楊瑞楠,程 楠,董健健,徐陳陳,徐樂文,文佩華,張 培

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所,安徽 合肥 230061)

Wilson病(Wilson’s disease,WD)是由ATP7B基因突變導(dǎo)致銅代謝障礙,進(jìn)而出現(xiàn)肝臟及神經(jīng)和精神等多系統(tǒng)癥狀的遺傳病[1]。安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所自1970年代開始從中醫(yī)證候?qū)W及辨證論治方面對WD進(jìn)行研究,認(rèn)為WD是由銅毒內(nèi)聚、肝膽濕熱內(nèi)蘊所致,創(chuàng)用肝豆湯,通過其清熱解毒、通腑利濕作用治療WD患者,取得顯著的臨床療效[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn),肝豆湯可降低WD患者外周血炎癥因子的表達(dá)水平,調(diào)節(jié)WD患者免疫功能。實驗研究[3-4]發(fā)現(xiàn),肝豆湯可減少WD神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善高銅誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞變性壞死。但肝豆湯治療銅蓄積誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷機制尚未闡明。

研究[5]證明,炎癥反應(yīng)存在于WD神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn),Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(Nod-like receptor family,pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎癥小體在WD神經(jīng)細(xì)胞損傷的病理過程中起重要作用,抑制NLRP3炎癥小體激活可顯著減少WD模型TX小鼠神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷,并明顯改善其行為學(xué)異常?？梢?銅蓄積誘發(fā)的炎癥損傷在WD患者腦損傷過程中起重要作用。本實驗以WD動物模型和細(xì)胞模型為研究對象,觀察肝豆湯調(diào)控NLRP3炎癥小體對高銅誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷的干預(yù)作用,為腦型WD的診治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動物 小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2細(xì)胞)、海馬細(xì)胞(HT-22細(xì)胞)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。從美國Jackson動物實驗中心引進(jìn)TX種鼠,在中國科學(xué)院合肥物質(zhì)研究院SPF級實驗動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)及傳代繁殖。以50只DL小鼠為對照組,將100只TX小鼠隨機分為模型組和肝豆湯組,每只小鼠均為3月齡,體質(zhì)量(20±5)g。為保證種鼠及其子代具備WD模型的特性,模型組入組動物均已進(jìn)行基因檢測。TX小鼠使用許可證號:SYXK(皖)2018-005。SPF級雄性SD大鼠30只,3月齡,體質(zhì)量(210±25)g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2019-0003],飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所實驗動物中心。本實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號:AHUCM-rats-2020022)和中國科學(xué)院合肥物質(zhì)研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)(編號:IACUC19001)。

1.2 藥物及試劑 肝豆湯(金錢草、澤瀉各24 g,大黃、姜黃、黃連各20 g,三七3 g)飲片購自同仁堂藥店,煎煮2次,將2次藥汁合并,文火煎煮濃縮至150 mL(含生藥0.74 g/mL),冷卻后保存于4 ℃冰箱。按照課題組前期構(gòu)建的高效液相色譜指紋圖譜分析方法[19],控制肝豆湯的質(zhì)量。DMEM培養(yǎng)基(CA0002-500ML):中國Sparkjade公司;MEM細(xì)胞培養(yǎng)基(10100147)、胎牛血清(11090081):美國Gibco公司;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)(ab138483)、NLRP3(ab270449)、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)(ab175449)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)(ab254360):英國Abcam。

1.3 儀器 CK2型倒置相差顯微鏡:日本Olympus公司;Fine Do X6型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng):上海天能科技有限公司;Power Pac Basic 型電泳儀:美國伯樂公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將HT-22及BV-2細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng),細(xì)胞生長至密度約為80%時進(jìn)行傳代。

2.2 含藥血清制備及保存 將30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,每日分2次予以肝豆湯8 mL/kg(相當(dāng)于60 kg成人臨床劑量的6.3倍)灌胃,灌胃4周后,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg深度麻醉,腹主動脈無菌采血,將血液靜置于室溫2 h后,3 000 r/min離心15 min,取上清。再6 700 r/min、4 ℃離心30 min,取上清,過濾,放置56 ℃水浴中滅活30 min,-20 ℃保存。

