陳樸然 符 翔 郭志強(qiáng) 呂景智*

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,重慶 400715;2.四川省畜牧科學(xué)研究院,動物遺傳育種四川重點(diǎn)實驗室,成都 610066)

抗生素在動物養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中有生效快、抗菌范圍廣、效果明顯等特點(diǎn),但隨著抗生素的使用劑量增大,細(xì)菌的耐藥性以及藥物在動物機(jī)體的殘留引起了人們的廣泛關(guān)注。細(xì)菌對抗生素的耐藥性現(xiàn)象并不少見,已經(jīng)發(fā)展出耐藥性機(jī)制,以對抗來自占據(jù)相同環(huán)境生態(tài)位(生態(tài)位指物種在生態(tài)系統(tǒng)中的位置和作用,用以描述物種在非生物和生物環(huán)境中占有的地位)的其他的自然產(chǎn)生的抗生素[1]。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為細(xì)菌的耐藥性是嚴(yán)重威脅人類健康的因素之一。隨著2020年7月1日我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禁抗令的正式實施,養(yǎng)殖業(yè)迫切需要找到新的藥物,以一定程度上替代抗生素在動物生產(chǎn)中的作用。

噬菌體是一種純天然的抗細(xì)菌的病毒,內(nèi)在毒性較小,能夠自我復(fù)制,與宿主細(xì)菌的識別與結(jié)合具有高度的專一性且能夠與宿主一起進(jìn)化,能有效地解決對抗生素有耐藥性細(xì)菌引起再次感染的問題[2-3]。噬菌體具有多種優(yōu)勢,如宿主特異性、無需多次給藥、宿主存在時的自我復(fù)制、無不良副作用、對環(huán)境友好等[4]。在人類和動物健康領(lǐng)域,噬菌體療法在東歐地區(qū)已經(jīng)實施了60多年[5]。盡管噬菌體是在抗生素出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)的,但由于缺乏研究和應(yīng)用,噬菌體的殺菌效果仍然不及抗生素,以致于多年來抗生素仍然占據(jù)滅菌的主導(dǎo)位置[6]。近些年,由于不斷發(fā)展的細(xì)菌對抗生素耐藥性問題,科學(xué)家對噬菌體方面的研究重新產(chǎn)生了興趣[7-9]。

美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲食品安全局(EFSA)已批準(zhǔn)在農(nóng)業(yè)食品部門使用噬菌體雞尾酒療法(噬菌體雞尾酒療法是指3種或3種以上的噬菌體聯(lián)合應(yīng)用來殺滅細(xì)菌的一種治療方法)[10]。本文主要介紹了噬菌體的結(jié)構(gòu)、分類、裂解的作用機(jī)理,噬菌體在動物機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)等特性,以及噬菌體在家禽、家畜和水產(chǎn)動物中的應(yīng)用,以期為噬菌體在動物生產(chǎn)中的擴(kuò)大應(yīng)用范圍提供參考。

1 噬菌體概述

噬菌體是地球上最豐富的生物實體之一,在地球上有1031～1032個噬菌體,在生態(tài)系統(tǒng)中無處不在。這些細(xì)菌病毒具有DNA或RNA形式的遺傳物質(zhì),由蛋白質(zhì)外殼包裹[11]。噬菌體的長度變化很大,通常在24～200 nm。T4噬菌體是最大的噬菌體之一,其長度約為200 nm,寬度為80～100 nm;典型噬菌體基本特征包括1個頭部、1個衣殼和1個尾部[12](圖1)。此外具有20面體形狀或具有20個側(cè)面和細(xì)絲形狀的噬菌體也很常見。

圖1 噬菌體經(jīng)典結(jié)構(gòu)示意圖(左)以及其尾部區(qū)域通過穿透細(xì)胞壁將DNA插入宿主細(xì)菌細(xì)胞的示意圖(右)

1.1 噬菌體的分類

噬菌體分類復(fù)雜種類繁多,目前發(fā)現(xiàn)約6 000多種噬菌體,其中包括6 196種細(xì)菌噬菌體和88種古細(xì)菌噬菌體[13]。分類方法也較多,此處介紹常見的有2種分類方法。

第1種,根據(jù)噬菌體作用效果的不同,可分為2種:1)噬菌體處于裂解周期。感染宿主細(xì)菌后的噬菌體能將宿主菌裂解,并釋放大量新的噬菌體被稱為裂解性噬菌體。2)噬菌體處于溶原周期。噬菌體入侵宿主菌后,宿主菌沒有裂解死亡,噬菌體的遺傳物質(zhì)以噬菌體原的方式存在于宿主中的噬菌體被稱為溶原性噬菌體。

