陳 程，東泳杉，李偉澤，2，趙 寧，馬 莉

（1.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.江蘇微納醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 揚中 212218）

白及為傳統(tǒng)外傷用藥，具有收斂止血、生肌消腫之功效[1]。白及多糖（BSP）是從中藥白及中提取分離得到水溶性高分子多糖，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗纖維化、止血、組織修復等藥理活性[2，3]。近幾年研究表明，BSP 具有功能緩釋、局部滯留、自身降解、生物安全性高、無毒無刺激等特點，它已作為新型生物醫(yī)藥高分子載體材料被廣泛應用[4-6]。對于創(chuàng)傷愈合而言，藥物應盡量少進入全身系統(tǒng)，而附著于表皮以達到表皮緩釋效果，微球可原位固定，避免粒子擴散、防止突釋、延長病灶部位滯留，目前，該體系在創(chuàng)傷愈合治療方面顯示巨大的潛力。研究表明，黃連素（BBR）局部外用可顯著促進糖尿病潰瘍傷口愈合，主要機制[7-11]通過恢復TrxR1/JNK 信號通路，減少氧化損傷與細胞凋亡，從而恢復糖尿病潰瘍傷口的氧化還原狀態(tài)，促進表皮細胞增殖，加快糖尿病潰瘍傷口的愈合。據(jù)此，我們以BSP 微球包埋BBR 構建用于糖尿病潰瘍的多孔生物黏附性微球（BBR-BSPMs），并對其進行質量評價，以為糖尿病潰瘍治療提供一種新制劑。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

白及多糖（自制）；D（+）-無水葡萄糖標準品（批號：B21882-100mg 上海源葉生物科技公司）；黃連素（批號：SB1604 北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

QUINTIX124-TCN 型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；ZNCL-BS 型智能磁力攪拌器（河南愛博特特科技發(fā)展有限公司）；KH7200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Cary60 型紫外可見分光光度計（美國Agilent 公司）；CKX31SF 型倒置顯微鏡（Olympus）；ZEN3600 型Malvern 納米粒度和ZETA 電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；DZF6050 型真空干燥箱（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；T27 型布魯克紅外光譜儀（德國bruker 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BSP-Ms 的制備 在前期查閱文獻的基礎上，以微球得率和粒徑為評價指標，分別考察BBR投料量、BSP 濃度、交聯(lián)溫度、交聯(lián)體積分數(shù)、交聯(lián)時間和攪拌速度等因素對實驗結果的影響，初步得到BSP-Ms 的制備工藝參數(shù)。于50℃水浴條件下精密稱定BSP 配得0.05g·mL-1水溶液作為水相，液體石蠟作為油相（水油相比為1∶5），于50℃、960r·min-1條件下將10%乳化劑（司盤-85∶吐溫-80=2∶1，v/v）均勻分散于油相中；將BSP 水溶液用注射器緩慢滴加到油相中乳化成乳滴（130min），于冰箱4℃條件下冷藏30min，加11%交聯(lián)劑（乙二胺∶環(huán)氧氯丙烷=1∶3），于40℃、960r·min-1條件下充分攪拌交聯(lián)固化成球（70min）；將得到的微球乳液冷卻、靜置，用石油醚洗滌3 次除去油相，異丙醇、丙酮交替洗滌3～5次，60℃真空干燥箱干燥后，得BSP-Ms。

1.2.2 BBR-BSP-Ms 的制備 按照12% BBR 投料量于水相中，參照“1.2.1”項下方法制備BBR-BSPMs。

1.2.3 BBR-BSP-Ms 外觀性狀、分散性觀測 取少量樣品均勻分散，肉眼觀察微球的顆粒性。再取少量樣品于表面皿中，用蒸餾水分散，觀察其是否均勻分散、有無粘連性。

1.2.4 BBR-BSP-Ms 形態(tài)和粒徑大小、分布及電位評價 采用光學顯微鏡觀察其均勻性；采用掃描電鏡（SEM）觀察其外觀形態(tài)和結構特征；采用倒置顯微鏡觀察并標記區(qū)域內的微球粒徑；采用Malvern激光粒度儀測定Zeta 電位。

