單莉莉

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，黑龍江 佳木斯 154026）

水稻是我國重要的糧食作物之一[1]，在國民經(jīng)濟中占有非常重要的地位，種植面積占全球的19.10%，產(chǎn)量居世界第一，種植面積和總產(chǎn)均居我國糧食作物首位[2]，水稻產(chǎn)量穩(wěn)定對我國糧食安全有重要的戰(zhàn)略意義。水稻起源于熱帶地區(qū)，是喜溫植物[3]，對低溫較為敏感。近年來，全球氣候變化頻繁且異常，我國東北地區(qū)夏季頻發(fā)低溫，對水稻生產(chǎn)造成較大影響。低溫冷害引起水稻減產(chǎn)是世界范圍內(nèi)普遍存在的問題，不同地區(qū)的水稻品種在其生育期內(nèi)會遭受不同程度、不同類型的低溫危害[4]。營養(yǎng)生長時期，低溫脅迫能夠引起幼穗分化減緩并導致抽穗延遲[5]；生殖生長時期，低溫脅迫能夠導致雄配子不育、增加水稻籽實空殼率，最終引起減產(chǎn)[6]；在灌漿階段遭遇低溫則導致籽粒成熟不良和產(chǎn)量降低[5]。

水稻在孕穗期遭受低溫脅迫，能夠引起花粉敗育，導致水稻結實率降低，此時期如遭遇極端低溫甚至可引起花粉全部喪失育性，存在絕產(chǎn)的可能性。N-乙?；?5-甲氧基色胺又名褪黑素（melatonin，MT），是廣泛存在于植物、動物、原核生物體內(nèi)的一種吲哚類小分子[7]。在植物體內(nèi)，MT具有清除自由基保護細胞免受傷害、提高植物抗逆的能力[8]。研究表明，低溫脅迫下外源MT 能提高大豆幼苗的抗寒能力，增強光合作用并提高其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[9]；對煙草幼苗的低溫脅迫研究也發(fā)現(xiàn)，外源MT 能夠通過降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、提高可溶性糖和可溶性蛋白含量來提高幼苗對低溫的耐受性[10]。史中飛等[11]研究表明，外源MT處理通過降低質膜過氧化水平、保持細胞膜的完整性來增強油菜幼苗對低溫的適應性。外源MT 可顯著提高砷脅迫下水稻葉片和根系中的SOD、POD 和CAT 活性并降低MDA 含量，降低膜脂過氧化，進而提高水稻抵抗砷脅迫的能力[12]；葉面噴施MT能顯著提高水稻的耐鹽性[13]，外源MT 浸種能降低MDA 含量并提高SOD、POD活性，從而緩解水淹脅迫對水稻幼苗的毒害作用[14]。

截至目前，國內(nèi)外關于噴施外源MT 調(diào)控作物抵抗水分脅迫[15-16]、抵抗高溫強光[17]、抵抗鹽堿脅迫[18-19]等領域的研究較多，但未見外源MT 對水稻孕穗期低溫調(diào)控的相關報道。本文在已有研究的基礎上，開展孕穗期低溫對水稻葉片逆境生理指標和結實率影響的研究；同時開展預噴施外源MT緩解冷害的效果研究，旨在探明水稻孕穗期對低溫的應激響應及外源MT 對冷害的調(diào)控效應，以期為水稻防控冷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院耕作栽培研究所盆栽場和人工氣候室進行。選用龍粳11（LJ11，冷敏品種）和龍稻5（LD5，耐冷品種）為試驗材料，該供試品種的耐冷性已由項洪濤等[3]研究證實。供試褪黑素（MT）購自北京索萊寶科技有限公司，純度≥99.0%。

1.2 試驗設計

試驗采用盆栽方式栽插，每盆保苗3株[3,20]，在孕穗期進行預噴施外源MT及低溫處理。試驗共設置3 個處理（表1），每處理3 次重復。處理當天上午6點，選擇葉枕距在-3～0 cm 之間的有效分蘗進行掛牌標記，低溫處理溫度設定為16 ℃。8∶00 葉面噴施濃度100 μmol·L-1外源MT，用液量為22.5 mL·m-2，以噴施等量清水為對照。噴施后即進行低溫處理，持續(xù)5 d。

