劉海君,張洪巖,湯 雋,任開明,趙俊剛

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院胸外科,沈陽 110004)

2020年癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,肺癌是全球第二大高發(fā)惡性腫瘤,約有220萬新發(fā)病例,約有180萬病例死于肺癌[1]。根據(jù)細胞學類型,肺癌主要分為非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌,其中肺腺癌是NSCLC的最常見病理亞型[2]。早期肺腺癌患者缺乏特異性臨床表現(xiàn),易錯過最佳診斷時間,中晚期患者常發(fā)生局部浸潤甚至遠處轉(zhuǎn)移,導致治療效果不佳,5年總生存(overall survival,OS)率長期低于20%[3]。目前,靶向治療和免疫治療是肺腺癌治療的主要手段,在部分患者中取得了良好的臨床效果[4-5],但由于腫瘤異質(zhì)性,臨床上受益人群仍有限[6]。

視網(wǎng)膜脫氫酶5(retinol dehydrogenase 5,RDH5)屬于RDH家族,通過催化維生素A氧化為視黃醛成為視覺循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶[7-8]。近年來有報道指出RDH5在多種癌癥中存在異常表達:在結(jié)直腸癌中RDH5的表達水平降低,通過影響細胞生長和分化來促進了結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。胃癌患者的外顯子組測序表明RDH5的突變可能與早期癌變有關(guān)[10-11]。RDH5在肝細胞癌組織中表達明顯下調(diào),其低表達與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[12]。但在雌激素受體陰性乳腺癌中,RDH5的表達升高被認為是腫瘤發(fā)生和耐藥的原因之一[13]。目前RDH5在肺癌中的表達情況,功能和作用機制仍不清楚。所以探究RDH5在肺癌中的相關(guān)信息對于預(yù)測肺癌患者預(yù)后情況,開展針對肺癌的特異性治療及提高治愈率有著重要的理論和臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1437和支氣管上皮細胞系16HBE購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。所有細胞系均在含10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.1.2組織標本

選取2012年1月至2014年12月于本院行根治性切除的139例肺腺癌患者為研究對象。所有患者均未接受術(shù)前放化療,無重大疾病史及其他腫瘤病史。病理診斷符合美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版標準,其中男103例,女36例;AJCC分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期34例,Ⅲ期78例。收集研究對象腫瘤組織及配對癌旁組織(距腫瘤邊緣3 cm以上,避免腫瘤中心明顯鈣化或壞死部分),保存于液氮中,隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。本研究所有研究對象簽署知情同意書,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)

Trizol法分別提取組織和細胞中RNA。加入適量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10～15 min)。在260～280 nm處獲得吸光度(A)值評估濃度。依據(jù)說明書,通過Advantage?RT-for-PCR 試劑盒 (日本Takara公司) 使用2 μg RNA合成cDNA。將cDNA稀釋,使用 HiScript?Ⅱ One Step qRTPCR SYBR?Green Kit(日本Takara公司)進行RT-qPCR。PCR擴增循環(huán)條件:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性1 min,63 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30 個循環(huán)。72 ℃延伸10 min 后降至4 ℃。以β-actin作為內(nèi)參照。

所有PCR實驗均使用LightCycler 480 system Ⅱ(德國羅氏診斷有限公司)完成。RDH5的上游引物是5′- GCT TCT TCC GAA CCC CTG TG -3′,下游引物是5′-CCT GGC TAC TCA CAC TTG GT-3′;β-肌動蛋白的上游引物是5′-ATT GGC AAT GAG CGG TT-3′,下游引物是5′-CGT GGA TGC CAC AGG ACT-3′。引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染

RDH5表達被預(yù)先設(shè)計的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)干擾(#1,s11893;#2,s11894;Cat#4392420,美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用非靶向shRNA作為陰性對照(#4390843,美國Thermo Fisher Scientific公司)。使用Lipofectamine RNAiMAX(#13778-150,美國Thermo Fisher Scientific公司)混合siRNA進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3Western blot