2.3 倒置相差顯微鏡下觀察BV-2細(xì)胞活化水平 取對數(shù)生長期的BV-2細(xì)胞,消化收集,細(xì)胞懸液接種于96孔板,每組設(shè)6個復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞生長至90%時,各組加入MEM或CuCl2培養(yǎng)液100 μL,作用時間結(jié)束后,于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),并對活化細(xì)胞計數(shù)。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,消化收集,細(xì)胞懸液接種于96孔板,每組設(shè)6個復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞生長至90%時,各組加入所需培養(yǎng)液100 μL,作用時間結(jié)束后,避光下每孔加入CCK8溶液10 μL,置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1.5 h后測試吸光度。

2.5 細(xì)胞條件培養(yǎng) 傳代BV-2細(xì)胞,設(shè)正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組,當(dāng)細(xì)胞生長至90%時,棄去原培養(yǎng)液,條件培養(yǎng)正常組加入MEM完全培養(yǎng)液;條件培養(yǎng)模型組加入含10 μmol/L CuCl2的MEM;各肝豆湯血清組先加入不同濃度含肝豆湯血清培養(yǎng)液作用1 h,后加入含10 μmol/L CuCl2的MEM;12 h后,各組棄去原培養(yǎng)液,加入DMEM完全培養(yǎng)液,作用24 h后,收集上清,將其分別加入HT-22細(xì)胞正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組中,24 h后收集上清及細(xì)胞。

2.6 細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率及氧化應(yīng)激水平檢測 收集條件培養(yǎng)的各實驗組培養(yǎng)液100 μL,依據(jù)LDH檢測試劑盒說明書操作,檢測各組細(xì)胞LDH漏出率;收集條件培養(yǎng)的各實驗組細(xì)胞,按照索萊寶公司活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒說明書裝載熒光探針DCFH-DA,檢測各組細(xì)胞DCF熒光強度;收集條件培養(yǎng)的各實驗組細(xì)胞,依據(jù)索萊寶公司丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)活性檢測試劑盒說明書操作,在酶標(biāo)儀各指標(biāo)所需波長處檢測吸光度值,根據(jù)細(xì)胞檢測公式計算MDA、SOD、H2O2、GSH、GSSG水平。

2.7 BV-2細(xì)胞的分組及處理 體外傳代并培養(yǎng)BV-2細(xì)胞,分為正常組、模型組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組,各肝豆湯血清組先加入不同濃度含肝豆湯血清的培養(yǎng)液作用1 h,后同模型組一起加入含 10 μmol/L CuC12的MEM作用12 h,干預(yù)結(jié)束后收集各組上清及細(xì)胞。

2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測各組細(xì)胞炎癥因子水平 收集各組BV-2細(xì)胞上清,按試劑盒說照書檢測各組細(xì)胞IL-1β、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)水平。

2.9 動物分組及給藥方法 分為正常組(DL小鼠50只)、模型組(TX小鼠50只)、肝豆湯組(TX小鼠50只)。對各組小鼠灌胃28 d,正常組與模型組采用生理鹽水(20 mL/kg)灌胃,肝豆湯組采用肝豆湯(20 mL/kg)灌胃,每日2次,末次給藥后,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后處死小鼠,于冰上取小鼠海馬組織進(jìn)行腦組織損傷水平及NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測。

2.10 行為學(xué)檢測

2.10.1 Barnes迷宮 設(shè)置迷宮所需圓形平臺,直徑為122 cm,高99 cm,平臺周邊有20個均勻分布的直徑為10 cm的孔,各孔外觀均勻,平臺中央設(shè)置1個黑色可移動的逃生盒,只有1個孔連接到逃生盒,實驗前先將小鼠放在逃生盒熟悉環(huán)境,30 s后將小鼠拿到平臺,計時3 min,觀察小鼠能否找到逃生盒及其找到目標(biāo)洞口的潛伏期。

