高 朋，徐丹丹，張 斌，劉訓(xùn)濤，舒麗莎

1.河北北方學(xué)院 研究生院，河北 張家口 075000；河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 2.中心實(shí)驗室；3.檢驗科；4.婦科，河北 張家口 075000

根據(jù)GLOBOCAN 2020,宮頸癌是繼乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌之后的全球女性第四常見癌,全世界估計有604 000例新的宮頸癌病例和342 000例死亡病例[1]。宮頸癌早期、局部晚期和轉(zhuǎn)移性疾病的 5 年總生存率 (OS) 分別約為 92%、65% 和 17%。晚期或者復(fù)發(fā)的宮頸癌不能接受手術(shù)或者放療預(yù)后差,中位無進(jìn)展生存期約2～5個月,總生存期約5～16個月[2]。

氯喹(chloroquine,CQ)最初主要用于預(yù)防和治療瘧疾,現(xiàn)在則是一種眾所周知的自噬抑制劑。此外,CQ還被認(rèn)為是一種潛在的抗癌劑,具有減少癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及克隆形成的能力[3]。有研究認(rèn)為,CQ的抗腫瘤作用主要?dú)w因于自噬抑制[4],這是通過溶酶體來降解細(xì)胞內(nèi)大分子和細(xì)胞器從而在細(xì)胞中起到抑癌機(jī)制的作用。然而,據(jù)報道,CQ 抑制自噬的能力并不是其發(fā)揮抗腫瘤作用的唯一機(jī)制。證據(jù)表明,單獨(dú)使用 CQ 也可有效抑制肺癌、肝癌及胰腺癌細(xì)胞的增殖[5-6]。然而,CQ單一療法對人宮頸癌細(xì)胞系HeLa的抗腫瘤作用的機(jī)制尚未得到明確研究。本研究擬以宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞為材料,探討CQ對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響,以期為臨床有效治療宮頸癌提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞: 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(武漢普諾賽科技有限公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒: 氯喹(Toronto Research Chemicals公司);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清(上海逍鵬生物科技有限公司);細(xì)胞自噬染色試劑盒(MDC法)、Hoechst33342染色液、細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒(CCK-8)(河北瑞帕特科技有限公司);活性氧檢測試劑盒(ROS Assay Kit-Highly Sensitive DCFH-DA)(日本同仁化學(xué)科技有限公司)。Annexin V-eFluor450/7-AAD凋亡檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)單抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)抗體、兔抗人磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phospho-phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)單抗、兔抗人p-AKT單抗和兔抗人p-MDM2單抗(武漢三鷹有限公司);兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)單抗、兔抗人Sequestosome-1(SQSTM1/p62)單抗和兔抗人Beclin 1單抗(日本博爾邁有限公司);兔抗人磷酸化辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG抗體(二抗)(北京博奧森有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。選取處于對數(shù)期的細(xì)胞分為對照組和CQ組(濃度分別為25,50,75,100,150 μmol/L),每組設(shè) 4 復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性:不同濃度CQ干預(yù)后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。吸棄培養(yǎng)液,每孔加 100 μL 稀釋的 CCK-8溶液(無血清DMEM∶CCK-8原液=9∶1),于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h后取出,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔吸光度(Absorbence,A)值,取平均值。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗組A值-空白對照組A值)/(細(xì)胞對照組A值-空白對照組A值)×100%。每組設(shè)6個復(fù)孔,實(shí)驗重復(fù)3次。選擇IC20、IC50氯喹濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗檢測細(xì)胞克隆形成率:取對數(shù)增殖期細(xì)胞胰酶消化計數(shù)后,以每孔1×103個的細(xì)胞的密度接種于12孔板,每3 d更換1次培養(yǎng)基,當(dāng)集落細(xì)胞數(shù)大于50個時終止培養(yǎng);4%多聚甲醛固定15 min,并在室溫下用結(jié)晶紫染色10 min,清洗干燥后拍照計數(shù)。并用Image J定量分析集落細(xì)胞數(shù)>50 個的集落數(shù)。每組設(shè)3個復(fù)孔,實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.4 MDC染色法檢測自噬活性:消化后的細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞貼壁后加入適量MDC染色液,37 ℃避光孵育30 min。吸凈MDC染色液,使用Assay Buffer洗滌3次后再加入1 mL Assay Buffer。在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā),觀察綠色熒光。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.5 活性氧檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS:消化后的細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞貼壁后加入適量DCFH-DA,按說明書操作。在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā),觀察綠色熒光。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.6 Hoechst33342染色檢測細(xì)胞核:消化后的細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞貼壁后加入適量hoechst33342染色液,避光孵育20 min;PBS洗滌1次;在熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā),觀察藍(lán)色熒光。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.7 Annexin V-eFluor450/7-AAD雙染法檢測細(xì)胞凋亡率:消化后的細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞貼壁48 h后棄上清,向100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL annexin Ⅴ試劑;室溫避光孵育15 min;加入結(jié)合緩沖液洗滌,離心棄上清;在200 μL緩沖液中重懸細(xì)胞并加入5 μL的7-AAD,室溫孵育15 min后將其加載到流式細(xì)胞儀,分別通過450和670 nm的帶通濾光片測定eFluor450和 7-AAD熒光,在405 nm波長下激發(fā)以檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白印跡法檢測自噬蛋白、凋亡蛋白、PI3K/AKT/MDM2通路蛋白的表達(dá):從細(xì)胞中提取蛋白后采用BCA試劑盒測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)變性后,通過配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育和顯影等步驟,檢測自噬蛋白(p62,Beclin1,LC3)、凋亡蛋白(Bax,Bcl-2,PARP)、p-PI3K、p-AKT、p-MDM2蛋白表達(dá)情況。用Image J分析條帶吸光度值。目的蛋白的相對表達(dá)量 =目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參蛋白(GAPDH)吸光度值。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CQ抑制HeLa細(xì)胞增殖能力