表1 試驗設計Table 1 Test design scheme

1.3 取樣方法

處理期間，每天取樣1 次，共取樣5 次，每天8∶30 各不同處理單獨取樣，迅速取下標記分蘗的葉片并裝入樣本袋內(nèi)（標記好編號），然后迅速放入液氮中，待葉片樣本完全冷凍后，移至-80 ℃冰箱中保存，用于逆境生理指標測定[3,20]。

低溫處理后，取樣期間各不同處理每天解除低溫脅迫材料15 盆，并移至室外，常規(guī)管理直至成熟，供結實率調(diào)查使用[3,20]。

1.4 測定方法

人工調(diào)查結實率；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定MDA 含量，采用氮藍四唑（nitrogen blue tetrazolium，NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用考馬斯亮藍G-250 染色法測定可溶性蛋白含量，具體步驟按照李合生等[21]的方法；采用碘化鉀方法測定H2O2含量，具體步驟參照Chakrabarty 等[22]的方法；采用硫酸蒽酮（anthrone sulfate）比色法測定可溶性糖含量，采用茚三酮比色法（ninhydrincolorimetric）測定脯氨酸（proline，Pro）含量，具體步驟按照張憲政[23]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗所有數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010 和DPS 19.05進行統(tǒng)計分析，文中涉及各表內(nèi)試驗數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤，試驗數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，選擇新復極差法進行顯著性差異檢驗。

2 結果與分析

2.1 孕穗期低溫及外源褪黑素對水稻結實率的影響

水稻孕穗期低溫脅迫可影響其結實率，但不同的耐冷型品種之間差異明顯。由表2 可知，孕穗期低溫對耐冷品種龍稻5 的影響不明顯，對冷敏品種龍粳11 影響非常明顯。隨著低溫時間的持續(xù)，龍稻5的結實率幾乎沒有變化，龍粳11結實率降低幅度較大。方差分析結果表明，經(jīng)過1～5 d的低溫處理，龍稻5的T1處理與CK之間均沒有顯著差異，而龍粳11 的T1 處理較CK 分別極顯著下降了5.96%、12.99%、21.80%、32.06%和45.26%。噴施外源MT對龍稻5的結實率調(diào)節(jié)效應微弱，對龍粳11效果顯著。經(jīng)方差分析可知，龍粳11低溫處理1～5 d，與T2相比，T1結實率分別極顯著提高了3.13%、7.81%、11.72%、16.64%和9.03%。

表2 不同處理下水稻的結實率Table 2 Seed-setting of rice under different treatments（%）

2.2 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片膜脂過氧化的影響

2.2.1 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片丙二醛含量的影響 丙二醛（MDA）是膜質過氧化的最終產(chǎn)物，具有細胞毒性，其含量反映植物逆境受損情況[3,20,24]。由圖1可知，低溫處理后，水稻葉片MDA含量表現(xiàn)為逐步增加的變化規(guī)律。處理1～5 d時，龍稻5 T2處理的MDA含量較CK分別極顯著提高了8.75%、10.66%、14.27%、16.43% 和17.52%；龍粳11 T2 的處理MDA 含量較CK 分別極顯著提高了11.69%、10.44%、13.46%、27.49%和42.14%。噴施外源MT對葉片MDA含量具有明顯的調(diào)控效應，與T2 處理相比，T1 可顯著或極顯著降低葉片MDA 含量。處理1～5 d 的龍稻5，T1 處理較T2 分別顯著下降了4.89%、5.00%、4.89%、4.94% 和1.92%。對龍粳11 來說，處理1 d 時，T1 處理較T2顯著下降了5.38%；處理2～5 d，T1 處理較T2 分別極顯著下降了4.08%、2.90%、7.94%和15.44%。

2.2.2 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片過氧化氫含量的影響 過氧化氫（H2O2）是重要的活性氧類自由基，通常表現(xiàn)為過量積累時產(chǎn)生毒害作用，其含量越高，細胞膜受損越嚴重[25]。由圖2可知，經(jīng)過低溫處理后，水稻葉片內(nèi)的H2O2含量呈逐漸升高的變化趨勢。就龍稻5而言，處理1～5 d時，T2處理較CK 分別極顯著增加48.50%、92.22%、158.79%、178.92%和190.06%。就龍粳11 而言，處理1～5 d時，T2 處理較CK 分別增加46.04%、107.84%、153.50%、161.65%和171.83%，均達到極顯著水平。噴施外源MT 能夠明顯降低H2O2含量，處理1～5 d時，龍稻5 T1 處理較T2 分別極顯著下降17.74%、18.38%、20.14%、13.82%和13.10%，龍粳11分別極顯著下降14.24%、25.94%、22.09%、15.58%和6.56%。

