桑杰,呂鵬飛,朱雪珍,周利娟

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510462)

利用氧化還原敏感綠色熒光蛋白(reduction-oxidation sensitive green fluorescence protein,roGFP)檢測活體氧化還原電位的方法,是將一個(gè)本身不含二硫鍵且對生物系統(tǒng)沒有影響的蛋白特異性表達(dá)并定位到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,可以無損傷檢測活細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位。Hanson 等[1]將野生型綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行改造后得到對氧化還原敏感的探針(roGFP),試驗(yàn)證實(shí)該探針可以響應(yīng)哺乳細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變,能夠?qū)?xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變進(jìn)行實(shí)時(shí)無損害監(jiān)測。Jiang 等[2]將roGFP基因引入模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,通過熒光強(qiáng)度比率能夠迅速反映所處環(huán)境的氧化還原狀態(tài)這一特點(diǎn),證實(shí)roGFP探針能夠響應(yīng)擬南芥細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)的變化。由于roGFP探針的熒光強(qiáng)度僅受細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)改變的影響,從而消除了由探針濃度、光漂白以及組織厚度等引起的誤差,因此為研究植物活體細(xì)胞中氧化還原狀態(tài)奠定了基礎(chǔ)。

roGFP是一種GFP的突變體,位于熒光發(fā)射團(tuán)附近的S147和Q204氨基酸殘基在遇到氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)會突變成半胱氨酸,形成半胱氨酸對[1]。細(xì)胞氧化還原狀態(tài)變化會引起roGFP構(gòu)象發(fā)生變化,從而改變其生色團(tuán)的熒光特性。因此可以利用熒光比率來反映熒光的變化,即在氧化狀態(tài)時(shí),410 nm/470 nm的比值較高,而在還原狀態(tài)時(shí),其比值較低[2]。另外,在植物中,roGFP是氧化還原敏感的,并且能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的檢測植物體內(nèi)的氧化還原電位[3]。與熒光染料相比[4-5],roGFP熒光探針因具備非破壞性、局域測定、可逆、實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的優(yōu)勢,成為評估細(xì)胞內(nèi)氧化還原平均狀態(tài)的一種方法,適用于許多生物和細(xì)胞類型[6-8]。

李佳霖等[8]和周毅峰等[9]先后報(bào)道從禿杉中分離出的禿杉素、臺灣脂素E和臺灣脂素H具有一定的除草活性,禿杉素對三葉鬼針草、薇甘菊和勝紅薊馬等雜草根長IC50值(7 d)為0.18～0.83 μg·mL-1,鮮重IC50值為0.80～1.14 μg·mL-1,50 μg·mL-1臺灣脂素H(7 d)完全抑制對反枝莧、勝紅薊和薇甘菊等雜草根生長,50 μg·mL-1臺灣脂素E(7 d)能完全抑制勝紅薊等雜草根生長。本論文研究植物源除草化合物對mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響,分析它們對植物細(xì)胞氧化還原電位影響的變化規(guī)律,研究其對植物細(xì)胞作用的方式,對利用roGFP1熒光探針技術(shù)研究新型植物源除草化合物作用機(jī)制提供基礎(chǔ),也為建立除草活性化合物快速篩選平臺提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株由加州大學(xué)伯克利分校Lewis J. Feldman教授提供,該材料為氧化還原敏感綠色熒光蛋白探針(roGFP1熒光探針)基因靶向表達(dá)到線粒體中的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(mitochondria-roGFP1,mt-roGFP1)。

禿杉素(TSC-3)、臺灣脂素H(Taiwanin H)、臺灣脂素E(Taiwanin E)(圖1)和氟樂靈均由本實(shí)驗(yàn)室提供;過氧化氫(H2O2)水溶液購于天津市大茂化學(xué)試劑廠;二硫蘇糖醇(DTT)水溶液購于生工生物工程(上海)股份有限公司;有機(jī)相微孔濾膜(0.22和0.45 μm)購于上海興亞凈化材料廠;熒光顯微鏡購于ZEISS公司。

圖1 供試化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of the test compounds

1/2 MS培養(yǎng)基:NH4NO31 650 mg·L-1、KNO31 900 mg·L-1、CaCl2·2H2O 440 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370 mg·L-1、KH2PO4170 mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.80 mg·L-1、Na2-EDTA 7.30 mg·L-1、KI 0.83 mg·L-1、H3BO36.20 mg·L-1、MnSO4·4H2O 16.90 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L-1、肌醇 100 mg·L-1、甘氨酸2 mg·L-1、瓊脂 10 000 mg·L-1、蔗糖 5 000 mg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的種植配制1/2 MS培養(yǎng)基,用1 mg·L-1NaOH溶液調(diào)其pH值至5.7～5.8,最后加入10 g·L-1的瓊脂粉,放入121 ℃高溫滅菌鍋中滅菌20 min,高溫滅菌后將其放置干凈無菌環(huán)境,隨后在超凈工作臺將mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子放入滅過菌的2 mL離心管中,用100%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇清洗消毒5 min,然后用15%次氯酸鈉溶液充分浸泡10 min,再用無菌水清洗3～4次,直至洗出液無色,在4 ℃冰箱放置2～3 d。