2.10.2 曠場實驗 試驗所需的裝置為方形箱子,規(guī)格為50 cm×50 cm×40 cm,其底部分為邊緣區(qū)(1區(qū))、中間區(qū)(2區(qū))、中心區(qū)(3區(qū))。實驗所需全部小鼠被放入實驗區(qū)域同一位置,觀察其自由活動,時間為5 min。

2.10.3 高架十字實驗 設(shè)置實驗所需兩條相對開放臂和兩條相對閉合臂及中央?yún)^(qū),實驗前將小鼠放置于裝置內(nèi)適應(yīng)30 min,正式測試時,從中央?yún)^(qū)放進(jìn)動物(面對閉合臂),觀察其進(jìn)入2種臂的次數(shù)及所停留的時間。進(jìn)行以上實驗時,每測試完一只小鼠,清除其糞便、尿液,并用75%乙醇無菌操作。以上實驗的檢測與分析使用Ethovision XT系統(tǒng)進(jìn)行。

2.11 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法檢測腦組織形態(tài) 將腦組織進(jìn)行固定等前期處理后切片,厚度為4 μm,山羊血清封閉,蘇木精和伊紅染液染色,于顯微鏡下觀察腦損傷情況。

2.12 Western blot檢測NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取各組海馬組織,加入PMSF和RIPA裂解液及磁珠研磨;取各組BV-2細(xì)胞,加入PMSF和RIPA裂解液,冰上裂解30 min。隨后4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min,取上清液,加入蛋白上樣緩沖液后,立即水浴8 min,隨后保存于-20 ℃冰箱。電泳后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。常溫封閉4 h,一抗4 ℃過夜孵育,二抗室溫?fù)u床孵育1.5 h后曝光,后用Image J軟件(1.53版本,美國國立衛(wèi)生研究院)分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 CuCl2誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化 與正常組比較,加入CuCl2后,BV-2細(xì)胞表面突起逐漸收縮,并呈現(xiàn)出胞體增大、突起變短、細(xì)胞形態(tài)呈圓形的活化狀態(tài)。2～200 μmol/L CuCl2激活的BV-2細(xì)胞活化率顯著增加(P<0.05)。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;與正常組(0 μmol/L CuCl2組)比較,*P<0.05

3.2 CuCl2誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化間接引起HT-22細(xì)胞損傷 對BV-2細(xì)胞和HT-22細(xì)胞單獨予以不同濃度CuCl2處理。CCK8檢測結(jié)果顯示,與正常組比較,CuCl2在1～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)未引起顯著的BV-2細(xì)胞及HT-22細(xì)胞死亡(P>0.05)。見圖2。BV-2細(xì)胞與HT-22細(xì)胞條件培養(yǎng)下,10 μmol/L CuCl2可顯著降低HT-22細(xì)胞存活率(P<0.05)。見圖3。

注:與正常組比較,*P<0.05

注:A.正常組;B.模型組;與正常組比較,*P<0.05

3.3 含肝豆湯血清減輕CuCl2誘導(dǎo)條件培養(yǎng)對HT-22細(xì)胞的損傷 將不同濃度含肝豆湯血清單獨作用于HT-22細(xì)胞及BV-2細(xì)胞,分為正常組、5%肝豆湯血清組、10%肝豆湯血清組、15%肝豆湯血清組、20%肝豆湯血清組。CCK8檢測結(jié)果顯示,與正常組比較,各組細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05)。見圖4。將不同濃度含肝豆湯血清作用于條件培養(yǎng)細(xì)胞,10%和15%含肝豆湯血清可顯著提高模型組條件培養(yǎng)細(xì)胞活力(P<0.05)。見圖5。

