)達(dá)到最大值,為對(duì)照的2.5倍,12 h時(shí)表達(dá)量最低;12～48 h呈現(xiàn)先升后降的波動(dòng)趨勢(shì)?？梢姽庋趸{迫處理能夠誘導(dǎo)不結(jié)球白菜BcGR2基因的表達(dá),由于BcGR2.1較BcGR2.2對(duì)光氧化脅迫更為敏感,因此選擇BcGR2.1進(jìn)行了后續(xù)的功能研究。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得與鑒定

為了進(jìn)一步研究BcGR2.1的功能,通過(guò)構(gòu)建BcGR2.1過(guò)表達(dá)載體(圖4-a),并使用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得了BcGR2.1過(guò)表達(dá)株系。對(duì)于每一代的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株均進(jìn)行了DNA水平檢測(cè)、GUS檢測(cè)、BcGR2.1基因表達(dá)量分析以及酶活測(cè)定。由圖4-b、c可見:陽(yáng)性株系均能檢測(cè)出目的片段,而野生型未擴(kuò)增出條帶,且陽(yáng)性植株葉片經(jīng)染色后呈藍(lán)色,而野生型無(wú)色。圖4-d、e結(jié)果顯示:陽(yáng)性株系BcGR2.1基因的表達(dá)量顯著高于野生型植株,GR活性略高于野生型。

2.4 BcGR2.1過(guò)表達(dá)擬南芥在光氧化脅迫下的H2O2含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖5可見:在光氧化脅迫條件下,過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥葉片中PSⅡ最大光合量子產(chǎn)量Fv/Fm顯著高于野生型,為野生型的8倍。光氧化脅迫條件下,過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥和野生型葉片中PSⅡ?qū)嶋H光合量子產(chǎn)量Y(Ⅱ)、通過(guò)PSⅡ的電子傳遞速率ETR以及光化學(xué)淬滅系數(shù)qP均下降,但過(guò)表達(dá)植株仍顯著高于野生型。光氧化脅迫條件下過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥和野生型植株葉片中非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN均上升,而野生型qN顯著高于過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥。葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)BcGR2.1一定程度上維護(hù)了光氧化脅迫下植株的光合功能,增強(qiáng)了植株應(yīng)對(duì)光氧化脅迫的耐受力。

圖5 光氧化脅迫下過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥H2O2含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.5 H2O2 content and chlorophyll fluorescence parameters in Arabidopsis with overexpression ofBcGR2.1 under photooxidative stressa. 光氧化脅迫下WT和過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥葉綠素?zé)晒庾兓疌hanges in chlorophyll fluorescence of WT and BcGR2.1-overexpressed Arabidopsis under photooxidative stress;b. H2O2含量變化Changes in H2O2 content;c. Fv/Fm變化Changes in Fv/Fm;d—g. Y(Ⅱ)、ETR、qP及qN變化Changes in Y(Ⅱ),ETR,qP and qN.Fv/Fm:PS Ⅱ最大光合量子產(chǎn)量The maximal quantum yield of PS Ⅱ;Y(Ⅱ):PS Ⅱ?qū)嶋H光合量子產(chǎn)量Effective photochemical quantum yield of PS Ⅱ;ETR:通過(guò)PS Ⅱ的電子傳遞速率Electron transfer rate through PS Ⅱ;qP:光化學(xué)淬滅系數(shù)Coeffificient of photochemical fluorescence quenching;qN:非光化學(xué)淬滅系數(shù)Non-photochemical fluorescence quenching. MV-12 h:40 μmol·L-1 MV處理12 h 40 μmol·L-1 MV treatment for 12 h.