第2種,是國際病毒分類委員會發(fā)布,一共分為5個階段:1)第1階段,按照核酸類型(DNA/RNA)及其單雙鏈形式被劃分為5個群(群Ⅰ、群Ⅱ、群Ⅲ、群Ⅳ);2)第2階段,在每個群下面,再按照科間的親緣關(guān)系設(shè)立“目”,科間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的或者成員較少的直接設(shè)立科;3)第3階段,按照屬間的親緣關(guān)系設(shè)立科;4)第4階段,科下設(shè)立屬;5)第5階段,屬下設(shè)立種,再按照需求設(shè)立亞種[14]。噬菌體分類以群Ⅰ雙股DNA病毒之尾病毒目肌尾病毒科為例,詳見表1。

表1 噬菌體分類示例表

1.2 噬菌體的裂解與作用機(jī)理

裂解性噬菌體和溶原性噬菌體在宿主內(nèi)的裂解過程如圖2所示。溶原性噬菌體入侵宿主菌后,遺傳物質(zhì)會以噬菌體原的形式存在,無法裂解宿主菌[15],所以引起宿主裂解的通常是裂解性噬菌體。

圖2 噬菌體的裂解循環(huán)過程(左)和溶原循環(huán)過程(右)

裂解性噬菌體的作用機(jī)理一般分為5個階段,包括吸附、注入、復(fù)制、組裝和釋放[16]。

吸附階段:當(dāng)噬菌體特定的尾部吸附結(jié)構(gòu)(如尾絲、尾刺)識別到宿主細(xì)胞表面特定的受體時,會與之發(fā)生特異性結(jié)合,隨后感染開始。注入階段:一般只有噬菌體核酸遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主,外殼不進(jìn)入。復(fù)制階段:噬菌體核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞后,以自身核酸為模板,利用宿主細(xì)胞原有的酶等其他物質(zhì),開始表達(dá)早期蛋白質(zhì)。組裝階段:噬菌體組裝可以自發(fā)地或借助特定的酶進(jìn)行。釋放階段:子代噬菌體在宿主內(nèi)組裝完成后,在內(nèi)溶素等裂解酶的作用下從內(nèi)部裂解宿主細(xì)胞壁,破壞宿主,放出大量的噬菌體[17]。噬菌體的作用機(jī)理如圖3所示。

圖3 噬菌體的作用機(jī)理

1.3 噬菌體在動物機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程

噬菌體在動物機(jī)體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程包括噬菌體的吸收、分布、代謝和排泄。吸收是噬菌體進(jìn)入血液的過程。分布是噬菌體從血液輸送到身體組織。一旦到達(dá)目標(biāo)組織,就會被代謝并轉(zhuǎn)化為活性形式,最后一步是從體內(nèi)排出。噬菌體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程如圖4所示。

1.4 噬菌體的優(yōu)缺點(diǎn)

噬菌體具有許多優(yōu)點(diǎn):1)噬菌體具有高度特異性,僅識別特定的細(xì)菌,因此對天然微生物群無不利影響,不會導(dǎo)致菌群失調(diào);2)噬菌體在地球上的含量十分豐富,獲取方便,價格低廉;3)噬菌體在不同的環(huán)境條件下都能儲存,穩(wěn)定性相對較高;4)噬菌體是自我復(fù)制的,不需要重復(fù)給藥如果細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生耐藥性,那么噬菌體確實會自然進(jìn)化感染上述耐藥細(xì)菌,從而將細(xì)菌逃逸的機(jī)會降至最低,這是噬菌體相對于抗生素的一個優(yōu)勢[20]。

圖4 噬菌體在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程

噬菌體也有以下缺點(diǎn):1)有限的宿主范圍,無法起到廣譜的抗菌作用;2)有抗性突變體發(fā)生的風(fēng)險以及毒力因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能性;3)噬菌體需要宿主才能不斷生長和復(fù)制,如果沒有它們所特有的細(xì)菌病原體,它們將只能維持一段時間的活性。

2 噬菌體在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 噬菌體在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