注:A.正常組;B.5%肝豆湯血清組;C.10%肝豆湯血清組;D.15%肝豆湯血清組;E.20%肝豆湯血清組

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.4 含肝豆湯血清可抑制CuCl2誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞的活化 與正常組比較,經(jīng)CuCl2損傷后,細(xì)胞折光性顯著下降,表面突起逐漸皺縮,并呈現(xiàn)出胞體增大、突起變短、呈圓形的活化狀態(tài),細(xì)胞貼壁不良,細(xì)胞密度降低;與模型組比較,肝豆湯組細(xì)胞表面突起伸出,貼壁狀態(tài)得到改善,折光性較模型組顯著增強。見圖6。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組

3.5 含肝豆湯血清可降低CuCl2條件培養(yǎng)的HT-22細(xì)胞LDH漏出率 模型組條件培養(yǎng)細(xì)胞上清液中LDH活力較正常組顯著增加(P<0.05);與模型組比較,肝豆湯組細(xì)胞上清液中LDH活力均顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.6 含肝豆湯血清可降低CuCl2條件培養(yǎng)的HT-22細(xì)胞氧化應(yīng)激水平 與正常組比較,模型組ROS活性,MDA、H2O2水平顯著升高(P<0.05),SOD活力、GSH/GSSG顯著降低(P<0.05);與模型組比較,肝豆湯組ROS活性,MDA、H2O2水平顯著降低(P<0.05),SOD活力、GSH/GSSG顯著升高(P<0.05)。見圖8。

注:圖①為ROS峰線圖;A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.7 含肝豆湯血清可抑制CuCl2誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子分泌 與正常組比較,模型組BV-2細(xì)胞中IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,含肝豆湯血清可劑量依賴性降低CuCl2誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中IL-1β、IL-18、TNF-α、iNOS水平(P<0.05)。見圖9。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.8 含肝豆湯血清可下調(diào)CuCl2誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與正常組比較,模型組Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,含肝豆湯血清可降低Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖10。

注:A.正常組;B.模型組;C.5%肝豆湯血清組;D.10%肝豆湯血清組;E.15%肝豆湯血清組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.9 肝豆湯可改善TX小鼠行為學(xué)異常 從各組小鼠中隨機選取38只進(jìn)行行為學(xué)試驗。Barnes迷宮中,肝豆湯可顯著縮短TX小鼠進(jìn)入目標(biāo)洞潛伏期(P<0.05)。高架十字迷宮中,肝豆湯治療組小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)百分比、開臂持續(xù)時間顯著升高(P<0.05)。曠場實驗中,肝豆湯可顯著增加TX小鼠運動中央時間、總路程、直立次數(shù)(P<0.05),降低TX小鼠邊上時間、靜止時間(P<0.05)。見圖11。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.10 肝豆湯可減輕TX小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞損傷 HE染色結(jié)果顯示,正常組海馬組織細(xì)胞形態(tài)正常,周圍神經(jīng)纖維緊密,未見明顯異常。模型組海馬組織細(xì)胞排列稀疏,多見錐體細(xì)胞壞死,核固縮或溶解消失(黑色箭頭)。肝豆湯組海馬組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊,神經(jīng)細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)豐富,淺藍(lán)色或藍(lán)色均勻,核仁清楚,層次及細(xì)胞線清晰。見圖12。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;箭頭示核固縮或溶解消失

3.11 肝豆湯抑制TX小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體活化 口服中藥肝豆湯能同時阻斷TX小鼠海馬組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC蛋白的表達(dá)(P<0.05)。見圖13。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆湯組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

人體神經(jīng)系統(tǒng)功能維持正常需要銅的參與。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)時,高濃度銅離子可誘導(dǎo)以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為特征的炎癥反應(yīng)并引起神經(jīng)損傷[7-8]。有研究[5]發(fā)現(xiàn),多種神經(jīng)遺傳變性疾病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機制之一為炎癥反應(yīng),其特征為小膠質(zhì)細(xì)胞活化,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù),而當(dāng)炎癥反應(yīng)長期慢性存在時,則會加重神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。銅離子在腦中堆積引起的膠質(zhì)細(xì)胞活化及神經(jīng)細(xì)胞變性壞死是WD神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要機制,并有可能是治療的重要靶點[9]。本實驗發(fā)現(xiàn),模型組小膠質(zhì)細(xì)胞活化,且促使條件培養(yǎng)下的HT-22細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高及細(xì)胞損傷,炎癥因子表達(dá)水平較正常組顯著增加。結(jié)果表明,WD細(xì)胞模型中銅離子沉積能誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞活化,促進(jìn)炎癥因子分泌,從而加劇神經(jīng)細(xì)胞損傷。此外有研究[10]發(fā)現(xiàn),TX小鼠腦內(nèi)銅沉積區(qū)域存在小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子分泌,并伴有神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死。以上提示炎癥是WD神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要機制。