除此之外,過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥和野生型植株葉片H2O2含量測(cè)定結(jié)果表明:與對(duì)照相比,光氧化脅迫處理12 h后野生型擬南芥葉片中H2O2含量上升,而過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥植株葉片中的H2O2含量下降,且顯著低于野生型擬南芥。這表明在光氧化脅迫條件下,過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥具有比野生型更強(qiáng)的清除體內(nèi)ROS能力。

2.5 過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥中AsA、T-AsA含量及AsA-GSH循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)量

由圖6可見:BcGR2.1過(guò)表達(dá)擬南芥中AsA含量上升,為野生型擬南芥的2倍左右,T-AsA含量也顯著上升。這表明過(guò)表達(dá)BcGR2.1能夠有效提高植物中AsA含量。

圖6 過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥AsA和T-AsA含量測(cè)定Fig.6 Determination of AsA and T-AsA contents in Arabidopsis with overexpression of BcGR2.1

鑒于過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥中AsA和T-AsA含量的變化,進(jìn)一步分析了光氧化脅迫條件下過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥中AsA-GSH循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá)量。由圖7可見:光氧化脅迫條件下,BcGR2.1過(guò)表達(dá)株系中AtMDHAR1、AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2和AtGR1的表達(dá)量與未處理時(shí)相比均上調(diào),其中AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2以及AtGR1的表達(dá)量顯著高于野生型。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)BcGR2.1基因的擬南芥通過(guò)改變AsA-GSH循環(huán)相關(guān)基因的表達(dá),提高植物中AsA含量,增強(qiáng)其對(duì)光氧化脅迫的抗性。

圖7 光氧化脅迫下過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥AsA-GSH循環(huán)相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of AsA-GSH cycle related genes in Arabidopsis with overexpression ofBcGR2.1 under photooxidative stressAtMDHAR:擬南芥單脫氫抗壞血酸還原酶基因Monodehydroascorbate reductase genes of Arabidopsis;AtDHAR:擬南芥脫氫抗壞血酸還原酶基因Dehydroascorbate reductase genes of Arabidopsis;AtGPX:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因Glutathione peroxidase genes of Arabidopsis;AtGR1:擬南芥谷胱甘肽還原酶基因1 Glutathione reductase gene 1 of Arabidopsis.

2.6 BcGR2.1基因沉默對(duì)不結(jié)球白菜AsA、T-AsA以及光氧化脅迫下H2O2含量的影響

由圖8-a可見:病毒接種2周后,PTY-BcGR2.1和PTY顯示花葉的表型。對(duì)可能喪失BcGR2.1功能的發(fā)病植株進(jìn)行取樣,并使用RT-qPCR分析BcGR2.1的沉默效率。如圖8-b所示:與PTY空載相比,PTY-BcGR2.1植株中BcGR2.1的表達(dá)量顯著下調(diào),#1、#2、#4和#6植株沉默效率分別是84.2%、72.2%、75%和55.6%。對(duì)BcGR2.1基因沉默后植株中的AsA和T-AsA含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其AsA和T-AsA含量均顯著下降(圖8-c、d)。用150 μmol·L-1MV(含0.01%吐溫-20)均勻噴灑野生型、PTY空載和PTY-BcGR2.1植株葉片,誘導(dǎo)其產(chǎn)生光氧化脅迫。對(duì)以上植株葉片中的H2O2含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在光氧化脅迫條件下,BcGR2.1沉默植株葉片中的H2O2含量顯著高于PTY空載(圖8-e)。說(shuō)明與PTY空載相比,BcGR2.1基因沉默后植株清除體內(nèi)ROS的能力減弱。

圖8 BcGR2.1基因沉默植株表型(a)、表達(dá)量(b)、AsA含量(c)、T-AsA含量(d)以及光氧化脅迫下H2O2含量(e)Fig.8 Phenotype(a),expression level(b),and the contents of AsA(c),T-AsA(d)and H2O2(e)under photooxidativestress in BcGR2.1-silencing plantsPTY:pTY 空載pTY empty carrier;#1、#2、#4、#6:BcGR2.1基因沉默后的植株The plant after BcGR2.1 gene silencing.

3 討論

本研究從不結(jié)球白菜中克隆得到BcGR2.1基因,系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)BcGR2.1蛋白與蕪菁同源關(guān)系最近,且蛋白保守區(qū)域與其他物種高度相似。丁順華等[12]研究表明,各種GR蛋白的所有底物結(jié)合位點(diǎn)甚至整個(gè)氨基酸序列都遵循極其保守的進(jìn)化過(guò)程,GR氨基酸序列上相對(duì)不保守的區(qū)域通常是一些特定的調(diào)控區(qū)域或無(wú)催化活性的區(qū)域。在植物細(xì)胞中,已報(bào)道的一些物種的GR蛋白分布在不同的細(xì)胞器中,如植物的細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體以及過(guò)氧化酶體中均檢測(cè)到了GR活性[3]。研究表明,不結(jié)球白菜中存在BcGR1和BcGR2這2種不同亞型的GR,其中BcGR2在葉綠體上表達(dá)[11]。在豌豆和煙草等植物中,大部分GR活性(約70%)存在于葉綠體,因此認(rèn)為葉綠體GR與植物的抗氧化能力密切相關(guān)[26]。