將待用儀器及培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基等用具放入超凈工作臺紫外滅菌30 min。30 min后用5 mL移液槍吸取20 mL加熱溶化后的1/2 MS培養(yǎng)基到10 cm×10 cm方形培養(yǎng)皿中,待其完全冷卻凝固,將用無菌水清洗3～4次春化后的mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因種子,用移液槍均勻播種到凝固培養(yǎng)基上,待水分完全蒸發(fā)后,用封口膜將培養(yǎng)皿密封封口。將培養(yǎng)皿豎直放置在光照度4 000 lx、(22±1)℃、16 h/8 h(光照時(shí)間/黑暗時(shí)間)光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。

1.2.2 氧化還原電位測定取1片干凈的載玻片于操作臺上,在載玻片中間滴1滴10%甘油,用小刷子刷開,使其均勻分布,挑選1株生長7 d的mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株置于載玻片上,制成玻片,然后利用顯微鏡分別在410和470 nm處觀察mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根部,并拍照(曝光值為2 000 ms),以30 mm小圓范圍測量熒光強(qiáng)度(圖2),保存數(shù)據(jù),其中410 nm/470 nm熒光強(qiáng)度比值為未處理值(設(shè)為x);在24孔板中取10孔,每孔加入1 mL無菌水,再加入0.1 μg·mL-1禿杉素溶液以及1、5和10 μg·mL-1禿杉素溶液、臺灣脂素H和臺灣脂素E,混合均勻,將上述測完的mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株完全浸泡在配制好的溶液中處理15 min,重新測定其410和470 nm處熒光強(qiáng)度,即為處理組;將上述同一mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株用100 mg·L-1H2O2處理15 min,測定410和470 nm熒光強(qiáng)度,其比值為最大氧化還原電位時(shí)的比值(設(shè)定為A);再將上述同一組mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株用100 mg·L-1DTT處理15 min,測定410和470 nm 熒光強(qiáng)度,其比值即為最小氧化還原電位時(shí)的比值(設(shè)定為B);按照公式(1)和公式(2)計(jì)算其氧化還原電位[10]

圖2 mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株(7d)根尖分區(qū)圖Fig.2 Different zoning area of the mt-roGFP1 labeled Arabidopsis thaliana plants(7 d)小圓直徑30 μm Small circle diameter is 30 μm;RC:根冠Root cap;PM:分生區(qū)Proximal meristem;TZ:過渡區(qū)Transition zone;EZ:伸長區(qū)Elongation zone.

y=(x-B)/(A-B)

(1)

f=y0+a/(1+exp(-y-x0)/b)

(2)

式(2)中:y0=0.01;a=0.99;x0=-288;b=13。重復(fù)上述步驟,10株mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株為1組重復(fù),共3組;試驗(yàn)重復(fù)3次,并拍照記錄相關(guān)信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù),相關(guān)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan’s Multiple Ranger Test,DMRT)進(jìn)行方差分析,采用Office 2016及Origin Pro 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度禿杉素對擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

從圖3可知:禿杉素處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后顯著降低其分生區(qū)線粒體氧化還原電位,且電位變化差值與化合物禿杉素的濃度大小有關(guān)。0.1、1、5和10 μg·mL-1禿杉素分別處理擬南芥15 min后,其分生區(qū)線粒體氧化還原電位變化最大差值的均值分別為13.06、18.59、27.74和29.92 mV;最小差值的均值分別為4.54、4.87、9.47和7.87 mV。

0.1、1、5和10 μg·mL-1禿杉素分別處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后,根冠線粒體氧化還原電位變化差異不顯著,但是分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)線粒體氧化還原電位變化差異均出現(xiàn)顯著性差異。

2.2 不同濃度臺灣脂素H對擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

從圖4可知:臺灣脂素H處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后顯著降低其分生區(qū)線粒體氧化還原電位,且電位變化差值與臺灣脂素H的濃度大小有關(guān)。1、5和10 μg·mL-1臺灣脂素H分別處理擬南芥15 min后,其分生區(qū)線粒體氧化還原電位變化最大差值的均值分別為12.21、15.72和22.67 mV;最小差值的均值分別為5.59、10.66和17.85 mV。1、5和10 μg·mL-1臺灣脂素H分別處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后,根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)線粒體氧化還原電位變化量均出現(xiàn)顯著性差異。

圖4 不同濃度臺灣脂素H對擬南芥根細(xì)胞氧化還原電位的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Taiwanin H on the redox potential of root cells of A.thaliana