作為一種多蛋白復(fù)合物,NLRP3炎癥小體由NLRP3、Caspase-1前體和ASC構(gòu)成,在腦內(nèi)主要在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[11]。近年來研究[12-13]證明,NLRP3炎癥小體活化與多種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳、變性疾病相關(guān)。NLRP3炎癥小體與WD神經(jīng)細(xì)胞損傷緊密相關(guān)。Dong等[6]研究發(fā)現(xiàn),在WD小鼠模型中,NLRP3炎癥小體對炎癥因子的釋放有促進(jìn)作用,出現(xiàn)腦組織病理性損傷,而沉默NLRP3或藥物抑制NLRP3炎癥小體激活可改善銅堆積導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷,從而防止神經(jīng)退行性變。本實驗發(fā)現(xiàn),與正常組比較,TX小鼠海馬組織NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β、ASC表達(dá)水平升高。亦有多項研究[14-17]發(fā)現(xiàn),激活的NLRP3炎癥小體釋放炎癥因子,造成細(xì)胞損傷。

WD的中醫(yī)辨證復(fù)雜多變,但是驅(qū)“銅毒”仍然是主要的治療目標(biāo)[18],肝豆湯各藥物配合,共同發(fā)揮瀉火解毒、清瀉濕熱、瀉下攻積、活血祛瘀的作用。課題組前期建立了肝豆湯的高效液相色譜指紋圖譜,從而良好控制了肝豆湯的質(zhì)量,并發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿是其主要成分之一[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn),鹽酸小檗堿可能通過阻斷三叉神經(jīng)痛大鼠的NLRP3炎癥小體通路,降低其神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng),從而減輕神經(jīng)節(jié)間的痛覺傳遞。本實驗發(fā)現(xiàn),肝豆湯可顯著抑制WD細(xì)胞模型BV-2細(xì)胞的活化,減少BV-2細(xì)胞炎癥因子的分泌,降低氧化應(yīng)激水平,減輕神經(jīng)細(xì)胞病理性損傷,顯著提高條件培養(yǎng)HT-22細(xì)胞的存活率。為了進(jìn)一步研究肝豆湯對NLRP3炎癥小體的調(diào)控作用,給予TX小鼠口服肝豆湯治療,并將含肝豆湯血清作用于細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝豆湯可顯著降低TX小鼠海馬組織及體外BV-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β、ASC的表達(dá)水平;肝豆湯可減輕TX小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞壞死,改善TX小鼠認(rèn)知及運動功能損傷。以上結(jié)果表明,肝豆湯可抑制NLRP3炎癥小體活化,減輕TX小鼠腦內(nèi)銅沉積引起的病理損傷,改善TX小鼠行為學(xué)異常。

綜上所述,NLRP3炎癥小體激活是WD病理進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié),肝豆湯可通過抑制NLRP3炎癥小體激活,顯著減少神經(jīng)細(xì)胞炎癥損傷,改善WD小鼠的認(rèn)知及行動功能障礙,進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。因此,抑制NLRP3炎癥小體激活可能是肝豆湯治療WD的機制之一。然而,本實驗仍有局限性,NLRP3炎癥小體的激活和調(diào)控方法以及肝豆湯在其中發(fā)揮作用的機制仍需研究。因此,今后應(yīng)進(jìn)一步對NLRP3炎癥小體上游及下游的信號通路進(jìn)行深入研究,以便為治療WD提供新的思路。