在傳統(tǒng)飼養(yǎng)體系中,雞的種群密度很高,在一個農(nóng)場可以達(dá)到數(shù)十萬只,這增加了疾病快速傳播的風(fēng)險,并伴隨著經(jīng)濟(jì)損失。然而,同樣高的種群密度也有利于噬菌體在群體中的傳播,降低治療大量動物的成本。大腸桿菌、沙門氏菌在大規(guī)模的禽類養(yǎng)殖中是最常見的致病菌,感染大腸桿菌,可導(dǎo)致雞的肺泡炎、心包炎、肝周炎,是該行業(yè)發(fā)病率和死亡率的重要原因。Huff等[21]使用PT(噬菌體療法)治療試驗性大腸桿菌感染氣囊的雞;在第1項研究中,當(dāng)在大腸桿菌攻毒的同一天,使用了含有2種不同噬菌體混合制劑的氣溶膠噴霧,結(jié)果表明噬菌體能將雞的死亡率減半,當(dāng)試驗雞在噬菌體處理后被大腸桿菌攻毒3 d時,氣溶膠噴霧中更高濃度的噬菌體能夠顯著降低死亡率;在第2項研究中,建立將雞進(jìn)行感染然后治療的模型,結(jié)果表明,經(jīng)噬菌體治療的死亡率降低到7%,而未經(jīng)治療的雞死亡率約為48%[22]。

致病性大腸桿菌可在家禽養(yǎng)殖中顯著提高發(fā)病率和死亡率。Barrow等[23]的一項研究使用噬菌體預(yù)防雞的大腸桿菌敗血癥,未經(jīng)噬菌體治療的雞的死亡率幾乎為100%,即使將噬菌體治療推遲到臨床癥狀出現(xiàn)之前,仍然可以大大降低感染的嚴(yán)重程度。Xie等[24]的一項研究調(diào)查了噬菌體對雛雞腹瀉的影響,將噬菌體治療與抗生素治療(氯霉素0.1 mg/g體重)對大腸桿菌菌株感染的雞存活率的影響進(jìn)行比較,研究發(fā)現(xiàn),噬菌體療法可將雞的腹瀉發(fā)病率降低至26%,而對照組為51.6%;噬菌體處理組的存活率大約是對照組的10倍,是抗生素治療組的6倍;值得注意的是,噬菌體處理組的體重高于抗生素治療組。Toro等[25]也進(jìn)行了類似的試驗,結(jié)果表明,先感染鼠傷寒沙門菌,然后用噬菌體處理的雞的平均體重高于未經(jīng)處理的雞。

在家禽的噬菌體處理中沙門氏菌已成為目標(biāo),這種病原體是人類急性細(xì)菌性腸炎的主要原因。在2004年,歐盟報告了18萬多例沙門氏菌病。受污染的家禽和雞蛋被廣泛認(rèn)為是沙門氏菌的主要來源。此外,沙門氏菌的一些血清型可導(dǎo)致雞的發(fā)病和死亡,并在農(nóng)場環(huán)境中長期存活。Berchieri等[26]使用從人類污水中分離出的噬菌體處理雞,與未經(jīng)噬菌體處理的雞相比,可減少試驗性鼠傷寒沙門菌在雞腸道的定植數(shù)量,并顯著降低死亡率。Fiorentin等[27]使用從放養(yǎng)雞中分離的噬菌體來減少肉雞的腸炎沙門氏菌PT4的定植,用腸炎沙門氏菌攻擊1日齡肉雞,7 d后用1011PFU的3種噬菌體混合物處理,噬菌體感染5 d后,與對照組相比,記錄到盲腸腸炎沙門氏菌攜帶量減少(從4.86×109PFU到1.682×1010PFU);噬菌體治療后,PT組沙門氏菌定植的明顯減少持續(xù)了25 d。Atterbury等[28]研究證明,通過口服高濃度(1011PFU)噬菌體懸浮液,肉雞體內(nèi)腸炎鏈球菌和腸炎沙門氏菌的盲腸定植數(shù)量減少。Borie等[29]記錄到,噬菌體處理后肉雞腸道腸炎鏈球菌攜帶量顯著減少;與Huff等[21]的結(jié)果一樣,這項研究通過氣溶膠輸送噬菌體,顯著降低了雞腸炎沙門氏菌感染的發(fā)生(裂解噬菌體組感染率為72.7%,對照組為100%)。

家禽中噬菌體處理的另一種重要的人畜共患病的病原體是彎曲桿菌,家禽是人類食物鏈中彎曲桿菌的重要宿主。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為彎曲桿菌是腹瀉病的主要病因。自2005年以來,歐洲食品安全局已宣布彎曲桿菌病是最常見的食源性疾病之一,每年超過200 000例,占?xì)W盟人類人畜共患疾病的70%。彎曲桿菌很容易在雞腸內(nèi)定植,并已從大部分新鮮家禽產(chǎn)品中檢測到[30-32]。一項風(fēng)險分析表明,將尸體彎曲菌污染減少約2個數(shù)量級的干預(yù)措施可能導(dǎo)致人類彎曲菌病相應(yīng)減少[33]。

