高靜娟， 朱晨宇， 柯玉琴， 鄭朝元， 李春英， 李文卿*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院國際鎂營養(yǎng)研究所，福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002； 3.福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350013）

碳氮代謝是烤煙最基本的代謝過程，在植物生長發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[1]，與煙葉品質(zhì)形成密切相關(guān)[2]。在煙葉生長發(fā)育和成熟過程中，只有碳氮代謝平衡協(xié)調(diào)，才能生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)煙葉。煙株葉綠體色素含量、光合特性、熒光特性以及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性是衡量碳氮代謝過程是否平衡的關(guān)鍵指標(biāo)，研究碳氮代謝對(duì)煙葉品質(zhì)形成的影響有重要意義。

烤煙碳氮代謝過程在很大程度上受到施肥處理的影響[3]，碳氮代謝平衡與施肥的種類、用量等密切相關(guān)[4-5]。吳飛躍等[6]研究表明，有機(jī)肥的施用能增強(qiáng)總糖、總氮積累能力，降低煙堿含量，對(duì)中部葉碳氮代謝影響較大；王樹會(huì)等[7]研究表明，增施草炭可以在一定程度上促進(jìn)煙株生長，提高煙葉產(chǎn)量、降低煙葉淀粉含量、改善煙葉品質(zhì)，且與草炭用量呈負(fù)相關(guān)；王林虹等[8]研究表明生物炭可以改善煙葉品質(zhì)；肖艷松等[9]發(fā)現(xiàn)，增施有機(jī)肥能促進(jìn)煙葉生長發(fā)育，延長大田生育期，提高中、上部葉耐熟性，改善煙葉化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性，提高上等煙比例，從而提高煙葉產(chǎn)值。

大量的化肥施用已不能有效地提高煙葉品質(zhì)[10]，且存在肥料浪費(fèi)和一定的環(huán)境問題[11]。近年來，福建烤煙生產(chǎn)中較為重視稻草回田和有機(jī)肥施用，可起到改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[12-13]、提高土壤質(zhì)量的作用[14]。福建煙區(qū)為煙-稻輪作模式，生產(chǎn)中一般只關(guān)注烤煙當(dāng)季施肥對(duì)烤煙生產(chǎn)的影響，水稻季施肥對(duì)烤煙生產(chǎn)影響的相關(guān)研究未見報(bào)道。另外，南方春煙區(qū)烤煙生長后期常遇高溫和強(qiáng)光天氣而導(dǎo)致煙葉高溫逼熟，影響煙葉烘烤特性，對(duì)上部葉烘烤質(zhì)量產(chǎn)生較大負(fù)面影響。鑒于此，本研究通過2 年定位試驗(yàn)，研究了烤煙季和水稻季分別施用餅肥對(duì)烤煙生長生理特性的影響，旨在為煙稻輪作區(qū)養(yǎng)分管理和烤煙生長后期煙葉養(yǎng)熟管理措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烤煙品種為福建省主栽品種‘翠碧一號(hào)’（CB-1），種子為包衣種子，由三明市煙草公司提供。試驗(yàn)所用化肥和餅肥均由三明金明農(nóng)資有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在福建省煙草科學(xué)研究所福州宦溪科研基地進(jìn)行。試驗(yàn)于2017 年烤煙采收結(jié)束后水稻季開始，2019 年烤煙生產(chǎn)季測定烤煙生理指標(biāo)。2017年晚稻收割后，按梅花5點(diǎn)取耕作層（約0—20 cm）土樣，過1 cm 篩后，混合均勻，四分法留1.5 kg 樣品，風(fēng)干，測定其養(yǎng)分含量；2018 年水稻收割后，每小區(qū)按照相同方法取樣，測定土壤養(yǎng)分含量。2017 年基礎(chǔ)土壤和2019 年栽煙前土壤養(yǎng)分狀況見表1。

表1 試驗(yàn)田土壤肥力狀況Table 1 Status of soil fertility in test plot

試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)施肥處理。①烤煙季，純化肥施用，施氮量為97.5 kg·hm-2；水稻季，純化肥施用，施純氮126 kg·hm-（2T1處理）。②烤煙季，化肥+餅肥處理，化肥氮施用為97.5 kg·hm-2，移栽時(shí)施用5 625 kg·hm-2餅肥；水稻季，純化肥施用，施純氮126 kg·hm-（2T2處理）。③烤煙季，純化肥施用，施氮量為97.5 kg·hm-2；水稻季，化肥+餅肥處理，施化肥純氮126 kg·hm-2，移栽時(shí)施用5 625 kg·hm-2餅肥（T3 處理）。④烤煙季，化肥+餅肥處理，施化肥氮量為97.5 kg·hm-2，移栽時(shí)施用5 625 kg·hm-2餅肥；水稻季，化肥+餅肥處理，施化肥純氮126 kg·hm-2，移栽時(shí)施用375 kg·hm-2餅肥（T4處理）。