1.2.5 BBR-BSP-Ms 紅外光譜分析 稱取2mg 干燥BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 和物理混合物，分別與KBr 粉末于紅外燈下研細，混合均勻，進行壓片處理，掃描得圖譜。

1.2.6 BBR 含量測定 配制系列濃度的BBR 對照品溶液，于350nm 處測吸光度，以吸光度A 為縱坐標，濃度C 為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 BBR-BSP-Ms 載藥量和包封率的測定 將干燥的BBR-BSP-Ms 置研缽中研細，精密稱定10mg置于25mL 容量瓶中，加適量pH 值為7.4 的磷酸鹽緩沖液超聲15min 并定容至刻度，作為供試品溶液。以空白微球作參比，于350nm 處測定吸光度，通過BBR 標準曲線回歸方程計算濃度，再按下式計算載藥量和包封率。

式中 m:微球中藥物量，mg；M:微球質量，mg；M0：藥物投入量，mg。

1.2.8 BBR-BSP-Ms 體外釋藥性能研究[12]分別精密稱取10mg BBR、BBR-殼聚糖（Cs）水凝膠（對照組）和BBR-BSP-Ms 置于透析袋中，加入5mL pH值7.4 的磷酸緩沖液，用封口夾扎緊透析袋，懸浮于裝有100mL 相同釋放介質的燒杯中，37℃、100r·min-1磁力攪拌器中水浴攪拌，于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48h 定時取樣5mL，每次取樣后及時補足5mL 新鮮的釋放介質。于350nm 波長處測定釋放液的吸光度，計算BBR 濃度，按下列公式計算累積釋放率。

微球第n 小時的藥物累積釋放率%=（Cn×100+∑Cn-1×5）/樣品量×100%

2 結果與討論

2.1 BBR-BSP-Ms 外觀性狀、分散性

BSP-Ms 呈淺白色粉末狀，顆粒性較好；BBRBSP-Ms 呈淺黃色粉末狀，顆粒性較好。取空白白及多糖微球和共載黃芪甲苷-黃連素白及微球適量于表面皿中，加入純化水分散，微球可均勻分散，無粘連性。

2.2 BBR-BSP-Ms 形態(tài)和粒徑大小、分布和電位圖

由圖1、2 可見，在光學顯微鏡下，BSP-Ms 與BBR-BSP-Ms 均可觀察到大量微球且外形圓整，互不粘連。

圖1 BSP-Ms 普通光學顯微圖（×100）Fig.1 General optical micrograph of BSP-Ms（×100）

圖2 BBR-BSP-Ms 普通光學顯微圖（×100）Fig.2 General optical micrograph of BBR-BSP-Ms（×100）

由圖3、4 可見，在倒置顯微鏡下，BSP-Ms 粒徑大多處于60～70μm 之間、BBR-BSP-Ms 粒徑均在20～30μm 之間，粒徑分布均勻，形態(tài)圓整。

圖3 BSP-Ms 倒置顯微鏡圖Fig.3 Inverted microscope diagram of BSP-Ms

圖4 BBR-BSP-Ms 倒置顯微鏡圖Fig.4 Inverted microscope diagram of BBR-BSP-Ms

由圖5 可見，采用SEM 觀察所制備的BBRBSP-Ms，表面粗糙不平有褶皺，整體呈球狀，圓整度較好，內部孔洞結構明顯。

圖5 BBR-BSP-Ms 掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope image of BBR-BSP-Ms

由圖6、7 可見，BSP-Ms 與BBR-BSP-Ms 電位經測定，均在-27.7mV 左右，表明穩(wěn)定性良好。

圖6 BSP-Ms 電位圖Fig.6 Potential diagram of BSP-Ms

圖7 BBR-BSP-Ms 電位圖Fig.7 Potential diagram of BBR-BSP-Ms

2.3 BBR-BSP-Ms 布魯克紅外光譜分析

圖8 為BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 的紅外光譜圖。

圖8 BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms 紅外光譜Fig.8 Infrared spectrum of BBR、BSP、BSP-Ms、BBR-BSP-Ms

