許琰杰,沈 文,臧海洋,徐 逸,劉麗娜,楊 芳

(南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院脾胃病科,江蘇 南通 226000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是由于中樞神經(jīng)功能以及自主神經(jīng)功能紊亂而引起腸道的運(yùn)動(dòng)和分泌功能失調(diào)的一種疾病,以慢性、反復(fù)發(fā)作的腹部不適和疼痛為特征[1],病情反復(fù)遷延不愈,還可出現(xiàn)睡眠障礙、精神抑郁或煩躁性慢性疲勞綜合征等胃腸道外癥狀。近年來,IBS全球發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant IBS, IBS-D)作為IBS的常見類型[2],其發(fā)病率高且好發(fā)于中青年。因此,有必要尋找高效安全的治療方法。IBS的具體原因還未明確,目前已有文獻(xiàn)報(bào)道該病與腸道菌群具有相關(guān)性,腸道微生態(tài)失衡在IBS發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[3]。內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是IBS-D的重要體現(xiàn)[4],也可能是腦—腸軸功能異常的表現(xiàn)[5]。因而,IBS-D易出現(xiàn)抑郁、煩躁等情緒障礙,即中醫(yī)理論的“心腎不交”。

交泰丸源自明代《韓氏醫(yī)通》,由黃連、肉桂組成,是治療“心腎不交”的經(jīng)典方劑。交泰丸及其加味方主要用于失眠、心律失常及遺精等自主神經(jīng)功能失調(diào)疾病,對(duì)IBS亦有較好的治療效果。研究[6]顯示,加味交泰丸能夠改善IBS-D患者的臨床癥狀,降低血清白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6,IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平且安全性較高。但對(duì)加味交泰丸治療IBS-D的機(jī)制研究尚少,尤其對(duì)腸道菌群的影響尚未有報(bào)道。因此,本研究擬基于16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù),探究加味交泰丸對(duì)IBS-D患者腸道菌群的影響。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 IBS診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。在過去的3個(gè)月中,平均每周至少1 d反復(fù)出現(xiàn)腹痛,診斷前癥狀出現(xiàn)至少6個(gè)月,近3個(gè)月符合以下兩項(xiàng)或多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn):①與排便有關(guān);②與大便頻率的變化有關(guān);③與糞便形式(外觀)的變化有關(guān)。

1.1.2 情緒障礙診斷標(biāo)準(zhǔn) 焦慮的評(píng)估采用焦慮自測(cè)量表(self-rating anxiety scale, SAS),SAS含有20個(gè)反映焦慮主觀感受的項(xiàng)目,每個(gè)項(xiàng)目按癥狀出現(xiàn)的頻度分為4級(jí)評(píng)分,其中15個(gè)為正向評(píng)分,5個(gè)為反向評(píng)分。50～59分為輕度焦慮,60～69分為中度焦慮,69分以上為重度焦慮。抑郁的評(píng)估采用抑郁自測(cè)量表(self-rating depression scale,SDS),SDS含有20個(gè)反映抑郁主觀感受的項(xiàng)目,每個(gè)項(xiàng)目按癥狀出現(xiàn)的頻度分為4級(jí)評(píng)分,其中10個(gè)為正向評(píng)分,10個(gè)為反向評(píng)分。63～72分為中度抑郁,72分以上為重度抑郁。

1.1.3 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) IBS-D的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[8]以及《腸易激綜合征中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(2017)》[9]中IBS-D的辨證分型,證型為心腎失交兼肝郁脾虛證,由兩位副主任醫(yī)師對(duì)證候進(jìn)行辨證,以保證其統(tǒng)一性和權(quán)威性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡為18～65周歲;②符合IBS-D的西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn),且中醫(yī)辨證屬于心腎失交兼肝郁脾虛證;③未合并嚴(yán)重心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)等疾病或腫瘤;④患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①已知對(duì)試驗(yàn)所用藥物過敏或有不良反應(yīng)的患者;②有精神疾病史,不能完全配合完成該臨床試驗(yàn)的患者;③有高血壓病、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)或甲狀腺功能減退、消化道器質(zhì)性病變的患者;④近3個(gè)月內(nèi)服用過影響胃腸功能的藥物。

1.4 一般資料 選取2020年10月至2021年10月南通市中醫(yī)院門診部招募的IBS-D合并情緒障礙(抑郁或焦慮)患者60例作為研究對(duì)象,經(jīng)中醫(yī)辨證均為心腎失交兼肝郁脾虛證。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為中藥組與西藥組,每組30例。西藥組男16例,女14例,年齡18～65歲,平均年齡(42.77±12.44)歲;中藥組男13例,女17例,年齡18～65歲,平均年齡(38.70±12.74)歲。兩組患者的一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外選擇在南通市中醫(yī)院接受體檢的健康者共10例作為健康對(duì)照組,男5例,女5例,年齡18～65歲,平均年齡(40.40±2.70)歲。本研究經(jīng)南通市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批號(hào): 通中院〔2020〕字006。