各小區(qū)面積266.67 m2，不設(shè)重復(fù)。烤煙季施用化肥氮97.5 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O均為1∶0.8∶2.8；水稻季施用化肥氮126 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O 均為1∶0.59∶0.27；餅肥N、P2O5和K2O 含量分別為6.45%、2.70%和1.71%。在每年晚稻收割后將所有稻草粉碎后均勻撒回田間，灌水溶田，移栽前1 個(gè)月左右排水，曬干后起壟?？緹煼柿戏N類為專用肥、餅肥、鈣鎂磷肥和復(fù)合肥；水稻季肥料種類為碳銨、餅肥、過磷酸鈣、尿素和復(fù)合肥。煙株于1 月25 日移栽，4 月5 日?qǐng)F(tuán)棵，5 月16 日開始采收。田間管理同目前生產(chǎn)上優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)方法。

1.3 測定方法

2019年6月11日對(duì)烤煙上2棚葉采收時(shí)進(jìn)行取樣，每處理取4 株煙株的倒2、倒3 葉片帶回實(shí)驗(yàn)室，剔除主脈并剪碎混勻后，測定各生理指標(biāo)。

1.3.1 葉綠體色素測定 采用Arnon 法[15]測定葉綠體色素含量：稱葉圓片0.15 g置于25 mL容量瓶中，用80%丙酮定容，置于暗處浸提24～48 h，其間振蕩數(shù)次，待葉片完全發(fā)白、色素全部溶于丙酮溶液后，用UV-2601紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）分別測定470、646 和663 nm 處的OD 值，計(jì)算葉綠素a（chlorophyll a）、葉綠素b(chlorophyll b)、總?cè)~綠素（chlorophyll）和類胡蘿卜素（carotenoids）的含量，重復(fù)3次取平均值。

1.3.2 光合參數(shù)測定 在取樣前用CIRAS-Ⅱ型（英國PP-system 公司）便攜式光合儀測定光合參數(shù)。儀器葉室類型為直徑18 mm 的圓形葉室，測定葉面積2.5 cm2，葉室溫度為25 ℃，設(shè)定LED 內(nèi)置光照強(qiáng)度1 000 μmol·m-2·s-1，大氣環(huán)境作為CO2源。設(shè)置好參數(shù)后用葉室探頭夾住煙株最上部完全展開葉進(jìn)行測定，指標(biāo)包括凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、蒸騰速率(transpiration rate，Tr) 和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)，待測定指標(biāo)數(shù)據(jù)穩(wěn)定后進(jìn)行數(shù)據(jù)保存，每組重復(fù)測定5株葉片，計(jì)算平均值。

1.3.3 熒光參數(shù)測定 采用熒光儀（Pocket PEA,Hansatech,英國）測定，利用暗適應(yīng)夾暗處理待測葉片30 min，將暗適應(yīng)夾連接上光合儀探頭進(jìn)行測定，每組重復(fù)測定5株葉片，計(jì)算平均值。

初始熒光（initial fluorescence，F(xiàn)o）表示PSⅡ反應(yīng)中心全部開放時(shí)即原初電子受體全部氧化時(shí)的熒光水平，理論上用來指反應(yīng)中心未能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)時(shí)的葉綠素?zé)晒狻？勺儫晒猓╲ariable fluorescence，F(xiàn)v）反映可參與PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分，黑暗中最大可變熒光強(qiáng)度反映了輔酶A的還原情況。最大熒光（maximal fluorescent，F(xiàn)m），是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機(jī)構(gòu)全部PSⅡ中心都關(guān)閉時(shí)的熒光強(qiáng)度，這時(shí)所有的非光化學(xué)過程都最小，這是標(biāo)準(zhǔn)的最大熒光，可反映PSⅡ電子傳遞情況，F(xiàn)m=Fv+Fo。 最大光化學(xué)效率（maximum photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm）代表PSⅡ光化學(xué)的最大效率或PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，常與光抑制程度相關(guān)，在正常條件下，該值范圍在0.80～0.84，該值越高，反映植物受到光抑制的程度越低。Fv/Fo反映潛在光化學(xué)活性（potential photochemical efficiency）的高低，常用來度量PSⅡ的潛在光化學(xué)效率，常用于度量PSⅡ的潛在活性。

