陳雪琴,龐倩倩,裴丹,任艷華,房經(jīng)貴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界上栽培最廣的果樹之一,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1],其果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)內(nèi)容。組蛋白乙?；潜碛^遺傳學(xué)的關(guān)鍵內(nèi)容,其狀態(tài)由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶(HDAC)共同調(diào)控[2]。研究發(fā)現(xiàn),組蛋白乙?；谌旧|(zhì)修飾中發(fā)揮重要作用,能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)基因表達(dá),影響各種生物過(guò)程,包括細(xì)胞分化、植物開花以及多種生物和非生物脅迫[3-4]。GCN5是一種重要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,是GANT家族成員,負(fù)責(zé)組蛋白 H3 和 H4 的賴氨酸乙?；?能通過(guò)與其他蛋白互作來(lái)影響植物多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[5]。目前,已有許多關(guān)于GCN5影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的報(bào)道,但是其基因功能的研究主要集中在模式植物擬南芥上。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥GCN5突變體會(huì)表現(xiàn)出花藥發(fā)育異常、頂端優(yōu)勢(shì)缺失、矮化、分生組織功能異常、幼芽過(guò)度增殖、下胚軸變長(zhǎng)、葉片毛狀體密度增加、雄蕊數(shù)量和排列存在缺陷等現(xiàn)象[6-9]。此外,GCN5在植物體對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。鹽脅迫處理下,擬南芥和小麥中的GCN5表達(dá)量迅速上調(diào),并且擬南芥GCN5突變體在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞壁完整性缺陷,表明GCN5在植物的耐鹽性響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[10]。

酵母雙雜交系統(tǒng)也被稱為相互作用系統(tǒng),它能夠在酵母體內(nèi)檢測(cè)蛋白之間的相互作用[11]。很多真核生物通常具有DNA特異結(jié)合域(DNA-binding domain)與轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain)2個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域,這2個(gè)結(jié)構(gòu)域互不影響,都具有各自的功能。但是,只有這2個(gè)結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在才能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。酵母雙雜交系統(tǒng)不僅可以研究2個(gè)已知蛋白的相互作用,還可以利用cDNA文庫(kù)篩選出與已知誘餌蛋白互作的多個(gè)蛋白,由于酵母雙雜系統(tǒng)的假陽(yáng)性較高,需配合雙分子熒光互補(bǔ)(BIFC)等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步陽(yáng)性蛋白的驗(yàn)證與篩選[12]。因此,本試驗(yàn)對(duì)葡萄中的VvGCN5基因進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析,包括基因的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗逆相關(guān)表達(dá)量、時(shí)空表達(dá)等,同時(shí),以pGBKT7-VvGCN5為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白,并使用BIFC技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,旨在為后期構(gòu)建葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與試劑

本試驗(yàn)涉及的所有質(zhì)粒以及葡萄cDNA文庫(kù)均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。DH5α、EHA105、Y2HGold菌株以及Carrier DNA與LiAC/PEG均購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司。氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)、利福平(Rif)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、酵母缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp,SDO)、酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。乙酰丁香酮(AS)、氯化鈉、2-嗎啉乙磺酸(MES)、無(wú)水葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購(gòu)自南京壽德生物試劑有限公司。α-半乳糖苷酶顯色底物(X-α-Gal)購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ、KplⅠ與YPD plus購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。氯化鎂和腺嘌呤(Ade)購(gòu)自上海麥恪林生化科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、同源重組試劑盒、基因克隆試劑盒(2×Phanta?Max Master Mix)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。酵母缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp/-Leu,DDO;SD/-Trp/-Leu/-His,TDO;SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade,QDO)購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載葡萄VvGCN5的蛋白序列、CDS序列、染色體位置;使用在線軟件 PRABI對(duì)葡萄VvGCN5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);運(yùn)用ExPASy預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì);通過(guò)PlantCARE網(wǎng)站,對(duì)VvGCN5的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析;利用InterProScan 網(wǎng)站對(duì)VvGCN5進(jìn)行結(jié)構(gòu)域以及GO分析;從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中查找生物或非生物脅迫下VvGCN5基因的表達(dá)量;在Grape eFP Browser網(wǎng)站中分析VvGCN5時(shí)空表達(dá)情況。

