郭雨欣 孫彬佳 彭榮梅 洪晶

1北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科 眼部神經(jīng)損傷的重建保護(hù)與康復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100191;2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院,溫州325027

角膜植片失功是導(dǎo)致角膜移植手術(shù)失敗的直接原因。既往認(rèn)為,植片失功的主要病因包括角膜移植手術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)和植片內(nèi)皮細(xì)胞的自然衰竭。隨著角膜移植手術(shù)技術(shù)及圍手術(shù)期用藥的不斷改良和規(guī)范,植片失功的發(fā)生率已明顯下降。然而,近年來有關(guān)角膜移植術(shù)后病毒感染引起植片失功的報(bào)道逐漸增多[1-2],國內(nèi)尚無相關(guān)發(fā)病率統(tǒng)計(jì)。國外文獻(xiàn)報(bào)道,取角膜移植術(shù)后失功的植片進(jìn)行檢測,3.9%～14.3%呈病毒陽性[3-4],可見病毒感染已成為角膜移植手術(shù)失敗的重要原因。角膜移植術(shù)后病毒感染多為術(shù)后數(shù)日至數(shù)年出現(xiàn)的角膜內(nèi)皮炎,其發(fā)病可能與既往隱匿感染漏診、局部組織內(nèi)潛伏病毒激活和角膜植片病毒傳播有關(guān)[1-2,5]。裂隙燈顯微鏡下的典型表現(xiàn)為角膜局限或彌漫水腫,并且水腫區(qū)的角膜內(nèi)皮會出現(xiàn)散在或斑塊狀的污穢色素羊脂狀角膜后沉著物(keratic precipitates,KP);部分合并小梁網(wǎng)炎者可出現(xiàn)中度眼壓升高[6]。角膜移植術(shù)后患者常規(guī)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑導(dǎo)致病毒感染的臨床表現(xiàn)往往不典型,臨床診斷時(shí)常依賴于房水或角膜組織的病毒PCR檢測。然而,對于病程較長的病例單純應(yīng)用PCR檢測能否有效診斷病毒感染尚不明確。本研究擬探討角膜移植術(shù)后植片失功患者行再次角膜移植手術(shù)時(shí)病毒學(xué)檢測結(jié)果以及多種病毒檢測手段的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用病例對照研究,連續(xù)納入2018年3—12月就診于北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科、臨床診斷為角膜移植術(shù)后植片失功且具有角膜移植手術(shù)指征的患者14例作為植片失功組;另外連續(xù)納入同一中心同時(shí)期內(nèi)臨床診斷為大泡性角膜病變(bullous keratopathy,BK)且具有角膜移植手術(shù)指征的患者15例作為BK組。所有患者入組前根據(jù)自述及既往病歷記錄明確末次角膜移植或內(nèi)眼手術(shù)的時(shí)間、次數(shù)及具體術(shù)式,經(jīng)過最佳矯正視力、iCare回彈式眼壓計(jì)、裂隙燈顯微鏡、眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)、活體激光掃描共聚焦顯微鏡(invivoconfocal microscopy,IVCM)檢查明確臨床診斷及手術(shù)指征,除外前房及角膜內(nèi)皮有明顯炎癥未控制的情況。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)角膜移植術(shù)后植片失功 角膜移植術(shù)后出現(xiàn)的角膜植片水腫,可伴或不伴KP,AS-OCT檢查顯示角膜均勻水腫、中央厚度>650 μm,IVCM檢查顯示角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度<500/mm2或測不出。應(yīng)用試驗(yàn)性抗病毒、抗排斥治療后未見好轉(zhuǎn)。(2)BK 內(nèi)眼手術(shù)中明確存在角膜內(nèi)皮損傷病史或術(shù)后3個月以上出現(xiàn)的角膜水腫,AS-OCT檢查顯示角膜均勻水腫、厚度>600 μm,IVCM檢查顯示角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度<500/mm2或測不出。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有其他非病毒性角膜或眼內(nèi)感染史;(2)硅油填充眼;(3)患有免疫缺陷性疾病者;(4)BK組中存在既往眼部病毒感染病史者。2個組患者均為單眼發(fā)病,組間性別分布及發(fā)病時(shí)間(患者主訴或出現(xiàn)角膜植片水腫/混濁體征至本次角膜移植手術(shù)的時(shí)間)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);植片失功組患者年齡明顯低于BK組,本次發(fā)病距末次角膜移植時(shí)間明顯短于BK組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》,研究方案經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號:2017299-02),所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 2個組患者基線特征比較Table 1 Comparison of demographics between two groups組別例數(shù)/眼數(shù)年齡(x±s,歲)a性別構(gòu)成比(男/女,n)b發(fā)病時(shí)間(x±s,個月)a本次發(fā)病距末次角膜移植時(shí)間(x±s,個月)a植片失功組14/1442.7±28.17/715.0±24.616.3±17.7BK組15/1562.9±17.09/612.3±11.662.0±58.1t值 -2.326-0.475-2.908P值 0.0300.7150.6390.010 注:(a:獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);b:Fisher精確檢驗(yàn)) BK:大泡性角膜病變;-:無數(shù)據(jù) Note:(a:Independent samples t-test;b:Fisher exact test) BK:bullous keratopathy;-:no data