圖2 不同處理下水稻葉片的過氧化氫含量Fig. 2 H2O2 content in leaves of rice under different treatments

2.3 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

2.3.1 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片超氧化物歧化酶活性的影響 超氧化物歧化酶（SOD）

具有清除活性氧自由基的生理功能，其活性越高，對作物的保護能力越強[3,20,26]。如圖3 所示，低溫處理后，水稻葉片SOD 活性表現(xiàn)出“單峰曲線”的變化趨勢，且2 個品種均在處理后第4 天達到峰值。對龍稻5 來說，與CK 相比，處理1 d 時，T2 處理SOD 活性顯著提高2.30%，處理2～5 d 時，T2 處理SOD 活性分別極顯著提高5.58%、8.90%、13.23%和2.82%；對龍粳11 來說，處理1～5 d 時，T2 處理SOD 活性分別較CK 極顯著提高3.00%、5.87%、6.31%、7.76%和4.54%。噴施外源MT 可提高水稻葉片SOD 活性，尤其噴施后1～2 d 效果更為顯著。對龍稻5 而言，處理1～3 d 時，T1 處理較T2 分別極顯著提高2.80%、3.67%和3.95%，處理4～5 d 時，T1 處理較T2 分別顯著提高2.32%和2.34%；對龍粳11 來說，處理1～2 d 時，T1 處理較T2 分別極顯著提高3.27%和2.42%，處理4～5 d時，T1 處理較T2 分別顯著提高2.06%、2.51%和3.25%。

圖3 不同處理下水稻葉片的超氧化物歧化酶活性Fig. 3 SOD activity in leaves of rice under different treatments

2.3.2 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片過氧化物酶活性的影響 過氧化物酶（POD）具有清除H2O2的生理功能，POD活性越高，植物的抗逆性越強[26]。由圖4 可知，經(jīng)過低溫處理后，水稻葉片內(nèi)POD 活性的變化趨勢與SOD 活性相同，亦表現(xiàn)為“單峰曲線”，且均在處理第4天達到峰值，之后開始下降。具體來看，低溫引起水稻葉片內(nèi)的POD活性增加，就龍稻5 來說，處理1 d 時，T2 處理較CK 顯著提高8.18%，處理2～5 d 時，T2 處理較CK分別極顯著提高40.76%、70.83%、99.10% 和40.63%；就龍粳11 而言，處理1～5 d 時，T2 處理較CK 分別極顯著增加11.17%、50.87%、78.94%、105.32%和45.07%。噴施外源MT 能夠進一步提高POD活性，處理1～5 d時，龍稻5的T1處理較T2分別極顯著增加18.00%、11.44%、9.17%、10.32%和13.30%；龍粳11 的T1 處理較T2 分別極顯著增加7.99%、6.14%、5.42%、6.42%和5.88%。

圖4 不同處理下水稻葉片的過氧化物酶活性Fig. 4 POD activity in leaves of rice under different treatments

2.3.3 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片SOD/POD 的影響 SOD/POD 比值越小，作物的抗氧化能力越強。由表3 可知，經(jīng)過低溫處理后，水稻葉片內(nèi)的SOD/POD變小，且均在處理第4天時最低，整體表現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢。龍稻5在處理1 d 時，葉片內(nèi)的SOD/POD 比值T2 處理顯著低于CK，在處理2～5 d時，T2處理均極顯著低于CK；龍粳11在處理1～5 d時，T2處理均極顯著低于CK。噴施外源MT 可進一步降低水稻葉片SOD/POD比值，龍稻5在處理1～5 d時，T1處理均顯著或極顯著低于T2；龍粳11在處理1 d時，T1處理極顯著低于T2，在處理2～3 d時，T1處理顯著低于T2，在處理4～5 d時，T1與T2處理之間無顯著差異。