1.3 VvGCN5的亞細(xì)胞定位分析

以SalⅠ和KpnⅠ作為酶切位點(diǎn),線性化pRI101-GFP載體,構(gòu)建pRI101-VvGCN5-GFP重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α。將單克隆菌落利用pRI101通用引物(表1)進(jìn)行PCR驗(yàn)證,條帶正確的菌液送安徽生物通用公司進(jìn)行測(cè)序。提取測(cè)序正確菌液的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。將含有細(xì)胞膜Marker的菌液與pRI101-VvGCN5-GFP菌液共同瞬時(shí)注射于生長(zhǎng)6～8周的本氏煙草葉片中。培養(yǎng)48 h后將葉片切成小塊制成玻片,放到超高分辨率激光共聚焦顯微鏡(LSM800,Zeiss)下觀察熒光表達(dá)情況。

表1 本試驗(yàn)所用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 酵母雙雜交篩選VvGCN5的互作蛋白

以EcoRⅠ和BamHⅠ作為酶切位點(diǎn),線性化pGBKT7載體,構(gòu)建pGBKT7-VvGCN5重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將單克隆菌落利用BD通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證并測(cè)序。將pGADT7與pGBKT7-VvGCN5共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold中,涂板于DDO、DDO/X(添加了X-α-Gal的DDO)、QDO上檢測(cè)VvGCN5自激活,并將質(zhì)粒pGBKT7-VvGCN5與pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Y2HGold后涂板于SDO檢測(cè)VvGCN5毒性,以排除VvGCN5蛋白自身對(duì)酵母雙雜交的影響。

將葡萄cDNA文庫(kù)質(zhì)粒與pGBKT7-VvGCN5共轉(zhuǎn)并涂布于50個(gè)DDO平板上,30 ℃培養(yǎng)3～4 d,將長(zhǎng)出的菌落劃線到QDO平板上。再將長(zhǎng)出的菌落挑至1 mL DDO液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)2 d后取2 μL菌液點(diǎn)到QDO/X平板上。將變藍(lán)的菌落挑至1 mL DDO液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)2 d后用AD通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物使用電泳檢測(cè),將目的條帶送去安徽通用生物公司測(cè)序。

1.5 點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證

提取候選互作蛋白的酵母質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,以獲得更高濃度的質(zhì)粒。將高濃度質(zhì)粒與pGBKT7-VvGCN5共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)Y2HGold,涂布于DDO和QDO/X平板上。DDO平板上長(zhǎng)出白色或粉色菌落且QDO/X平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落,則認(rèn)為該質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒。將這些質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的菌落挑至1 mL DDO液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)2 d,取2 μL菌液點(diǎn)到DDO和QDO/X平板上。

1.6 雙分子熒光驗(yàn)證候選蛋白互作關(guān)系

選擇YNE(pSCYNE)和YCE(pSCYCE)為載體,以Xbal和BamHⅠ作為酶切位點(diǎn),對(duì)YNE和YCE進(jìn)行雙酶切。將上述酵母雙雜交篩選出的18個(gè)陽(yáng)性基因分別與YCE和YNE載體連接,分別構(gòu)建36個(gè)重組載體。同時(shí),構(gòu)建YCE-VvGCN5和YNE-VvGCN5重組載體。將需要進(jìn)行互作驗(yàn)證的2個(gè)重組載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105中,利用瞬時(shí)注射法將2種菌液同時(shí)注射于生長(zhǎng)6～8周的煙草葉片中,培養(yǎng)48 h后再將葉片用小刀切成小塊制成玻片,放到超高分辨率激光共聚焦顯微鏡下觀察520 nm處的熒光(YFP熒光蛋白設(shè)置為綠色)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvGCN5的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站對(duì)VvGCN5進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)VvGCN5位于7號(hào)染色體上,CDS序列長(zhǎng)度共1 626 bp,編碼541個(gè)氨基酸,其二級(jí)結(jié)構(gòu)由37.15%的α-螺旋、11.65%的延伸鏈、5.36%的β-折疊以及45.84%的無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖1-A),并且VvGCN5含有10段內(nèi)含子序列以及11段CDS序列(圖1-B)。通過(guò)InterPro網(wǎng)站檢索發(fā)現(xiàn)VvGCN5具有Acetyltransf_1和Bromodomain結(jié)構(gòu)域。此外,VvGCN5還涉及蛋白結(jié)合(GO:0005515)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0004402)以及N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0008080)3個(gè)功能。