由圖8 可見，BBR 粉末樣品的光譜圖中3344.06cm-1處的吸收峰為C-O 的倍頻及芳環(huán)C-H振動峰，1505.66cm-1處的吸收峰為BBR 的芳環(huán)骨架振動峰，1272.71～1036.29cm-1為芳香脂肪醚的振動峰。

BSP 存在明顯的特征吸收峰，3387.35cm-1處的吸收峰為O-H 的伸縮振動，2928.93cm-1處的吸收峰為-CH2-或-CH3中C-H 的伸縮振動，1637.55cm-1處的吸收峰為C-O 的不對稱伸縮振動；1042cm-1和920cm-1處的吸收峰表示白及多糖的吡喃糖基化。

在BSP-Ms 的紅外光譜中同時存在3267.33cm-1（O-H 的伸縮振動峰）、2924.50cm-1（C-H 的伸縮振動峰）、1637.16cm-1（C-O 的不對稱伸縮振動峰）、1025.10cm-1和931.86cm-1等特征吸收峰，與BSP 二者圖譜基本一致，表明BSP-Ms 中確實有BSP 的存在。

在BBR-BSP-Ms 紅外光譜圖中，3267.27cm-1處吸收峰與BSP-Ms 中3267.33cm-1處基本重合，2924.53cm-1、1025.97cm-1處的吸收峰與BSP 樣品中2928.93cm-1、1025.10cm-1處吸收峰基本一致，證實BSP 的 存在，1510.22cm-1處的吸收峰與BBR 中1505.66cm-1處吸收峰基本重合，BBR 含量主要由1510cm-1附近吸收峰的峰形和峰強決定，此處的吸收峰為BBR 的芳環(huán)骨架振動峰，峰越強，峰形越細長，則混合物中BBR 的含量越高。

2.4 BBR-BSP-Ms 包封率和載藥量

以吸光度A 對BBR 濃度C 進行線性回歸，得標準曲線方程Y=0.056X-0.0231（R2=0.9995），結果表明，BBR 在4～14μg·mL-1濃度范圍內與其吸光度有良好的線性關系。經測定計算得出，該方法回收率為96.99～101.22%，精密度、穩(wěn)定性和重復性實驗RSD 均小于1.69%。分別對3 批BBR-BSP-Ms（每批5g）進行測定，包封率為（86.92±0.03）%，載藥量為（19.78±0.08）%，BBR-BSP-Ms 質量可控，載藥性能較好，制備工藝可行。

2.5 BBR-BSP-Ms 體外釋放實驗

由圖9 可見，在pH 值為7.4 的磷酸緩沖液條件下，BBR 原料藥0.5h 內釋藥達45.76%，存在明顯突釋行為，4h 累積釋放的藥物達93.37%，后釋放曲線趨于平緩；對比組BBR-Cs 水凝膠有一定緩釋作用，12h 內累計釋藥量近90%；BBR 從BSP-Ms 中隨時間緩慢釋放，12h 時，BBR 在pH 值為7.4 的磷酸緩沖液中的累積釋藥量為12.30%，48h 內的累積釋放率達82.12%，實驗數(shù)據(jù)表明，藥物包載于BSP-Ms后，具有明顯的緩釋作用效果，有利于創(chuàng)傷愈合、防止突釋、延長病灶部位滯留發(fā)揮長效作用。

圖9 體外釋藥曲線圖Fig.9 Curve of drug release in vitro

3 結論

本文以BSP 微球包埋BBR 構建多孔生物粘附性微球，可發(fā)揮物理粘附、釋藥控制雙重作用。采用乳化-交聯(lián)法制備得到BBR-BSP-Ms，制備工藝穩(wěn)定可行，微球分散性、懸浮性良好，生物相容性良好，載藥量大，緩釋效果明顯，達到預期性能目標。