1.3.4 酶活性測定 采用上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司研發(fā)的植物二磷酸核酮糖羧化酶（Ribulose bisphosphate carboxylase，RuBPCase）酶聯(lián)免疫分析(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒測定，以每毫克蛋白中二磷酸核酮糖羧化酶含量(ng)定義為1 個(gè)酶活力單位（1U）。硝酸還原酶（nitrate reductase, NR）的活性參照鄒琦[15]的方法測定，以每克植物鮮重每小時(shí)產(chǎn)生亞硝態(tài)氮量(μg)為1 個(gè)酶活力單位（1U）。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性參照鄒琦[15]的方法測定，以每毫克蛋白每小時(shí)在540 nm 處消光值變化1 定義為1 個(gè)酶活力單位（1U）。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）活性測定參照趙越等[16]方法，以每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生蔗糖量(μg)為1個(gè)酶活力單位（1U）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，以Duncan’s 法比較不同處理間差異顯著性，利用Excel軟件進(jìn)行平均值的計(jì)算及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對(duì)煙株生長的影響

從圖1 可見，T1 處理長勢最弱，株型較小，且煙株葉片嚴(yán)重發(fā)黃，表現(xiàn)脫肥。T3 處理煙株長勢略好于T1處理，但明顯弱于T2和T4處理，株型相對(duì)較小，這可能是由于水稻季施用的有機(jī)肥殘留為煙株提供了一定的養(yǎng)分。T2 和T4 處理煙株長勢都較好，沒有明顯的差異，這可能是烤煙當(dāng)季增施有機(jī)肥可以更好地滿足煙株的生長發(fā)育。

圖1 不同處理下煙株長勢Fig. 1 Plant growth of tobacco under different treatments

2.2 不同處理對(duì)煙株葉綠體色素含量的影響

從表2 可見，不同處理葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為T4＞T2＞T3＞T1。其中，煙稻2 季均為化肥和有機(jī)肥配施處理（T4 處理）的煙株葉綠素a、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均顯著高于其他處理，葉綠素b 含量T4 與T2 處理差異不顯著，但顯著高于T1和T3 處理，后兩者之間葉綠素b 含量差異不顯著；T2 和T3 處理的總?cè)~綠素含量和葉綠素a 含量差異不顯著，但均顯著高于純施化肥的T1 處理；類胡蘿卜素含量在4 個(gè)處理間均表現(xiàn)為顯著差異。雖然烤煙季施肥T1 處理和T3 處理一樣，T2處理和T4處理一樣，但各葉綠體色素含量卻均表現(xiàn)為T3＞T1、T4＞T2，說明T3、T4 處理水稻季施用有機(jī)肥可以促進(jìn)煙株葉綠體色素含量提高，即水稻季施用有機(jī)肥的肥效可持續(xù)到烤煙季。而T2和T3處理一年中有機(jī)肥施用量相同，但類胡蘿卜素含量卻表現(xiàn)為T2＞T3，說明其有機(jī)肥肥效主要在當(dāng)季釋放。

表2 不同處理下煙株葉綠體色素含量Table 2 Chloroplast pigment content of tobacco plant under different treatments

2.3 不同處理對(duì)煙株光合特性的影響

從表3 可見，烤煙的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)均在T4 處理時(shí)最大，T1 處理時(shí)最小，整體表現(xiàn)為T4＞T2、T3＞T1；而胞間CO2濃度(Ci)為T4 處理時(shí)最小，T1 處理時(shí)最大。凈光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)均表現(xiàn)為T2＞T3，表明有機(jī)肥施用在烤煙季能更有效地促進(jìn)烤煙光合作用。由此可見，當(dāng)季有機(jī)肥的施用能有效增強(qiáng)烤煙凈光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)，從而在一定程度上增強(qiáng)葉片的光合作用，增加烤煙干物質(zhì)的積累。

表3 不同處理下煙株光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of tobacco plant under different treatments