Atterbury等[34]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)存在噬菌體時,自然定植肉雞盲腸內(nèi)的彎曲桿菌數(shù)量通常較低。Wagenaar等[35]報道了用噬菌體治療雞彎曲桿菌的情況,并研究了預(yù)防性和治療性噬菌體應(yīng)用的效果。該研究包括為期10 d的噬菌體治療試驗,預(yù)防組在噬菌體治療的第4天感染空腸彎曲菌,而治療組在空腸彎曲菌感染的第6天進(jìn)行噬菌體治療;2組的空腸彎曲菌數(shù)量至少減少了約2個數(shù)量級,在1周內(nèi)下降到比未治療組低約10倍,所以噬菌體治療是減少肉仔雞空腸彎曲菌定植的一種有效的方法。

Loc Carrillo等[36]研究證明,與對照組相比,對感染空腸彎曲菌的肉雞進(jìn)行噬菌體處理后,5 d內(nèi)盲腸內(nèi)標(biāo)記菌株濃度減少。細(xì)菌載量的減少取決于噬菌體載量、噬菌體彎曲菌群和給藥后時間。Carvalho等[37]比較了口服灌胃和噬菌體雞尾酒添加到飼料中的區(qū)別;與給藥后4 d的口服途徑相比,通過喂食途徑給藥的噬菌體導(dǎo)致彎曲桿菌糞便計數(shù)的降低更明顯;結(jié)果表明,通過使用噬菌體雞尾酒,可以成功減少家禽中2種最常見的彎曲桿菌菌株數(shù)量。所以通過添加噬菌體到飼料中能更好地減少彎曲桿菌數(shù)量。與口服灌胃相比,這是一種在農(nóng)場應(yīng)用噬菌體療法的簡單且更實用的方法。

2.2 噬菌體在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用

Smith等[38]在對小鼠進(jìn)行早期試驗后,使用噬菌體雞尾酒治療小牛、小豬和羔羊的腸炎;用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌株O9∶K30.99進(jìn)行攻毒;用2種不同噬菌體的高滴度(1011PFU)混合物處理的9頭初乳喂養(yǎng)的小牛中沒有一頭患病(對照組為93%);在腹瀉開始時,用噬菌體治療的13頭缺乏初乳的小牛中,有2頭死亡(對照組為100%);這項研究表明,即使在出現(xiàn)臨床癥狀時使用噬菌體,也可以大大降低發(fā)病率和死亡率。用于挑戰(zhàn)仔豬和羔羊的腸毒素大腸桿菌菌株也取得了類似的成功。Callaway等[39]使用噬菌體混合物顯著減少綿羊腸道中大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量。在Barrow等[23]的一項研究中,一種特異性附著在大腸桿菌K1莢膜抗原上的溶性噬菌體,被用于治療腸道致病性大腸桿菌攻擊的初乳缺失犢牛,噬菌體治療動物的菌血癥被延遲,壽命延長。在Sheng等[40]的一項研究中,噬菌體治療無法減少大腸桿菌O157定植綿羊的數(shù)量;然而,通過在直腸-肛門連接處使用高滴度(1010PFU)的噬菌體和在飲用水中應(yīng)用低滴度(106PFU)的噬菌體,荷斯坦牛直腸中的O157數(shù)量顯著減少。Matthews等[41]認(rèn)為約5%牛的腸道中攜帶大量的大腸桿菌O157,對人類健康構(gòu)成較大風(fēng)險。雖然Sheng等[40]的研究沒有證明大腸桿菌O157在荷斯坦牛腸道中完全消除,但使用噬菌體治療減少這種病原體在反芻動物中攜帶和流行,降低人類接觸這種病原體的風(fēng)險,也可以產(chǎn)生可觀的公共效益。