將培養(yǎng)的細胞用冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌兩次,并在含有1×Halt蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(#78442,美國Thermo Fisher Scientific公司)的RIPA 緩沖液中裂解。裂解液以1 s的間隔超聲1 s,總共1 min,然后在15 000×g和4 ℃下離心15 min。收集上清液作為全細胞裂解物。蛋白質(zhì)樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。膜用5%低脂奶粉封閉,并在4 ℃下用抗 RDH5 的一抗(PA5-19319,美國Thermo Fisher Scientific公司,1∶1 000)、抗β-actin(#4967,美國Cell Signaling Technology公司,1 ∶5 000)、抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)3(#9662,美國Cell Signaling Technology公司,1∶1 000)、抗裂解(cleaved)-caspase3(#9664,美國Cell Signaling Technology公司,1∶1 000)在TBST中稀釋用于Western blot。在室溫下與山羊抗兔IgG二抗(#7074,美國Cell Signaling Technology公司,1∶5 000)孵育1 h后通過使用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑(美國GE Healthcare公司)曝光顯影蛋白條帶1 min。

1.2.4流式細胞分析

在含有1% BSA的PBS中將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。細胞懸液與抗體室溫孵育30 min,用含1% BSA的PBS洗滌和離心2次,將細胞沉淀懸浮于PBS中。流式細胞術(shù)使用 FACSVerse (美國BD Biosciences公司)儀器進行。使用 FlowJo 3.3軟件分析流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。

1.2.5細胞活性實驗

使用CCK-8試劑盒,并依據(jù)其使用說明書測定處理后細胞活性。接種細胞24 h后,開始轉(zhuǎn)染細胞。之后每隔24 h使用CCK-8 10 μL、避光孵育1 h,使用酶標儀在450 nm處測定A值。

1.2.6細胞凋亡實驗

收集含有漂浮凋亡細胞的上清液,將貼壁細胞沉淀并與漂浮細胞結(jié)合。 收集的細胞用PBS洗滌兩次,每個沉淀以1×107個/mL 重懸于膜聯(lián)蛋白(Annexin)V結(jié)合緩沖液中。細胞用Annexin V(#640918,美國BioLegend公司)和7-AAD(#420403,美國BioLegend公司)染色,并在室溫下避光孵育15分鐘。將Annexin V結(jié)合緩沖液添加到每個樣品中,并使用 FACSVerse 儀器(美國BD Biosciences公司)分析細胞。

1.2.7生物信息學分析

于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)分析RDH5在泛癌和肺腺癌中的表達差異,log-rank進行生存分析,以ggplot2進行可視化。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 RDH5 mRNA在肺腺癌組織及癌旁組織中的表達水平

TCGA分析結(jié)果顯示,RDH5在肺腺癌組織表達水平高于癌旁正常組織,且RDH5高表達患者的OS率低于低表達患者(P<0.05),見圖1。

A:RDH5 mRNA在肺腺癌及癌旁正常組織中的表達水平;B:RDH5表達水平對肺腺癌患者的生存影響;aP<0.05。圖1 RDH5在肺腺癌組織中的表達情況及預(yù)后影響

2.2 RDH5在肺癌細胞系的表達水平

A549、H1437中RDH5 mRNA相對表達水平較16HBE升高,A549、H1437中RDH5蛋白表達增加(P<0.05)。siRNA處理后,A549、H1437中RDH5 mRNA相對表達水平較處理前降低,RDH5蛋白表達減少(P<0.05),見圖2。因siRNA#2轉(zhuǎn)染后RDH5 mRNA和蛋白表達水平較siRNA#1轉(zhuǎn)染后更低,故選取siRNA#2進行后續(xù)研究。