2 方法

2.1 干預(yù)方法 中藥組采用加味交泰丸治療。藥物組成:炒白芍、炒山藥各20 g,茯苓15 g,白術(shù)、陳皮、防風(fēng)、五味子各10 g,炒柴胡、木香各6 g,肉豆蔻、炮姜、炙甘草各5 g,黃連、肉桂各3 g。中藥劑型選用顆粒劑,由南通市中醫(yī)院中藥房提供,每日1劑,早晚分服150 mL,共治療4周。

西藥組患者服用地衣芽孢桿菌活菌膠囊(規(guī)格:每粒0.25 g;東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)S10950019),每日3次,每次2粒,共治療4周。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸道菌群 依照標(biāo)準(zhǔn)糞便采樣流程,嚴(yán)格遵循無菌化操作原則,收集3組受檢者糞便樣本于無菌管中。使用PowerSoil DNA分離試劑盒按照說明書對(duì)糞便樣本進(jìn)行DNA提取。采用0.8%的瓊脂糖凝膠檢查基因組DNA的純度和質(zhì)量。采用引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)。對(duì)每個(gè)樣品,正向引物和反向引物的5′端分別添加10位條形碼序列。PCR使用5 μL DNA(總模板量為30 ng)在Mastercycler Gradient上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為95 °C變性、55 °C退火、72 °C延伸各45 s。測(cè)序平臺(tái)系統(tǒng)為Illumina 2.6系統(tǒng)。序列分析利用微生物生態(tài)學(xué)定量研究技術(shù)對(duì)原始序列進(jìn)行修飾,通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)。可根據(jù)相似度水平,對(duì)所有序列進(jìn)行OTUs劃分,通常對(duì)97%相似水平下的OTUs進(jìn)行生物信息學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果,使用Mothur進(jìn)行分析,使用R語言工具制作稀疏曲線。

2.2.2 臨床療效 分別于治療前及治療4周后采用IBS嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)(irritable bowel syndrome-severity scoring system, IBS-SSS)評(píng)估兩組患者臨床療效,該評(píng)分系統(tǒng)從腹痛程度、腹痛頻率、腹脹情況、排便滿意度及生活困擾度5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分越高表明患者癥狀越嚴(yán)重。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用QIIME v.1.8.0進(jìn)行微生物α多樣性分析,為了估計(jì)β多樣性,采用R包進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA),組間差異使用Anosim分析。不同分類學(xué)水平的菌群差異使用Wilcoxon檢驗(yàn)。采用LEfSe(LDA Effect Size)分析進(jìn)行多個(gè)分組之間的比較:采用單因素方差分析檢測(cè)不同分組間豐度差異顯著(P<0.05)的物種,再用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估,選取LDA評(píng)分>3的物種。

3 結(jié)果

3.1 兩組患者治療前后IBS-SSS評(píng)分比較 兩組患者治療前IBS-SSS評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療4周后,兩組患者IBS-SSS評(píng)分均較治療前顯著下降(P<0.05),且中藥組評(píng)分降低程度更顯著(P<0.05)。見表1。

3.2 測(cè)序數(shù)據(jù) 在97%相似度條件下,對(duì)序列進(jìn)行操作單元聚類,獲得OTUs代表序列1 022個(gè)。稀釋曲線結(jié)果顯示,當(dāng)測(cè)序的序列數(shù)達(dá)到20 000條時(shí),曲線趨于平緩,提示數(shù)據(jù)量飽和,測(cè)序深度足以覆蓋物種中的OTUs。見圖1。OTUs數(shù)據(jù)的韋恩圖顯示,5組樣本的“核心OTUs”為224種,Normal組特有OTUs為137種,Pre_BL組特有OTUs 76種,Pro_BL組特有OTUs 11種, Pre_JWJT組特有OTUs 33種, Pro_JWJT組特有OTUs 29種。見圖2。

表1 兩組患者治療前后IBS-SSS評(píng)分比較

圖1 測(cè)序數(shù)據(jù)稀釋曲線

注:Normal為健康對(duì)照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.3 菌群多樣性分析 采用α和β多樣性分析評(píng)價(jià)菌群的整體結(jié)構(gòu)。α多樣性的Chao1指數(shù)評(píng)估表明,健康對(duì)照組的α多樣性均顯著高于其他4組(P<0.05),地衣芽孢桿菌治療后α多樣性有升高的趨勢(shì),而加味交泰丸治療對(duì)α多樣性無明顯影響。β多樣性分析中,PLS-DA顯示健康對(duì)照組的菌群分布與其他4組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但地衣芽孢桿菌及加味交泰丸治療沒有顯著改變菌群的β多樣性。見圖3、圖4。