2.3 噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重大損失主要是由于細(xì)菌和病毒引起的傳染病造成的[42]。其中,弧菌病、氣單胞菌病、愛德華氏菌病、分枝桿菌病、出血性敗血癥、潰瘍病和柱狀體病等細(xì)菌性疾病十分普遍,需要嚴(yán)格的衛(wèi)生管理,否則會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年至2017年期間,泰國主要海鮮市場之一的Mahachai市場的產(chǎn)品因衛(wèi)生管理疏忽造成貿(mào)易量減少,帶來的經(jīng)濟(jì)損失估計為73.8億美元,此外還有42億美元的出口損失[43]。一些常見的細(xì)菌感染包括鰭腐病、潰瘍病、鰓病會導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥[44]。美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全局已批準(zhǔn)在農(nóng)業(yè)食品部門使用噬菌體(雞尾酒療法)。

給藥時間是一個非常重要的因素。當(dāng)治療因感染而延遲時,死亡率通常顯著增加,最好的選擇是在感染前預(yù)防性服用噬菌體,并持續(xù)服用[45-46]。Jun等[47]通過在浸泡中預(yù)防性使用噬菌體,白蝦的存活率提高了75%,而在飼料中預(yù)防性使用噬菌體,白蝦的存活率提高了50%。與此類似,Schulz等[48-49]的研究結(jié)果表明,與感染后24 h治療組相比,在感染前1天服用噬菌體能將歐洲鰻魚存活率和虹鱒魚的存活率分別提高16%和6%。

Karunasagar等[50]研究發(fā)現(xiàn),與使用抗生素相比,使用噬菌體治療的蝦存活率提高了20%,表明噬菌體療法是蝦孵化場使用抗生素的有效替代方法。與此類似,Vinod等[51]在蝦哈維氏弧菌感染后,與抗生素處理組相比,噬菌體處理組蝦的存活率提高了46%,這表明噬菌體療法在降低死亡率上的效果可能比使用抗生素更有效。

3 不足與展望

由于噬菌體可以特異性裂解某些細(xì)菌,因而在抗菌方面具有較為廣泛的應(yīng)用前景,所以必須要更全面地了解噬菌體在動物生產(chǎn)中作為添加劑以及藥物的綜合影響,應(yīng)研究噬菌體在體內(nèi)的作用機(jī)理,以及增殖代謝方式。噬菌體在動物生產(chǎn)中需要關(guān)注的重心應(yīng)該集中在以下幾個方面:1)噬菌體在動物生產(chǎn)中的安全性。禁抗令實施后迫切需要有效的替代物,因為噬菌體本身是一種病毒,所以需要保證在動物體內(nèi)的安全性,避免噬菌體帶來的其他副作用,進(jìn)而影響生產(chǎn)效益。2)噬菌體在動物生產(chǎn)中的穩(wěn)定性:動物體內(nèi)環(huán)境、pH以及溫度等都會影響噬菌體的作用效果,噬菌體在溶液中的裂解效果比在固態(tài)中好,所以要保證在不同的動物體內(nèi),要有一個穩(wěn)定的效果。3)噬菌體在動物生產(chǎn)中的多樣性。一方面,因為噬菌體在起作用前需要先識別,噬菌體很難像抗生素那樣起到廣譜殺菌作用,因而噬菌體具有高度的特異性,可以針對不同的細(xì)菌種類培養(yǎng)不同的噬菌體,所以噬菌體的添加種類可以多樣或者噬菌體的混合制劑。另一方面,噬菌體的添加形式也可以是多樣的,例如在飲水中添加,或者作為飼料添加劑、噬菌體噴霧等多種形式來進(jìn)行添加。4)噬菌體在作為添加劑處理動物時的最佳濃度的問題。感染的多樣性指被吸附或感染的易感宿主與噬菌體的比率。了解MOI(是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值)的閾值對于優(yōu)化療效至關(guān)重要。例如,較低的MOI可能比較高的MOI效果好,因為病毒粒子可能通過聚集而失活。此外,MOI取決于宿主與噬菌體相互作用,并隨培養(yǎng)基、噬菌體和宿主而變化[52-53]。

4 小 結(jié)

噬菌體發(fā)現(xiàn)較早,且能特異性裂解某類細(xì)菌,未來的研究應(yīng)該更多地將關(guān)注放在噬菌體減少細(xì)菌感染以及腸道有害細(xì)菌等方面。研究對象可選取細(xì)菌感染較為突出的水產(chǎn)動物,以及腸道健康對動物生產(chǎn)影響較大的動物,例如雞、豬、兔、牛等。另一個關(guān)注點(diǎn)應(yīng)該放在噬菌體的添加方式以及噬菌體的最適MOI上。綜上所述,在飼料端“禁抗”的大背景下,鑒于噬菌體的特性,值得吸引更多科研工作者的研究和關(guān)注。