圖1 VvGCN5二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)與基因結(jié)構(gòu)圖(B)Fig.1 The secondary structure(A)and gene structure(B)of VvGCN5VvGCN5二級(jí)結(jié)構(gòu)圖中紅色代表延伸鏈,藍(lán)色代表α-螺旋,紫色代表無(wú)規(guī)則卷曲,綠色代表β-折疊。In secondary structure diagram of VvGCN5,red represents extended strand,blue represents α-helix,purple represents random coil,green represents β-sheet.

分析VvGCN5前2 000 bp啟動(dòng)子順式作用元件(表2),發(fā)現(xiàn)VvGCN5具有ARE(厭氧誘導(dǎo)所必需的順式調(diào)節(jié)元件)、GT1-motif(光響應(yīng)元件)、TGACG-motif(參與 MeJA 反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件)、CAT-box(與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)節(jié)元件)、CGTCA-motif(參與 MeJA 反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件)等順式作用元件。這表明VvGCN5可能與光響應(yīng)、分生組織表達(dá)、MeJA反應(yīng)等功能有關(guān)。

在線網(wǎng)站NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提供了多個(gè)有關(guān)葡萄抗逆的RNA-seq 數(shù)據(jù)。由圖2可見:在GEO項(xiàng)目GSE129046[13]中,‘巨峰’和‘陽(yáng)光玫瑰’經(jīng)過(guò)殼聚糖處理后,VvGCN5表達(dá)量升高,特別是‘陽(yáng)光玫瑰’經(jīng)過(guò)殼聚糖處理后,VvGCN5表達(dá)量上升了25%。在GEO項(xiàng)目GSE116274[14]中,‘卡爾卡耐卡’漿果感染灰霉病后,VvGCN5表達(dá)量降低,推測(cè)VvGCN5可能與灰霉病有關(guān)。在GEO項(xiàng)目GSE157347[15]中,在葡萄轉(zhuǎn)色期進(jìn)行摘葉,待漿果完全成熟后,VvGCN5的表達(dá)量下降,表明VvGCN5可能與光照有關(guān)。

圖2 GEO項(xiàng)目中不同處理的VvGCN5表達(dá)量Fig.2 Expression levels of VvGCN5 of different treatments in the GEO projectA. GEO項(xiàng)目GSE116274中,CK1代表‘卡爾卡耐卡’未感染灰霉病;GEO項(xiàng)目GSE129046中,CK2表示‘巨峰’和‘陽(yáng)光玫瑰’受到灰霉病感染;B. CK表示不作處理。A. In GSE116274 of the GEO project,CK1 represents that ‘Calkanika’ berry is not infected with gray mold;in GSE129046 of the GEO project,CK2 represents that‘Kyoho’and‘Sunshine Rose’are infected with gray mold;B. CK means no treatment.不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level.