2.4 不同處理對(duì)煙株熒光特性的影響

由表4 可知，T3 處理的初始熒光（Fo）最高，顯著高于T1和T2處理；T4處理最大熒光（Fm）最高，顯著高于T1 和T2 處理，且T2 處理顯著高于T1處理；各處理可變熒光（Fv）由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，且T4 處理顯著高于T1 處理，說明T4 處理煙株葉片PS Ⅱ活性最大。最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）表現(xiàn)為T1 處理顯著低于其他處理，表明T1 處理的抗逆性較弱； T4 處理PSⅡ潛在光化學(xué)效率（Fv/Fo）最大且顯著高于T1、T2 處理，表明T4處理對(duì)環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

表4 不同處理下煙株葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 4 Fluorescence characteristics of tobacco plant under different treatments

2.5 不同處理對(duì)煙株核酮糖二磷酸羧化酶活性的影響

從圖2 可見，T4 處理二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）活性最高，顯著高于T1 處理，T2、T3處理RuBPCase 活性高于T1 處理，但二者差異不顯著。說明煙稻2 季均化肥和有機(jī)肥配施能更好地提高烤煙RuBPCase活性，僅水稻季配施有機(jī)肥能在一定程度上提高第2 年烤煙RuBPCase 活性，但沒有僅烤煙季施用有機(jī)肥提高效果明顯。

圖2 不同處理下采收期烤煙RuBPCase的活性Fig. 2 RuBPCase activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.6 不同處理對(duì)煙株硝酸還原酶活性的影響

從圖3 可見，不同施肥處理采收期烤煙硝酸還原酶（NR）活性由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，其中，T4 處理顯著大于其他3 個(gè)處理，T1 處理顯著小于其他3 個(gè)處理，T2 和T3 處理差異不顯著。煙稻2 季均化肥和有機(jī)肥配施處理的煙株葉片NR 活性顯著高于其他施肥處理，煙稻2 季僅施用化肥處理的煙株葉片NR 活性顯著低于其他處理，表明配施有機(jī)肥提高了煙株NR 活性，促進(jìn)了煙株后期氮代謝過程。

2.7 不同處理對(duì)煙株谷氨酰胺合成酶活性的影響

從圖4 可見，不同處理采收期烤煙谷氨酰胺合成酶（GS）活性由大到小依次為T2＞T4＞T3＞T1，T2 處理GS 活性顯著高于其他3 個(gè)處理，T1、T3、T4 處理間差異不顯著，說明配施一定量有機(jī)肥能提高煙株對(duì)氨的同化及氮素的利用。T4 處理GS 活性顯著低于T2 處理，可能是由于T4 處理配施有機(jī)肥量較多，在一定程度上抑制了GS活性。

圖4 不同處理下采收期烤煙GS活性Fig. 4 GS activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.8 不同處理對(duì)煙株蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性的影響

從圖5 可以看出，不同處理采收期烤煙蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性由大到小依次為T4＞T2＞T3＞T1，T4處理SPS活性顯著高于其他3個(gè)處理，T1處理SPS活性顯著低于其他3個(gè)處理，T2、T3處理間差異不顯著。蔗糖合成酶（SS）活性由大到小依次為T2＞T4＞T3＞T1，T2、T4 處理間差異不顯著，但都顯著高于T1、T3處理，且T3處理SS活性顯著高于T1 處理。說明配施有機(jī)肥能顯著提高烤煙葉片光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為蔗糖的能力，且僅烤煙季配施比僅水稻季配施提高效果更明顯，煙稻2 季均化肥和有機(jī)肥配施提高效果最好。

圖5 不同處理下煙株SPS和SS活性Fig. 5 Activities of SPS and SS in tobacco plant under different treatments