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 角膜移植手術(shù)當(dāng)日采集患者靜脈血清標(biāo)本。角膜移植前通過前房穿刺收集至少0.2 ml房水標(biāo)本,在植床制備過程中獲取患者全層角膜或內(nèi)皮/后彈力層組織。所有標(biāo)本均置于無RNA/DNA酶的離心管[愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司],-80 ℃保存。

1.2.2手術(shù)方法 所有手術(shù)均由同一醫(yī)師完成。(1)角膜內(nèi)皮移植術(shù)應(yīng)用于中央角膜厚度<1 000 μm且無明顯基質(zhì)混濁的患者。術(shù)前30 min術(shù)眼點(diǎn)用2%毛果蕓香堿3次縮瞳,成年患者采用球后麻醉,兒童采用全身麻醉。植床、植片直徑均為8.0 mm。于上方角膜緣外1.0 mm處制作3.0 mm隧道切口及2～3個1.0 mm側(cè)切口,前房內(nèi)注入黏彈劑后,應(yīng)用反向晶狀體勾剝除標(biāo)記植床范圍內(nèi)后彈力層,手動注吸吸除前房內(nèi)黏彈劑。應(yīng)用人工前房及自動微型角膜刀完成厚度為100～120 μm的植片制作,10-0尼龍線牽引輔助植入植片。通過角膜表面擠壓輔助展開、居中內(nèi)皮植片后,前房注入空氣泡支撐、固定植片。(2)穿透角膜移植術(shù)應(yīng)用于中央角膜厚度≥1 000 μm的患者。術(shù)前30 min術(shù)眼點(diǎn)用2%毛果蕓香堿3次縮瞳,靜脈輸注20%甘露醇250 ml,采用全身麻醉。植床直徑為7.5～8.0 mm,應(yīng)用角膜環(huán)鉆鉆取角膜深度1/2～3/4,行前房穿刺,前房內(nèi)注入少量黏彈劑,用角膜剪完成植床制作,沖洗眼內(nèi)黏彈劑。植片直徑較植床大0.5 mm,采用10-0尼龍線間斷縫合16針。

1.2.3病毒檢測 檢測病毒種類包括單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)和巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)。(1)實(shí)時(shí)PCR檢測房水、角膜標(biāo)本中病毒DNA 應(yīng)用試劑盒QIAamp DNA Microkit (50)(德國Qiagen公司)提取房水及角膜組織核酸。采用Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行PCR檢測。HSV-1/2、VZV和CMV的引物及探針由標(biāo)準(zhǔn)核酸測定試劑盒(上海之江生物科技股份有限公司)提供。擴(kuò)增條件:37 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性2 min;93 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測在60 ℃,反應(yīng)體系為40 μl。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清及房水中病毒抗體含量 由實(shí)驗(yàn)室另一不知曉PCR檢測結(jié)果的技術(shù)員進(jìn)行抗體檢測。應(yīng)用ELISA試劑盒分別檢測房水及血清中HSV-1/2、VZV、CMV的特異性IgG抗體水平(德國維潤賽潤研發(fā)有限公司)以及總IgG抗體水平(美國BD公司),并計(jì)算Goldmann-Witmer系數(shù)(Goldmann-Witmer coefficient,GWC)。GWC=(房水特異性IgG抗體滴度/房水總IgG抗體滴度)/(血清特異性IgG抗體滴度/血清總IgG抗體滴度)。若房水標(biāo)本中某一病毒特異性抗體滴度>9 U/ml且其GWC>3,則認(rèn)為眼內(nèi)有特異性病毒抗體生成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測

植片失功組4眼因前房淺在角膜移植術(shù)中未獲得足量房水,僅行房水及角膜組織PCR檢測;其余10眼及BK組15眼均進(jìn)行病毒DNA及抗體檢測。

植片失功組共9眼(9/14)發(fā)現(xiàn)至少一項(xiàng)病毒檢測結(jié)果陽性,其中CMV陽性6眼(6/14),VZV陽性3眼(3/14)。植片失功組中,房水PCR陽性5眼(5/14),角膜組織PCR陽性5眼(5/14),房水病毒抗體GWC升高3眼(3/10);其中,存在2種檢測結(jié)果陽性者2例(2/10),3種檢測結(jié)果均陽性者僅1例(1/10),各檢測方法間一致性差(表2)。BK組2眼(2/15)房水CMV GWC升高,其GWC分別為3.02和4.91,其余均為陰性。植片失功組病毒檢測陽性率為64.2%(9/14),明顯高于BK組的13.3%(2/15),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。