通過(guò)在線網(wǎng)站Grape eFP Browser分析發(fā)現(xiàn),VvGCN5(VIT_07s0141g00140)主要表達(dá)于葡萄的成熟莖、萌芽初期、心皮、種子上。對(duì)于葡萄漿果而言,自轉(zhuǎn)色期后,VvGCN5的表達(dá)量逐漸下降[16]。

2.2 VvGCN5的亞細(xì)胞定位

為了明確VvGCN5的表達(dá)位置,將含有膜Marker與pRI101-VvGCN5-GFP表達(dá)載體的懸浮液注射于煙草葉片中,培養(yǎng)48 h,用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)膜Marker顯示出紅色信號(hào),表明是煙草的細(xì)胞膜;表達(dá)載體pRI101-VvGCN5-GFP顯示出綠色熒光信號(hào),且信號(hào)表達(dá)強(qiáng)烈(圖3),表明pRI101-VvGCN5-GFP定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。

圖3 pRI101-VvGCN5-GFP的亞細(xì)胞定位圖Fig.3 Subcellular localization of PRI101-VvGCN5-GFP

2.3 誘餌載體pGBKT7-VvGCN5的毒性與自激活驗(yàn)證

pGBKT7-VvGCN5與pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài),涂于SDO平板后,發(fā)現(xiàn)平板A和平板B的菌落數(shù)量相似(圖4),表明誘餌載體pGBKT7-VvGCN5不會(huì)影響酵母生長(zhǎng),無(wú)毒性。將pGBKT7-VvGCN5和pGADT7共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài),分別涂布于DDO、DDO/X、QDO平板上,結(jié)果(圖5)表明,DDO與DDO/X上均長(zhǎng)白色菌落,QDO上不長(zhǎng)菌落。這表明pGBKT7-VvGCN5沒有自激活。

圖4 誘餌載體pGBKT7-VvGCN5的毒性檢測(cè)Fig.4 Toxicity detection of the baitvector pGBKT7-VvGCN5A. pGBKT7-VvGCN5轉(zhuǎn)化的SDO平板SDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5;B. pGBKT7轉(zhuǎn)化的SDO平板SDO plate transformed with pGBKT7.

圖5 誘餌載體pGBKT7-VvGCN5的自激活檢測(cè)Fig.5 Self-activation detection of bait vector pGBKT7-VvGCN5A. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7轉(zhuǎn)化的DDO平板DDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7;B. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7轉(zhuǎn)化的DDO/X平板DDO/X plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7;C. pGBKT7-VvGCN5+pGADT7轉(zhuǎn)化的QDO平板QDO plate transformed with pGBKT7-VvGCN5+pGADT7.

2.4 酵母雙雜交篩選VvGCN5的互作蛋白

將葡萄cDNA文庫(kù)質(zhì)粒與pGBKT7-VvGCN5共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)中,涂布50個(gè)DDO平板,再將平板上長(zhǎng)出的菌劃線至QDO上,共長(zhǎng)出93個(gè)菌落。將這93個(gè)菌落點(diǎn)板至QDO/X上,共發(fā)現(xiàn)58個(gè)菌落變藍(lán)。將58個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序,去掉重復(fù)數(shù)據(jù)后獲得了32個(gè)候選陽(yáng)性克隆。進(jìn)一步進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)只有18個(gè)菌落能夠在QDO/X平板上生長(zhǎng)并變藍(lán)。將這18個(gè)菌落對(duì)應(yīng)的蛋白序列作為候選互作蛋白,其基因信息如表3所示。

將這18個(gè)菌落挑至1 mL DDO液體培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)箱靜置2 d后,取2 μL菌液點(diǎn)到DDO平板和QDO/X平板上,結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn),陽(yáng)性對(duì)照pGBKT7-53+pGADT7-T的DDO平板上長(zhǎng)白色菌落,QDO/X平板上長(zhǎng)出藍(lán)色菌落;陰性對(duì)照pGBKT7-Lam+pGADT7-T的DDO平板上長(zhǎng)白色菌落,QDO/X平板上不長(zhǎng)菌落。

圖6 陽(yáng)性質(zhì)粒與pGBKT7-VvGCN5的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證Fig.6 Point-to-point verification of positive plasmids and pGBKT7-VvGCN5pGADT7-T+pGBKT7-53為陽(yáng)性對(duì)照,pGADT7-T+pGBKT7-Lam為陰性對(duì)照。P1—P18同表3。下同。pGADT7-T+pGBKT7-53 is used as positive control,and pGADT7-T+pGBKT7-Lam is used as a negative control. P1-P18 are same as Table 3. The same as follows.