A:3種細胞系中RDH5 mRNA相對表達水平比較;B:3種細胞系中RDH5蛋白表達情況;C:siRNA轉(zhuǎn)染后,肺腺癌細胞系中RDH5 mRNA相對表達水平比較;D:siRNA轉(zhuǎn)染后,肺腺癌細胞系中RDH5蛋白表達情況;a:P<0.05,與A549比較;b:P<0.05,與H1437比較。圖2 RDH5在肺腺癌細胞中的表達情況

2.3 干擾RDH5的表達對肺腺癌細胞的影響

siRNA轉(zhuǎn)染96 h后,A549、H1437中細胞增殖率較對照明顯降低(P<0.05)。克隆形成實驗結(jié)果顯示,siRNA轉(zhuǎn)染后細胞群落數(shù)明顯減少,見圖3。隨著siRNA轉(zhuǎn)染,RDH5表達減少,細胞凋亡比例增加,A549、H1437中凋亡細胞分別從9.3%、10.0%增加至32.1%、45.6%。siRNA轉(zhuǎn)染后,A549、H1437的caspase3表達減弱,cleaved-caspase3表達增強,見圖4。

A:A549細胞增殖率變化情況;B:H1437細胞增殖率變化情況;C:A549克隆形成實驗;D:H1437克隆形成實驗;a:P<0.05。圖3 CCK-8和克隆形成評估RDH5對細胞增殖的影響

A:A549的Annexin V/7AAD染色分析;B:H1437的Annexin V/7AAD染色分析;C:肺腺癌細胞系中凋亡相關(guān)蛋白表達情況。圖4 抑制RDH5表達促進細胞凋亡

2.4 RDH5表達水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

肺腺癌組織中RDH5相對表達的中位水平為2.24,以此作為截斷值將RDH5相對表達水平≥2.24的患者作為高表達(n=83),將RDH5相對表達水平<2.24的患者作為低表達(n=56)。結(jié)果顯示,RDH5高表達與低表達的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 RDH5表達水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.5 RDH5表達水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

139例肺腺癌患者中,術(shù)后5年內(nèi)死亡95例(死亡率68.34%),中位無病生存(disease-free survival,DFS)時間為33(15,68)個月,中位OS時間為 46(24,69)個月。RDH5高表達的DFS、OS時間較低表達患者縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖5、表2。

表2 RDH5高低表達的DFS、OS時間比較[M(Q1,Q3),月]

A:DFS;B:OS。圖5 RDH5高表達與低表達肺腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

單因素分析顯示,不同性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AJCC分期的DFS、OS比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。將差異有統(tǒng)計學意義的單因素分析結(jié)果納入多因素分析,結(jié)果顯示RDH5高表達提示患者的不良預(yù)后(P<0.05),見表4。

表3 影響肺腺癌患者DFS、OS的單因素分析[M(Q1,Q3),月]