注:Normal為健康對(duì)照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸組治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸組治療后

注:Normal為健康對(duì)照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.4 菌群相對(duì)豐度 在門水平上,健康對(duì)照組主要由Firmicutes(厚壁菌門)、Actinobacteria(放線菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)組成,而其他4組主要由厚壁菌門、Proteobacteria(變形菌門)、放線菌門組成,且加味交泰丸及地衣芽孢桿菌治療前后主要菌門未發(fā)生顯著變化。見圖5。在屬水平上,加味交泰丸治療顯著增加了優(yōu)勢(shì)菌Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相對(duì)豐度,降低了優(yōu)勢(shì)菌Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia的相對(duì)豐度;地衣芽孢桿菌治療顯著增加了優(yōu)勢(shì)菌Peptoclostridium的相對(duì)豐度,降低了優(yōu)勢(shì)菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相對(duì)豐度。見圖6、圖7。

注:Normal為健康對(duì)照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

注:Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

3.5 LEfSe(LDA Effect Size)分析 在各分類學(xué)水平通過LEfSe分析后進(jìn)行5組之間的比較,選取P<0.05且LDA 評(píng)分>3的物種,按照門、綱、目、科、屬5個(gè)層級(jí)進(jìn)化分支樹繪圖,見圖8。圖中所示,健康對(duì)照組富集的菌群主要?dú)w類于擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria);地衣芽孢桿菌治療前富集的菌群主要?dú)w類于桿菌綱(Bacilli);地衣芽孢桿菌治療后富集的菌群主要?dú)w類于變形菌門(Proteobacteria);加味交泰丸治療前富集的菌群主要?dú)w類于毛螺菌科(Lachnospiraceae);加味交泰丸治療前后富集的菌群主要?dú)w類于梭桿菌門(Fusobacteria)。結(jié)果表明,加味交泰丸及地衣芽孢桿菌治療均顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu),但兩者改變的菌群不同,同時(shí)治療后的菌群也與健康對(duì)照組有所差異。

注:Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后

4 討論

IBS-D是消化內(nèi)科的常見病及多發(fā)病,近年來發(fā)病率逐年上升。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療IBS-D主要以緩解癥狀為目的,但存在不良反應(yīng)多、遠(yuǎn)期療效差等弊端,導(dǎo)致患者在長(zhǎng)期緩解疼痛或不適的治療中獲益較少,治療效果不理想。因此,急需尋找補(bǔ)充或替代藥物[10]。而中醫(yī)藥治療IBS-D具有相對(duì)優(yōu)勢(shì),并取得良好的療效[11-12]。

中醫(yī)學(xué)中并無IBS-D的病名,根據(jù)相關(guān)臨床癥狀及特點(diǎn),可將其歸屬于中醫(yī)“泄瀉”“腹痛”“郁證”范疇,其病因有感受外邪、飲食所傷、情志失調(diào)及臟腑虛弱等,脾胃功能障礙是本病發(fā)生的關(guān)鍵。脾虛濕勝是導(dǎo)致本病發(fā)生的重要因素。外因與濕邪關(guān)系較大,濕邪侵入,損傷脾胃,運(yùn)化失常。內(nèi)因則與脾虛關(guān)系最為密切,脾虛失運(yùn),水谷不化精微,濕濁內(nèi)生,混雜而下,發(fā)為本病。近年來,有學(xué)者認(rèn)為IBS外在表象為肝郁脾虛,其內(nèi)在本質(zhì)實(shí)為心腎不交,以心腎不交論來指導(dǎo)治療IBS,可進(jìn)一步豐富臨床治療的思路和方法[13]。

注:Normal為健康對(duì)照;Pre_BL為地衣芽孢桿菌治療前;Pro_BL為地衣芽孢桿菌治療后;Pre_JWJT為加味交泰丸治療前;Pro_JWJT為加味交泰丸治療后