2.3 不同濃度臺灣脂素E對擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

從圖5可知:臺灣脂素E處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后顯著降低其分生區(qū)線粒體氧化還原電位,且電位變化差值與臺灣脂素E的濃度大小有關(guān)。1、5和10 μg·mL-1臺灣脂素E分別處理擬南芥15 min后,其分生區(qū)線粒體氧化還原電位變化最大差值的均值分別為14.71、24.03和28.69 mV,最小差值的均值分別為5.78、8.12和12.71 mV。1、5和10 μg·mL-1臺灣脂素E分別處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后,根冠、分生區(qū)、成熟區(qū)線粒體氧化還原電位變化量差異不顯著,伸長區(qū)線粒體氧化還原電位差異顯著。

2.4 不同濃度氟樂靈對擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響

從圖6可知:氟樂靈處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后能夠顯著降低其分生區(qū)線粒體氧化還原電位,且電位變化差值與化合物氟樂靈的濃度大小有關(guān)。1、5和10 μg·mL-1氟樂靈分別處理擬南芥15 min后,其分生區(qū)線粒體氧化還原電位變化最大差值的均值分別為5.66、13.64和19.01 mV,最小差值的均值分別為1.25、8.96和15.20 mV。1、5和10 μg·mL-1氟樂靈分別處理mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株后,根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)以及成熟區(qū)線粒體氧化還原電位變化均出現(xiàn)顯著差異性。

圖6 不同濃度氟樂靈對擬南芥根尖細(xì)胞氧化還原電位的影響Fig.6 Effects of different concentrations of trifluralin on the redox potential of root cells of A.thaliana

3 討論

本文在mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞中檢測到mt-roGFP1探針能響應(yīng)外源化合物H2O2和DTT引起的氧化還原狀態(tài)變化,驗(yàn)證了mt-roGFP1探針的靈敏性和可逆性。用H2O2處理擬南芥時(shí),mt-roGFP1探針被氧化,其熒光強(qiáng)度比值升高,用DTT處理時(shí),mt-roGFP1探針被還原,熒光強(qiáng)度比值降低,證明mt-roGFP1探針能夠響應(yīng)組織中氧化還原狀態(tài)的改變,與前人的研究結(jié)果一致[2,11]。

研究發(fā)現(xiàn),外源化合物(氯化鈉等)、干旱、高溫或低溫等非生物逆境會使植物細(xì)胞氧化還原電位產(chǎn)生變化[12-14]。目前,研究具有除草活性的外源化合物對植物細(xì)胞氧化還原電位影響的研究較少。本試驗(yàn)利用mt-roGFP1熒光探針技術(shù),研究禿杉素、臺灣脂素E和臺灣脂素H對擬南芥植株根尖細(xì)胞線粒體氧化還原電位影響的結(jié)果表明,這些化合物均可以顯著降低mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根部分生區(qū)氧化還原電位,且在一定范圍內(nèi),隨著化合物濃度的增大,其對mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根部分生區(qū)氧化還原電位的影響也大。這3種化合物與對照組氟樂靈處理結(jié)果相比,其氧化還原電位差值整體呈增大趨勢,而對照組呈下降趨勢,這可能是由于該3種化合物與氟樂靈的作用機(jī)制不同導(dǎo)致的。另外,臺灣脂素E與臺灣脂素H處理后擬南芥根部氧化還原電位變化趨勢一致,這可能是由于兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)相似導(dǎo)致作用效果相似。不同濃度臺灣脂素H處理后,擬南芥根部各分區(qū)氧化還原電位變化均出現(xiàn)顯著性差異,而不同濃度臺灣脂素E處理后,只有伸長區(qū)氧化還原電位出現(xiàn)顯著性差異,兩者之間存在一定差異,這有待進(jìn)一步研究。

植物中活性成分的提取流程較為復(fù)雜且一般提取量少,而常規(guī)的測試活性方法速度慢且需求量較大[15-16],對其作用機(jī)制研究過程更是復(fù)雜,因此較難進(jìn)行活性測試和成分鑒定,而借助roGFP1熒光探針技術(shù)可在短時(shí)間(15 min)內(nèi)以更少的藥劑量進(jìn)行快速的活性測定。

綜上,在一定范圍內(nèi),禿杉素、臺灣脂素H和臺灣脂素E濃度越高,mt-roGFP1標(biāo)記的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株根尖細(xì)胞氧化還原電位值及變化越大,表現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系,且分生區(qū)的效應(yīng)更加明顯和敏感,因此可選分生區(qū)為主要研究區(qū)域。本研究結(jié)果對利用roGFP1熒光探針技術(shù)研究新型植物源除草劑對根系細(xì)胞線粒體的作用機(jī)制研究提供了基礎(chǔ),同時(shí)為建立除草活性化合物快速篩選平臺提供理論依據(jù)。