與對照組相比,CQ呈時間及劑量依賴性抑制HeLa細(xì)胞的增殖(P<0.01)(圖1)。藥物在48 h的IC20和IC50分別為25 μmol/L和75 μmol/L,因此,在后續(xù)的實(shí)驗中選擇該濃度的CQ進(jìn)行實(shí)驗。

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group.圖1 細(xì)胞存活情況比較Fig 1 Comparison of cell survival in each group

2.2 CQ抑制HeLa平板集落形成能力

與對照組相比,實(shí)驗組細(xì)胞集落形成逐漸減少(P<0.01)(圖2)。

*P<0.01 compared with control group.圖2 CQ抑制細(xì)胞集落形成Fig 2 CQ inhibits cell colony formation

2.3 CQ抑制HeLa細(xì)胞自噬活性

與對照組相比,實(shí)驗組自噬囊泡顯著增加(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with control group;arrow indicates autophagic vacuole.圖3 各組細(xì)胞的MDC染色Fig3 The MDC staining of the cells in each group

2.4 CQ誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

細(xì)胞經(jīng)DCFH-DA染色后,ROS陽性呈綠色熒光。細(xì)胞核經(jīng)hoechst33342染色后均呈藍(lán)色熒光。與對照組相比,實(shí)驗組藍(lán)色熒光未見明顯變化,綠色熒光顯著增強(qiáng)(P<0.001)(圖4)。

*P<0.001 compared with control group.圖4 CQ誘導(dǎo)細(xì)胞ROS形成Fig 4 CQ induced ROS formation in cells

2.5 CQ誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡

與對照組相比,實(shí)驗組凋亡率顯著升高(P<0.01)(圖5)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group.圖5 CQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Fig 5 CQ induced apoptosis in cells

2.6 CQ對Bax、Bcl-2、PARP、LC3、p62、Beclin1及p-PI3K/AKT/MDM2通路蛋白的影響

與對照組相比,實(shí)驗組LC3、p62、Bax及剪切的PARP蛋白相對表達(dá)水平升高,Beclin1、Bcl-2、p-PI3K、p-AKT和p-MDM2蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)(圖6)。

A,C,E.expression of LC3,p62,Beclin1,p-MDM2,p-PI3K,p-AKT,Bax,Bcl-2 and cleaved-PARP protein detected by Western blot; B,D,F.sataistical analysis of Western blot results; *P<0.05,**P<0.01 compared with control group.圖6 CQ對LC3、p62、Beclin1、Bax、Bcl-2、PARP及PI3K/AKT/MDM2通路蛋白的影響Fig 6 Effect of CQ on the LC3, p62, Beclin1, Bax, Bcl-2, PARP, and the PI3K/AKT/MDM2 pathway proteins

3 討論

應(yīng)用抗癌藥物的主要策略包括抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗結(jié)果表明,CQ以劑量依賴性方式顯著抑制癌細(xì)胞的增殖。目前的結(jié)果與CQ可抑制肺癌、肝癌及胰腺癌細(xì)胞增殖的結(jié)果相一致。眾所周知,ROS參與細(xì)胞死亡,其是增殖、分化和凋亡過程中重要的信號分子[7]。事實(shí)上,幾種抗癌劑被證明可以通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-10]。因此,實(shí)驗研究了ROS在CQ誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的作用。CQ增加了DCFH的熒光強(qiáng)度,提示了細(xì)胞內(nèi)ROS的增加,這一實(shí)驗結(jié)果與之前的報告相一致,可能也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵誘因之一[11]。

自噬是溶酶體降解體內(nèi)衰老、損傷細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程[12]。LC3 Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3 Ⅱ被廣泛認(rèn)為是自噬的標(biāo)志物。p62作為自噬的底物,隨著自噬活性的減弱而增多[13]。Beclin-1主要作用是募集ATG,而ATG是自噬體形成的關(guān)鍵因素。Beclin1降低表明自噬活性受到抑制。本實(shí)驗結(jié)果表明CQ劑量依賴性增加p62、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的表達(dá),降低Beclin1的表達(dá),說明CQ抑制HeLa細(xì)胞自噬。細(xì)胞凋亡在癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究分析了CQ處理后Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果表明,Bax表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)降低,Bax/Bcl-2比值增加。而Bax 的過度激活與 Bcl-2表達(dá)的降低協(xié)同作用可以增加線粒體膜通透性,從而釋放促凋亡分子,激活半胱天冬酶3、6和7,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PARP被執(zhí)行型的caspase剪切,成為凋亡的標(biāo)志物。因此,這就不難理解,在本研究中觀察到切割的PARP表達(dá)增加的結(jié)果。PI3K/AKT信號通路參與細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡,其通常在各種腫瘤中被激活[14]。有研究表明,磷酸化AKT可以進(jìn)一步激活下游蛋白,從而抑制細(xì)胞凋亡,例如MDM2[15]。此實(shí)驗結(jié)果表明CQ可顯著降低磷酸化PI3K/AKT/MDM2蛋白的表達(dá),阻斷了PI3K/AKT/MDM2通路,這可能是CQ抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡的重要原因。但本實(shí)驗還存在一些不足:1)沒有進(jìn)行抑制實(shí)驗驗證CQ的抗癌作用依賴于PI3K/AKT/MDM2信號通路;2)缺乏動物實(shí)驗驗證;3)只使用了一種細(xì)胞系。