交泰丸及其加味方是治療心腎不交的經(jīng)典方劑,主治胸中痞悶嘈雜。大便稀則胸中暢快,大便堅(jiān)則痞悶難當(dāng),不思飲食,出現(xiàn)心火偏亢、心腎不交,表現(xiàn)為怔忡、失眠等癥。心火亢盛、腎陽不足可導(dǎo)致心腎不交。欲使心腎相交,則必須既清心瀉火以使心火下降,又當(dāng)扶助腎陽以鼓舞腎水上承。只有水火相濟(jì),才能心腎相交。加味交泰丸作為交泰丸和痛瀉要方的綜合藥方,具有全面綜合的治療效果,能改善患者生活質(zhì)量,降低IBS-D嚴(yán)重程度。方中黃連、肉桂使心腎相交,黃連清心瀉火以制偏亢之心陽,肉桂溫補(bǔ)下元以扶不足之腎陽;心火不熾則心陽自能下降,腎陽得扶則腎水上承自有動(dòng)力。本研究結(jié)果顯示,治療后中藥組IBS癥狀嚴(yán)重程度較西藥組顯著改善,說明加味交泰丸可以通過“心腎相交”明顯緩解IBS-D患者的臨床癥狀。

IBS-D是由多種病理生理機(jī)制引起的,主要包括遺傳和心理因素、胃腸動(dòng)力異常、內(nèi)臟感覺異常、飲食習(xí)慣、腸道菌群等因素[14-15]。目前已有較多研究[16]表明,本病與腸道菌群密切相關(guān),腸道菌群的變化可能導(dǎo)致腸道通透性增加,誘發(fā)內(nèi)臟過敏,激活免疫反應(yīng),進(jìn)而引起胃腸道功能紊亂。近年來,高通量測(cè)序已廣泛應(yīng)用于IBS的腸道菌群研究。研究[17]顯示,IBS患者的腸黏膜和糞便菌群的多樣性均減少。而且隨著病情的發(fā)展,IBS-D變得更加復(fù)雜。在IBS-D患者腸道微生態(tài)失調(diào)的情況下,臨床治療應(yīng)重視對(duì)腸道菌群的調(diào)整,以提高治療效果,促進(jìn)患者康復(fù)[18]。

本研究中,與健康對(duì)照組比較,IBS-D患者腸道中擬桿菌門及放線菌門的豐度顯著降低,而變形菌門的豐度顯著增加,這與之前的報(bào)道結(jié)果一致[19-20]。但在中藥及西藥治療后,α多樣性及主要的菌門豐度無顯著改變,這可能與研究人群的長(zhǎng)病程及實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)間有關(guān)。本研究的研究對(duì)象都是成年人,菌群結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,而且IBS-D的平均病程較長(zhǎng),而實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)間僅為28 d,考慮短期的干預(yù)很難徹底改變腸道菌群的總體結(jié)構(gòu)。但在菌屬的水平上,中藥及西藥治療均在一定程度上改變了菌群的構(gòu)成。

中藥組Eubacterium_eligens_group、Flavonifractor及Lachnospira的相對(duì)豐度顯著增加,Eubacterium_eligens_group及Flavonifractor與IBS-D的相關(guān)性報(bào)道較少。目前研究發(fā)現(xiàn),Eubacterium_eligens_group豐度的增加與壓力應(yīng)激下的心理健康相關(guān)并具有抗炎作用[21],而Flavonifractor的較低豐度與情感障礙相關(guān)[22]。Lachnospira作為一種產(chǎn)生丁酸鹽的梭菌簇XIVa物種,對(duì)IBS-D發(fā)揮保護(hù)性作用。對(duì)于在加味交泰丸治療后相對(duì)豐度顯著減少的Eysipelotrichaceae_UCG-007、Scardovia及Senegalimassilia,其中Eysipelotrichaceae與免疫介導(dǎo)的炎癥性腸病密切相關(guān)[23],尚未報(bào)道Scardovia及Senegalimassilia在炎癥性疾病中的作用。這些結(jié)果表明,加味交泰丸可以通過改變IBS-D患者的腸道菌群發(fā)揮治療作用,并且這種作用可能與抗壓力應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)等相關(guān)。西藥組Peptoclostridium的豐度顯著增加,優(yōu)勢(shì)菌Collinsella、Lactococcus及Streptococcus的相對(duì)豐度降低,其中Collinsella與全身性炎癥相關(guān)[24],而Streptococcus也與感染及炎癥反應(yīng)相關(guān)[25]。地衣芽孢桿菌治療同樣可以改變IBS-D患者的腸道菌群,并且腸道菌群的改變與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

總的來說,加味交泰丸雖然對(duì)IBS-D患者腸道菌群多樣性無顯著影響,但其可以改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成,與西藥地衣芽孢桿菌的作用有所不同。另外,加味交泰丸治療無法逆轉(zhuǎn)IBS-D引起的腸道菌群的失調(diào)。本研究為加味交泰丸在臨床的應(yīng)用提供參考價(jià)值,但關(guān)于加味交泰丸的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。