2.5 雙分子熒光驗(yàn)證候選互作蛋白

利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)對(duì)上述18個(gè)候選互作蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果(圖7)表明,有8個(gè)蛋白依然與VvGCN5互作,分別是:SYT2(P1)、P5βR(P5)、GFA2(P9)、胞質(zhì)GAPDH(P11)、OLA1(P12)、probable XTH 32(P13)、FKBP20-1(P14)、rTl-Cyn(P15)。其中,對(duì)照組YCE+YNE未發(fā)現(xiàn)有YFP熒光。SYT2(YCE-P1+YNE-VvGCN5)、GFA2(YCE-VvGCN5+YNE-P9)、胞質(zhì)GAPDH(YCE-P11+YNE-VvGCN5)、rTl-Cyn(YCE-P15+YNE-VvGCN5)熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。FKBP20-1(YCE-P14+YNE-VvGCN5)與VvGCN5組合的熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上,且信號(hào)強(qiáng)烈。P5βR(YCE-P5+YNE-VvGCN5)、OLA1(YCE-VvGCN5+YNE-P12)與VvGCN5組合的熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞核上,其次出現(xiàn)在細(xì)胞膜上。probable XTH 32(YCE-P13+YNE-VvGCN5)與VvGCN5組合的熒光主要出現(xiàn)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。

圖7 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)檢測(cè)YNE-VvGCN5/YCE-VvGCN5與候選陽(yáng)性蛋白在植物體內(nèi)的相互作用Fig.7 The detected interaction between YNE-VvGCN5/YCE-VvGCN5 and candidate positiveproteins in plants detected by bimolecular fluorescence complementation technology

3 討論

GCN5是一種重要的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控與非脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。本研究表明,VvGCN5由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊以及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成,含有Acetyltransf_1和Bromodomain結(jié)構(gòu)域,Acetyltransf_1結(jié)構(gòu)域與N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān),Bromodomain結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用。同時(shí),分析VvGCN5啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn):CAAT-box和TATA-box相關(guān)順式元件最多,表明VvGCN5與轉(zhuǎn)錄密切相關(guān);并且VvGCN5還涉及激素響應(yīng)元件,包括MeJA、水楊酸響應(yīng)元件,表明VvGCN5的表達(dá)水平可能一定程度上受MeJA、水楊酸誘導(dǎo)。有研究表明,GCN5能通過(guò)抑制水楊酸積累的方式參與植物對(duì)生物脅迫的響應(yīng)[17]。VvGCN5也涉及光響應(yīng)元件。通過(guò)分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中包含VvGCN5的RNA-seq發(fā)現(xiàn),VvGCN5可能與光照有關(guān)。Benhamed等[18]發(fā)現(xiàn)擬南芥中GCN5參與光調(diào)節(jié)植物發(fā)育過(guò)程。對(duì)于葡萄漿果而言,自轉(zhuǎn)色期后,VvGCN5的表達(dá)量逐漸下降,推測(cè)VvGCN5主要調(diào)控葡萄轉(zhuǎn)色期前的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。本研究亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)VvGCN5位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上,這與Chang等[19]的研究結(jié)果相似。

酵母雙雜交是一種研究體內(nèi)蛋白與蛋白互作的方法,原理是利用Y2HGold中的報(bào)告基因篩選與誘餌蛋白互作的獵物蛋白。前人的研究中,AtGCN5和AtADA可以與冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(CBF1)相互作用,影響冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)[20];同時(shí),AtGCN5還可以與CLAVATA1 相互作用[21],影響擬南芥的乙烯反應(yīng)。