由于不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)基因過(guò)程中再生率和轉(zhuǎn)化率低,因此本研究通過(guò)蘸花法獲得過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥以驗(yàn)證不結(jié)球白菜BcGR2.1基因的功能。在過(guò)表達(dá)BcGR2.1的擬南芥中,AsA含量顯著高于野生型,說(shuō)明過(guò)表達(dá)BcGR2.1能有效提高植物中AsA含量。此外,利用VIGS技術(shù)獲得了BcGR2.1沉默的不結(jié)球白菜植株,與PTY空載相比,其葉片內(nèi)AsA含量下降,表明在擬南芥和不結(jié)球白菜中,BcGR2.1正向調(diào)控AsA含量。

研究發(fā)現(xiàn),在煙草中過(guò)表達(dá)GR基因能夠提高其在臭氧和百草枯氧化脅迫下的光合作用[15]。本研究基于BcGR2.1特殊的亞細(xì)胞定位和功能,對(duì)其在植物應(yīng)對(duì)光氧化脅迫中的作用進(jìn)行了探索。MV是水溶性二價(jià)陽(yáng)離子,易于擴(kuò)散至葉綠體內(nèi),由于其具有強(qiáng)氧化-還原電勢(shì),在光照條件下能夠從PSⅠ的氧化端接受電子被還原成穩(wěn)定的MV陽(yáng)離子自由基,再與O2反應(yīng)形成ROS阻礙光合作用正常進(jìn)行[19]。本研究發(fā)現(xiàn),在MV處理模擬的光氧化脅迫下BcGR2.1表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),表明光氧化脅迫影響該基因表達(dá)量進(jìn)而對(duì)ROS清除產(chǎn)生一定影響。

Tian等[27]研究表明,葉綠素?zé)晒鈪?shù)ФPSⅡ和Fv/Fm是高溫脅迫條件下植物光合性能的敏感指標(biāo),經(jīng)過(guò)高溫脅迫(45 ℃)的煙草葉片F(xiàn)v/Fm和ФPSⅡ均顯著下降。本研究中,在光氧化脅迫條件下,過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥葉片中的H2O2含量顯著低于野生型,相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化也體現(xiàn)了過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥植株的優(yōu)勢(shì)。這說(shuō)明較高的BcGR2.1表達(dá)量能夠一定程度維持光氧化脅迫下植物光合作用正常運(yùn)行,且與降低H2O2的積累有關(guān)。AsA-GSH循環(huán)中各抗氧化酶共同維持主要抗氧化物質(zhì)的含量和氧化還原比值[28]。本研究中,在光氧化脅迫條件下,編碼AsA-GSH循環(huán)的相關(guān)抗氧化酶基因表達(dá)量上調(diào),且AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2以及AtGR1的表達(dá)量顯著高于野生型。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)BcGR2.1擬南芥通過(guò)改變AsA-GSH循環(huán)中相關(guān)基因的表達(dá)量來(lái)調(diào)節(jié)AsA含量,清除逆境下產(chǎn)生的ROS。此外,BcGR2.1沉默的不結(jié)球白菜植株在光氧化脅迫下H2O2的積累量顯著高于PTY空載。

綜上所述,在擬南芥和不結(jié)球白菜中BcGR2.1正調(diào)控AsA含量,過(guò)表達(dá)BcGR2.1基因,提高AsA含量,光氧化脅迫條件下過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)H2O2含量顯著下降,一定程度上保護(hù)了光氧化脅迫下植物的光合功能。這表明BcGR2.1是一種與光氧化脅迫相關(guān)的候選基因,能夠提高擬南芥應(yīng)對(duì)光氧化脅迫的耐受力。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步鑒定不結(jié)球白菜BcGR2基因在抗非生物脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。