表2 植片失功組的臨床特征及病毒檢測Table 2 Clinical characteristics and virological analysis results in graft failure group編號性別年齡(歲)眼別發(fā)病時(shí)間(個月)本次發(fā)病距末次角膜移植時(shí)間(個月)眼部臨床特征病毒檢測陽性術(shù)后高眼壓多次角膜移植手術(shù)史a既往病毒性角膜炎b房水PCR角膜組織PCRGWC[病毒(數(shù)值)]1男52右123------2男76右30--+CMV--3男65左654------4女50左62+-+--CMV(3.18)5男5左1224++-CMVCMVCMV(9.72)6女6左1248+--VZVVZV-7女59左3612+++-CMVCMV(37.49)8男62左630--+--N/A9女79右618-----N/A10女1左126----CMVN/A11女4右126++--CMVN/A12女29左21+-+---13男51左13---VZV--14男59右951+-+VZV-- 注:a:指本次角膜植片失功前即存在≥2次角膜移植手術(shù)史;b:指在首次角膜移植手術(shù)前即存在病毒性角膜炎病史;PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);GWC:Goldmann-Witmer系數(shù);CMV:巨細(xì)胞病毒;VZV:帶狀皰疹病毒;N/A:不適用 Note:a:at least twice keratoplasty experience before this graft failure;b:diagnosed with viral keratitis before the initial keratoplasty;PCR:polymerase chain re-action;GWC:Goldmann-Witmer coefficient;CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;N/A:not applicable

2.2 植片失功組病毒檢測陽性與臨床特征的一致性分析

植片失功組中7眼(7/14)出現(xiàn)角膜植片失功前有高眼壓表現(xiàn),3眼(3/14)在本次角膜移植術(shù)前即存在≥2次的角膜移植手術(shù)史,6眼(6/14)在首次角膜移植術(shù)前即存在病毒性角膜炎病史,與術(shù)中病毒檢測結(jié)果一致性均差(kappa=0.143、-0.155、-0.286)。

3 討論

對于植片失功患者,再次行角膜移植時(shí)明確病因至關(guān)重要。既往有角膜移植手術(shù)史者,對于排斥反應(yīng)或內(nèi)皮細(xì)胞自然衰竭繼發(fā)的植片失功,再次行角膜移植后均建議適當(dāng)增加糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑應(yīng)用強(qiáng)度和時(shí)間[7]。而對于病毒感染繼發(fā)的植片失功,大量糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑反而增加潛伏病毒再激活風(fēng)險(xiǎn)。通過聯(lián)合多種檢測手段,本研究在植片失功患者中發(fā)現(xiàn)9眼(9/14)存在至少一項(xiàng)病毒檢測結(jié)果陽性,其中CMV為主要致病原。本研究中病毒陽性率明顯高于既往研究[3-4],分析可能原因?yàn)?(1)檢測病毒種類和手段不同。本研究聯(lián)合多種檢測手段篩查HSV、VZV及CMV感染情況,而文獻(xiàn)[3-4]僅通過PCR或免疫組織化學(xué)方法檢測HSV-1;(2)本研究中主要致病原為CMV,其所致角膜內(nèi)皮炎在亞洲人群中發(fā)病率明顯高于其他人群。例如,有英國研究者回顧篩查失功角膜植片均未發(fā)現(xiàn)CMV感染[8],而中國臺灣研究者在角膜移植術(shù)中行病毒檢測發(fā)現(xiàn)CMV感染率高達(dá)36.7%[5]。鑒于CMV感染致植片失功病例報(bào)道也多集中在東南亞地區(qū)[9-10],不排除發(fā)病存在種族差異可能。