表3 不同處理下水稻葉片的SOD/POD比值Table 3 SOD/POD ratio in leaves of rice under different treatments

2.4 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片滲透調(diào)節(jié)物質含量的影響

2.4.1 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片可溶性蛋白含量的影響 可溶性蛋白是親水性膠質，含量越高，細胞保水力越強，進而降低逆境傷害程度[27]。由圖5 可知，低溫處理后，水稻葉片內(nèi)可溶性蛋白含量呈逐漸增加的變化規(guī)律。對龍稻5 來說，處理1～5 d，T2 處理較CK 分別極顯著增加13.39%、18.90%、29.37%、31.84%和42.92%；對龍粳11 而言，處理1～5 d，T2 處理較CK 分別極顯著增加11.55%、19.86%、26.64%、33.50%和37.69%。噴施外源MT 進一步提高了水稻葉片內(nèi)可溶性蛋白含量，對龍稻5 來說，處理1～5 d，T1 處理較T2分別極顯著提高6.85%、12.71%、10.13%、10.06%和10.69%；對龍粳11 來說，處理1～5 d，T1 處理較T2 分別極顯著提高6.63%、11.17%、9.39%、9.96%和11.41%。

圖5 不同處理下水稻葉片的可溶性蛋白的含量Fig. 5 Soluble protein content in leaves of rice under different treatments

2.4.2 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片可溶性糖含量的影響 可溶性糖能增加細胞束縛水含量，進而增強細胞液流動性，促進細胞免受逆境損傷[27]。由圖6 可知，低溫處理后，水稻葉片內(nèi)可溶性糖含量逐步提高，噴施外源MT 進一步提高了可溶性糖的含量。對龍稻5 來說，處理1～5 d，T2處理較CK 分別極顯著提高16.21%、25.34%、37.67%、40.22%和42.16%；T1處理較T2分別極顯著提高5.15%、5.13%、7.50%、7.23%和8.22%。對龍粳11 而言，處理1～5 d，T2 處理較CK 分別極顯著提高21.58%、33.47%、45.50%、48.73% 和51.51%；T1 處理較T2 分別極顯著提高7.10%、6.28%、4.38%、4.47%和4.93%。

圖6 不同處理下水稻葉片的可溶性糖的含量Fig. 6 Soluble sugar content in leaves of rice under different treatments

2.4.3 孕穗期低溫及外源MT 對水稻葉片脯氨酸含量的影響 脯氨酸具有促進細胞束縛水含量積累的生理功能，其含量越高，降低細胞水勢越明顯，進而提高細胞抵御低溫的能力[27]。由圖7 可知，低溫處理后，水稻葉片內(nèi)脯氨酸含量逐步增加，噴施外源MT 進一步增加了脯氨酸的含量。對龍稻5來說，處理1～5 d，T2處理較CK分別極顯著提高15.12%、42.32%、68.72%、82.49% 和95.38%；T1 處理較T2 分別極顯著提高22.36%、14.00%、12.52%、10.56%和8.67%。對龍粳11 而言，處理1～5 d，T2 處理較CK 分別極顯著提高9.11%、20.81%、35.58%、50.31%和59.30%；T1 處理較T2 分別極顯著提高17.01%、22.02%、11.14%、7.74%和8.14%。

圖7 不同處理下水稻葉片的脯氨酸的含量Fig. 7 Proline content in leaves of rice under different treatments

3 討論

3.1 孕穗期低溫對不同耐冷性水稻品種結實率的影響

低溫是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的最主要逆境之一[28]。寒地水稻在我國水稻生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位，特殊的地理位置和氣候變化導致低溫冷害頻發(fā)[29]。孕穗期持續(xù)低溫會導致結實率降低，且在不同品種間存在差異[30]，同一品種在相同的低溫環(huán)境下，低溫持續(xù)時間越長對結實率的影響越嚴重[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，龍粳11 和龍稻5 對低溫的應激反應不同，龍稻5對低溫鈍感，16 ℃條件下處理5 d 其結實率仍未發(fā)生顯著下降，而龍粳11 在16 ℃處理后，短時間內(nèi)結實率就極顯著下降，隨著處理時間的持續(xù)結實率下降速率和幅度增大，這與曾憲國等[32]、項洪濤等[3,20]的研究結果相同。說明孕穗期低溫引起水稻結實率降低，對水稻產(chǎn)量造成影響，這與孕穗期低溫導致花粉育性下降有直接關系[30]。