3 討論

有機(jī)肥有助于改善煙葉外觀質(zhì)量、協(xié)調(diào)煙葉化學(xué)成分[17]。本研究表明，有機(jī)肥配施能夠提高煙葉葉綠體色素含量，提高光合電子傳遞，促進(jìn)光合作用，提高碳氮代謝關(guān)鍵酶活力。T2和T3處理在1 年中有機(jī)肥施用量相同，但類胡蘿卜素含量卻為T2＞T3，說明有機(jī)肥肥效主要在當(dāng)季釋放。當(dāng)烤煙季施肥相同時(shí)，葉綠體色素含量卻為T3＞T1、T4＞T2，這主要是由于T3、T4 處理水稻季施用了有機(jī)肥，有機(jī)肥肥效的釋放過程緩慢，除了被水稻利用外，肥效可持續(xù)到烤煙季。本研究中，配施有機(jī)肥處理的煙株總?cè)~綠素含量均高于僅化肥施用的煙株，這與宋玉川等[18]研究結(jié)果一致。所有處理的Fv/Fm均在0.53～0.85 之間，說明試驗(yàn)煙株P(guān)SⅡ功能完整，但T4處理的最大熒光（Fm）和可變熒光（Fv）均最大，說明T4 處理煙株P(guān)SⅡ活性最高，且T4 處理Fv/Fo最大，反映了PSⅡ?qū)ぐl(fā)能量的使用效率最高，能量耗散少。此結(jié)果與T4處理的凈光合速率（Pn）最大一致。本研究中T4 處理的凈光合速率（Pn）最大，而凈光合速率（Pn）高的處理氣孔導(dǎo)度（Gs）高，胞間CO2濃度(Ci)卻低；說明不同施肥處理的光合作用受到非氣孔因素的影響，可能是由于葉綠素含量的差異和光合電子傳遞效率的差異共同導(dǎo)致的。常浩杰等[19]在番茄幼苗中的研究也表明增施不同生物有機(jī)肥對(duì)光合速率均有促進(jìn)作用。曾祥難等[20]研究表明，合理配施復(fù)合有機(jī)肥在一定程度上有利于促進(jìn)烤煙生長的光合速率，并在生長后期仍能保持一定的生理代謝強(qiáng)度，持續(xù)地促進(jìn)光合產(chǎn)物合成。

與煙稻季均僅施用化肥相比，配施有機(jī)肥提高了煙葉RUBPCase、NR、GS、SPS 和SS 活性。本研究結(jié)果顯示，煙稻2 季均施用有機(jī)肥處理的煙株RUBPCase 活性高于其他處理，促進(jìn)其碳的同化代謝過程，與楊凱等[21]研究結(jié)果相同。煙稻季都施用有機(jī)肥的煙株SPS活性顯著高于其他施肥處理，促進(jìn)光合作用產(chǎn)物向蔗糖的轉(zhuǎn)化。張玉平等[22]研究結(jié)果也同樣顯示，有機(jī)無機(jī)肥配施有利于改善春玉米光合特性，提高玉米功能葉蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性。配施有機(jī)肥處理，煙株SS活性顯著高于純化肥處理，表明有機(jī)肥的施用促進(jìn)了蔗糖的分解，提高了煙株內(nèi)碳代謝水平。本研究結(jié)果顯示，煙稻2 季均配施有機(jī)肥能顯著提高煙株的NR 活性，這可能是由于有機(jī)肥的配施除提供碳源外，還在一定程度上增加氮源，在提高煙株碳代謝過程中協(xié)同促進(jìn)煙株氮代謝過程。宋玉川等[18]研究結(jié)果表明，配施有機(jī)肥的處理煙葉NR活性高于單施無機(jī)肥的煙葉，與本研究結(jié)果相同。T2 處理GS 活性顯著高于其他3 個(gè)處理，且T1、T3、T4 處理間差異不顯著，這可能是由于T4處理有機(jī)肥的施用量過多，在一定程度上抑制了GS 活性。楊凱等[21]研究表明熏蒸和有機(jī)替代均提高了西瓜果實(shí)氮代謝關(guān)鍵酶（NR、NiR、GS、GOGAT）的活性，與本研究結(jié)果相似。

目前烤煙生產(chǎn)中較為重視烤煙季有機(jī)肥的施用，從本研究結(jié)果看，水稻季施用餅肥對(duì)烤煙生長仍有較明顯的影響。因此，土壤質(zhì)量的提升和烤煙生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展是個(gè)綜合過程，應(yīng)綜合考慮烤煙和水稻2 季的施肥措施改進(jìn)。與煙稻季僅施用化肥相比，有機(jī)肥的配施提高了煙株葉綠體色素含量、光合電子傳遞效率進(jìn)而促進(jìn)煙葉光合作用，協(xié)調(diào)了碳氮代謝過程，以煙稻2 季均化肥有機(jī)肥配施處理的提高作用最明顯?？傮w來看，僅1季化肥有機(jī)肥配施時(shí)，施用在烤煙季的促進(jìn)效果更好。與其他處理相比，煙稻2 季均化肥有機(jī)肥配施更能滿足煙株對(duì)養(yǎng)分的需求，不僅能顯著的提高光合作用，更能夠促進(jìn)光合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及氮代謝水平，從而保證了煙株體內(nèi)各種代謝過程的順利進(jìn)行，有利于煙葉在田間養(yǎng)熟和優(yōu)質(zhì)煙葉的品質(zhì)形成。