角膜移植術(shù)中進(jìn)行病毒檢測的另一目的是明確患者眼內(nèi)是否仍存在活動性感染。既往研究中發(fā)現(xiàn),角膜移植時(shí)植片或受體若病毒檢測陽性,其術(shù)后角膜細(xì)胞丟失率明顯升高,且術(shù)后植片失功比例更高[1-2,11]。Fernndez López等[9]報(bào)道CMV房水陽性病例在角膜內(nèi)皮移植后其植片存活時(shí)間僅為(8.0±3.8)個月,而這主要與病毒感染在角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。Ang等[10]報(bào)道,對于既往有CMV性角膜內(nèi)皮炎病史的患者,即使在經(jīng)過成功抗病毒治療、房水PCR檢測轉(zhuǎn)陰的情況下,角膜內(nèi)皮移植術(shù)后1年內(nèi)也仍有60%的復(fù)發(fā)率。盡管目前房水的PCR檢測是診斷多種眼內(nèi)病毒感染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn),但我們認(rèn)為對于慢性病程患者,其實(shí)際診斷效能有限。本研究植片失功組中,過半患者(9/14)至少一項(xiàng)病毒檢測結(jié)果陽性,其中僅5例(5/14)房水PCR陽性,多種病毒檢測結(jié)果一致性較差,這可能為病毒感染在角膜移植術(shù)后發(fā)病率高提供了一種解釋。一方面,有3例房水PCR檢測陰性而角膜組織標(biāo)本檢測陽性。由于角膜移植術(shù)中常規(guī)僅涉及中央8～9 mm直徑范圍內(nèi)中央全層或板層角膜,植床或前房內(nèi)的感染灶可能在后期累及植片。另外,2例病例房水PCR檢測結(jié)果為陰性但抗體GWC升高,這可能與病毒感染病程后期病理過程已由病毒復(fù)制轉(zhuǎn)為免疫反應(yīng)有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,病毒性葡萄膜炎發(fā)病超過2個月后也存在房水中難以檢測出病毒核酸的情況[12]。此外,房水中本身細(xì)胞含量低也可能導(dǎo)致PCR出現(xiàn)假陰性結(jié)果。與單純行房水病毒PCR檢測相比,角膜移植術(shù)中聯(lián)合多種檢測手段發(fā)現(xiàn)漏診的活動性感染更有助于指導(dǎo)術(shù)后的抗病毒治療及隨訪。

角膜移植術(shù)后的病毒感染一直是臨床診療中的難點(diǎn)。近年來,隨著相關(guān)病例報(bào)道的累積,有研究者試圖總結(jié)其臨床表現(xiàn)特點(diǎn),為診斷提供幫助[6]。例如典型病例常伴發(fā)病毒性前葡萄膜炎,可出現(xiàn)輕中度眼壓升高;既往的病毒性角膜炎病史或反復(fù)的角膜移植手術(shù)史也可能提示植片失功與病毒感染有關(guān)。但在本研究的植片失功組內(nèi),以上因素與病毒檢測結(jié)果之間一致性差,這可能與本研究中發(fā)病時(shí)間較長有關(guān)。角膜移植術(shù)后眼壓升高較常見,且病因復(fù)雜,難以作為獨(dú)立的鑒別點(diǎn)。而既往病毒感染史以及多次角膜植片失功、角膜移植病史,可能會由于早期臨床上病毒檢測手段相對受限,存在一定的誤診、漏診,導(dǎo)致其在鑒別診斷時(shí)參考價(jià)值有限。綜上,盡管部分病毒感染所致的植片失功可能存在一些特征性臨床表現(xiàn),在考慮再次行角膜移植時(shí),仍建議聯(lián)合多種病毒檢測手段以明確病因。

此外,本研究結(jié)果顯示,BK組中2例(2/15)CMV GWC升高,表現(xiàn)為彌漫角膜水腫而不伴明顯前房炎癥反應(yīng)。偽裝為BK的非典型內(nèi)皮炎文獻(xiàn)中也有報(bào)道[13],本研究中2例患者也可能實(shí)為內(nèi)皮炎病例。另一可能則是目前通用的GWC陽性閾值(>3.0)設(shè)定偏低,對于角膜內(nèi)皮炎或葡萄膜炎的診斷特異性不足。

本研究的局限性主要在于樣本量較小,部分患者在角膜移植術(shù)前已應(yīng)用抗病毒治療,因此病毒檢測結(jié)果與角膜植片失功早期的病毒感染發(fā)病情況存在一定差異。另外,由于患者房水量有限,部分病例無法兼顧多種病毒核酸及抗體檢查。若疾病早期能夠通過檢測明確感染的病原體,在后續(xù)角膜移植中則能夠選擇特定病原體的多種檢測手段綜合診斷。

綜上所述,病毒感染為角膜植片失功的常見病因。由于病程較長且臨床表現(xiàn)不典型,再次行角膜移植術(shù)中聯(lián)合多種病毒檢測手段有助于明確病因及病毒感染狀態(tài),指導(dǎo)后續(xù)治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明郭雨欣:設(shè)計(jì)試驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫;孫彬佳:設(shè)計(jì)試驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);彭榮梅:分析/解釋數(shù)據(jù)、論文修改審查;洪晶:研究指導(dǎo)、論文修改審查