表4 影響肺腺癌患者DFS、OS的多因素分析

3 討 論

盡管已經(jīng)做出了巨大的努力,但NSCLC患者的預(yù)后仍未得到改善。在過去10年中,分子靶向治療的發(fā)展對肺腺癌的治療方法產(chǎn)生了巨大影響,小分子酪氨酸激酶抑制劑的使用進一步延長了表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、間變性大細胞淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS proto-oncogene 1,receptor tyrosine kinase,ROS1)和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體絡(luò)氨酸激酶(neurotrophin receptor kinase,NTRK)突變患者的生存期[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌高表達RDH5,與疾病預(yù)后、細胞生長和凋亡等方面密切相關(guān),是肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子。RDH5的發(fā)現(xiàn)是由于其在視網(wǎng)膜色素上皮循環(huán)中的重要作用,它是將11-順-維生素A轉(zhuǎn)化為11-順-視黃醛的關(guān)鍵酶,該基因的突變可能導致視網(wǎng)膜色素變性引起眼病[16]。盡管很少有組織學研究報道RDH5表達與癌癥之間的關(guān)系,但近年研究顯示,RDH5在結(jié)直腸癌、肝癌和胃癌中表達異常,且導致預(yù)后不良[9-12]。也有報道指出,RDH5在雌激素受體陰性乳腺癌中高表達,導致腫瘤進展及耐藥[13]。RDH5在早期胃癌中發(fā)生突變,是早癌發(fā)生的驅(qū)動因素[11],但RDH5在肝細胞癌中的突變率較低[12]。RDH5與腫瘤表觀遺傳學改變存在相關(guān)性,與非腫瘤組織相比,RDH5在甲狀腺乳頭狀癌中甲基化程度低,這表明DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)RDH5的表達。相似的結(jié)論在肝細胞癌中也有報道,即肝癌中存在明顯的RDH5 DNA甲基化修飾異常[12]。目前,RDH5在腫瘤中的生物學功能暫不能統(tǒng)一,但根據(jù)已知的研究報道,RDH5有其雙刃劍的作用,在不同的癌癥中的不同表達會有不同的功能。因此,明確其上下游的信號通路對研究RDH5有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)RDH5在肺腺癌中特異性表達,通過激活caspase3介導了細胞凋亡。既往研究一度認為細胞凋亡是唯一受調(diào)控的細胞死亡機制,但隨著近年來對介導細胞死亡機制的理解不斷加深,除了細胞凋亡外,壞死性凋亡、細胞焦亡和細胞自噬都是受調(diào)控的細胞死亡機制[17]。而尋找各種抗癌機制引起細胞死亡可能會引領(lǐng)新的靶向治療方案的制訂。其中細胞凋亡的特點是細胞收縮、染色質(zhì)濃縮、核碎裂、質(zhì)膜起泡和鄰近吞噬細胞清除碎片[18],在本研究中,下調(diào)RDH5后肺腺癌細胞表現(xiàn)出活性減低并抑制增殖。在進一步的實驗中,發(fā)現(xiàn)下調(diào)RDH5的表達可以誘導肺腺癌細胞凋亡,且證明RDH5在肺腺癌細胞系中會關(guān)聯(lián)caspase3介導的細胞凋亡過程,導致肺腺癌細胞死亡。caspase3是刺激癌癥細胞凋亡的關(guān)鍵分子,是一種無活性二聚體,通過某個亞基的蛋白水解切割啟動激活,不同的蛋白酶切割caspase3酶原以激活caspase3。cleaved-caspase3是caspase3的激活形式,是促進細胞凋亡的主要裂解酶[19]。cleaved-caspase3進一步切割不同的底物,導致蛋白酶級聯(lián)放大,最終導致細胞凋亡,切割的底物導致蛋白質(zhì)功能的改變,從而導致與細胞凋亡相關(guān)的細胞變化。因此,caspase3激活意味著誘導細胞凋亡[20]。本研究證實RDH5可以調(diào)節(jié)caspase3的表達來調(diào)控細胞凋亡過程,雖然不能明確更具體的機制,但根據(jù)既往的報道,RDH5可以調(diào)控HIPPO通路[12],而HIPPO通路與細胞死亡有密切關(guān)聯(lián)[21],可以推測RDH5可能通過HIPPO通路調(diào)控細胞凋亡過程,但仍需要更多的證據(jù)。此外,caspase3除了介導細胞凋亡,還可以通過裂解焦孔素(gasdermin,GSDME)來誘導細胞焦亡[22]。且有報道表明,細胞凋亡后會繼發(fā)性引起細胞焦亡,所以RDH5有介導細胞焦亡的可能性,不過這仍需更多的證據(jù)表明,包括細胞形態(tài)和信號通路的驗證。

綜上所述,RDH5主要在肺腺癌組織中表達,其可通過抑制caspase3的激活來逃避細胞凋亡,從而增強細胞生存能力和耐藥性。因此,RDH5可能是肺腺癌患者預(yù)后的新治療靶點。