3.2 孕穗期低溫對水稻葉片細胞膜的損傷以及MT的緩解效應

內(nèi)源激素調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，并調(diào)控其對脅迫的響應[33]。MT 是一種普遍存在于植物體內(nèi)的新型植物激素，不僅能夠調(diào)節(jié)植物多種生長發(fā)育過程，還能調(diào)節(jié)植物對多種非生物脅迫的抗性[34]，并通過調(diào)控穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重等產(chǎn)量因子變化，達到相對提高作物產(chǎn)量的效果[35]。本研究表明，外源MT 能在一定程度上緩解低溫對水稻結實率的影響，這與葉君等[35]的研究結果一致。這可能與外源MT 維持了細胞膜的流動性有關，低溫條件下植物會產(chǎn)生過量的MDA 和H2O2，MDA 是細胞膜過氧化的產(chǎn)物，其含量可作為質膜受損的重要指標[36]，過量的MDA 不利于細胞膜磷脂分子的排列，并影響細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的含量和占比，進而影響細胞膜的流動性和選擇透性，造成生理損傷。本研究也表明，低溫會引起水稻葉片MDA 和H2O2含量急速增加，但噴施外源MT 可以顯著或極顯著降低MDA 和H2O2含量，這與陳莉等[37]在棉花上的研究結果一致。婁慧等[38]也指出，低溫脅迫下外源MT 能有效減少MDA 和H2O2的產(chǎn)生和積累，緩解低溫脅迫對細胞的傷害，增強其對低溫逆境的抵抗能力。

3.3 孕穗期低溫對水稻葉片抗氧化系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)物質含量的影響

正常溫度下，植物能自動調(diào)節(jié)活性氧類物質的產(chǎn)生和清除，使其在體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但在低溫條件下，水稻生長受到抑制，導致葉片內(nèi)活性氧類物質過量積累并加劇膜脂過氧化程度[39]。植物通過SOD、POD 等抗氧化酶的協(xié)同作用，維持活性氧代謝平衡，有效清除細胞內(nèi)多余的活性氧，降低水稻細胞膜的傷害[40]。SOD 作為抗氧化過程中重要的活性酶，具有清除超氧自由基的特性，但也伴隨著產(chǎn)生過量的H2O2，而POD 具有清除H2O2的功能，所以SOD/POD 比值可以作為衡量作物抗氧化能力的指標，SOD/POD 比值越低，其抗氧化能力越強。植物在遭受低溫脅迫的同時，還會遭受滲透脅迫和水分脅迫，一些具有保水作用的滲透調(diào)節(jié)物質如可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等物質的含量會增加，以維持細胞的滲透平衡，降低低溫對作物的損傷[41]?？扇苄缘鞍缀颗c水稻的抗寒性呈正相關，可溶性蛋白含量越高，水稻的抗寒能力越強[42]。此外可溶性蛋白還能與可溶性糖一起聚集在葉綠體等重要細胞器的周圍，保護其免受逆境脅迫損傷[42]。本研究表明，孕穗期低溫導致水稻葉片內(nèi)的SOD 和POD 活性極顯著增強，SOD/POD 比值也顯著或極顯著降低，同時，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量也極顯著增加，說明一旦逆境條件形成，水稻會開啟自我保護機制，通過自身的防御系統(tǒng)來抵御低溫的傷害。

3.4 外施褪黑素對水稻抗寒性的調(diào)節(jié)效應

噴施外源MT 對水稻葉片內(nèi)SOD 和POD 活性具有明顯的調(diào)控效應，尤其是低溫條件下極顯著增加了SOD和POD活性、極顯著增加了可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，并降低了SOD/POD 比值，說明外源MT 能夠緩解低溫對水稻的傷害。這與于奇等[43]研究外源MT 對大豆抗寒性的試驗結果類似；潘紅艷等[44]也明確指出在低溫脅迫下，適宜水平的MT 能夠有效降低MDA 含量，增強POD活性，表現(xiàn)出更強的抗寒性。