本試驗(yàn)中,酵母雙雜交與雙分子熒光技術(shù)分析結(jié)果表明,SYT2、P5βR、GFA2、胞質(zhì)GAPDH、OLA1、probable XTH 32、FKBP20-1、rTl-Cyn與VvGCN5直接互作。突觸結(jié)合蛋白2(SYT2)在花粉粒中高度表達(dá),在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用,并參與常規(guī)的分泌過(guò)程[22],表明VvGCN5可能通過(guò)與SYT2互作來(lái)影響花粉的萌發(fā)與花粉管的生長(zhǎng)。擬南芥中,SYT2被發(fā)現(xiàn)定位于質(zhì)膜和高爾基體上[22],本試驗(yàn)與之相似,SYT2與VvGCN5組合的熒光主要分布在細(xì)胞膜上。據(jù)報(bào)道,低溫或高鹽濃度等環(huán)境壓力會(huì)上調(diào)擬南芥中P5βR的表達(dá)[23]。此外,當(dāng)P5βR被敲除時(shí),擬南芥的葉脈圖案改變,莖和根中維管束的發(fā)育減少[24]。研究發(fā)現(xiàn),P5βR與VvGCN5組合的熒光主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上,表明VvGCN5可能通過(guò)與P5βR互作來(lái)影響植物的葉脈圖案、根和莖中的維管束等。GFA2在整個(gè)植物中都會(huì)表達(dá)[25]。此外,GFA2是線粒體J結(jié)構(gòu)域蛋白(JDP)的直系同源物,線粒體 JDP油菜素不敏感長(zhǎng)下胚軸2(BIL2)是BR生物合成的抑制劑[26],表明GFA2也可能與油菜素內(nèi)酯生物合成有關(guān)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是一種多功能蛋白,在各種細(xì)胞功能中發(fā)揮作用,能影響多個(gè)植物生長(zhǎng)進(jìn)程和非生物脅迫[27-31]。研究發(fā)現(xiàn),VvGCN5與胞質(zhì)GAPDH蛋白在細(xì)胞膜上互作。OLA1(Obg樣ATPase 1)是 YchF 亞家族 GTPase 中新發(fā)現(xiàn)的 ATPase 成員[32],它能影響耐熱性和HSP70 蛋白的表達(dá)水平,并通過(guò)轉(zhuǎn)錄獨(dú)立機(jī)制在細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用[33]。而VvGCN5與OLA1在細(xì)胞核上互作。木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶(XTH)是一種細(xì)胞壁修飾酶,通常與細(xì)胞擴(kuò)增相關(guān)[34]。XTH-32是編碼木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶的基因之一,它能轉(zhuǎn)錄調(diào)控響應(yīng)鋁脅迫的XET活性的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn),VvGCN5能與XTH-32蛋白在細(xì)胞膜上互作。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(FKBP)參與了許多生物過(guò)程,包括激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長(zhǎng)等[35]。據(jù)報(bào)道,TaFKBP20-1位于細(xì)胞核上[36],本研究與之相似,VvGCN5能與FKBP20-1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上互作。rTl-Cyn(氰酸水合酶)在依賴碳酸氫鹽和不依賴水的反應(yīng)中,能夠完全分解有毒氰酸鹽并生成氨和二氧化碳[37],增強(qiáng)植物對(duì)氰酸鹽的抵抗力。VvGCN5能與FrTl-Cyn蛋白在細(xì)胞膜上互作,表明VvGCN5可能通過(guò)調(diào)控FrTl-Cyn蛋白的表達(dá),從而調(diào)節(jié)植物對(duì)氰酸鹽的抵抗性。

綜上,VvGCN5可能通過(guò)與這8個(gè)蛋白互作并調(diào)控其基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)花粉萌發(fā)、葉脈圖案、果實(shí)軟化等多個(gè)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,而具體的調(diào)控途徑還有待進(jìn)一步的研究。