劉婉婷 胡子毅

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典科，江西 南昌 330006）

痔瘡臨床表現(xiàn)為各種程度便血、肛門(mén)腫大、肛門(mén)疼痛等癥狀，且易重復(fù)發(fā)病［1］。2013 年—2014 年底，江維等［2］調(diào)查顯示，城市居民肛腸疾病發(fā)病率最高的是痔，占肛腸科發(fā)病率98.92%。據(jù)俞婷等［3］2017 年—2018 年于上海市金山醫(yī)院肛腸科調(diào)查，采用隨機(jī)抽樣以及調(diào)查問(wèn)卷形式，共回收的1477 份合格調(diào)查問(wèn)卷，其中有1080 份顯示被調(diào)查對(duì)象患有痔病，痔瘡患病率73.12%。

目前，西醫(yī)學(xué)對(duì)痔瘡病因病機(jī)的闡述尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大家普遍認(rèn)可的機(jī)制可能為肛墊下移、血管增生、痔病退變以及靜脈曲張等［4-6］。中醫(yī)學(xué)則認(rèn)為痔瘡的病因病機(jī)是外感六淫、過(guò)饑過(guò)飽或饑飽無(wú)常，致氣血虧少，使局部氣血結(jié)滯、筋脈糾結(jié)逆亂［4］?；苯峭璩鲎浴短交菝窈蛣┚址健?，具有清腸疏風(fēng)、祛濕止癢、涼血消腫之功效［7］。文章運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索槐角丸治療痔瘡的作用機(jī)制，為槐角丸的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 槐角丸活性成分的獲取及靶點(diǎn)的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以槐角、地榆、當(dāng)歸、防風(fēng)、枳殼、黃芩為關(guān)鍵詞，限制口服吸收利用度（OB）≥30%和藥物相似性（DL）≥0.18，對(duì)槐角丸的主要成分進(jìn)行檢測(cè)。然后再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）檢索并設(shè)定人源（Human），進(jìn)一步將獲取的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因名稱，從而獲得了與活性成分相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

1.2 痔瘡靶點(diǎn)篩選以“Hemorrhoids”為關(guān)鍵詞，從GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)和Drug-Bank（https：//go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取痔瘡的基因符號(hào)（Gene Symbol），并將結(jié)果保存。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將獲取到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，并導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”（0.400），其余參數(shù)不變。用Cytoscape 3.9.1 軟件中的CytoHubba 插件，依據(jù)馬修斯相關(guān)系數(shù)（MCC）得分，選取得分排名前10位的基因作為核心（Hub）基因。

1.4 京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集通路分析與基因本體論（GO）分類富集分析利用仙桃學(xué)術(shù)（https：//www.xiantaozi.com/）在線網(wǎng)站中的高級(jí)生信工具，對(duì)藥物與疾病的交集基因進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，槐角丸共獲取到58 個(gè)活性成分，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)1270 個(gè)。見(jiàn)表1。預(yù)測(cè)靶點(diǎn)去重后，獲得247個(gè)靶點(diǎn)。

表1 槐角丸“中藥-活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”信息

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得痔瘡疾病基因577 個(gè)，使用DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得痔瘡疾病基因132 個(gè)。剔除重復(fù)基因后，最終得到641個(gè)痔瘡疾病基因。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析將所有得到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到54個(gè)共有靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。MCC 得分從高到低依次是白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、纖連蛋白1（FN1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、趨化因子8（CXCL8）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）。

圖1 槐角丸治療痔瘡的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG富集通路分析與GO分類富集分析KEGG通路富集分析找到123 條信號(hào)通路，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路等。剔除與疾病不相關(guān)的通路，按照富集基因的個(gè)數(shù)從多到少依次排序，選取前20條作圖。見(jiàn)圖2。

圖2 槐角丸治療痔瘡的KEGG通路富集分析柱狀圖

GO 富集分析共有2308 條，包括生物過(guò)程（BP）2179條，細(xì)胞組成（CC）35條和分子功能（MF）94條。按照其基因富集個(gè)數(shù)從高到低依次排序，各選取前10條作圖。見(jiàn)圖3。

圖3 槐角丸治療痔瘡的GO富集分析柱狀圖

涉及BP 的有活性氧代謝過(guò)程（18 個(gè)）、脂多糖（16個(gè)）、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)（14 個(gè)）、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織（14個(gè)）、上皮細(xì)胞增殖（14個(gè)）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（14個(gè)）等；涉及CC 的有膜筏（11 個(gè)）、膜微區(qū)（11 個(gè)）、膜區(qū)域（11 個(gè)）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（7 個(gè)）、質(zhì)膜筏（5 個(gè)）、線粒體外膜（5個(gè)）、細(xì)胞器外膜（5個(gè)）等；涉及MF的主要有受體配體活性（9個(gè)）、細(xì)胞因子活性（8個(gè)）、肽鏈內(nèi)切酶活性（8 個(gè)）、熱休克蛋白結(jié)合（7 個(gè)）、蛋白酶結(jié)合（7個(gè)）、血紅素結(jié)合（7個(gè)）等。

3 討論

槐角丸主要應(yīng)用于肛腸科疾病，且療效確切。此方槐角用量最重，研究［8，9］表明，槐角黃酮中所含的槲皮素、黃芩苷、山柰酚等多種小分子物質(zhì)還能幫助降低毛細(xì)血管系統(tǒng)的通透性和脆性，增加穩(wěn)定性，具有明顯的抗炎、抗腸道潰瘍、止血和凝血等功能。地榆味苦性寒，藥理實(shí)驗(yàn)證明，地榆具有明顯的止血［10］、抗炎消腫［11］、改善血液系統(tǒng)、抗腫瘤［12］等作用。黃芩能增強(qiáng)槐角的清肝涼血的功效，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等作用［13］。雖然下血是因?yàn)闊崞妊合滦?，但也有氣機(jī)下陷的原因。因而稍佐有升發(fā)作用的防風(fēng)、枳殼升舉氣機(jī)。藥理實(shí)驗(yàn)［14］證明，枳殼能夠增強(qiáng)腸胃收縮力、降低血管脆性，能夠達(dá)到壓迫止血的目的。當(dāng)歸補(bǔ)血活血、潤(rùn)腸通便。馬艷春等［15］研究證實(shí)，當(dāng)歸具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)造血功能等效果。

根據(jù)MCC 算法篩選出得分高的前10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分值從高到低依次是IL-6、TNF、VEGFA、PTGS2、EGFR、MMP9、FN1、MMP2、CXCL8、IL-1β。其 中IL-6 和IL-1β 屬白細(xì)胞介素，二者均可與TNF 協(xié)同誘導(dǎo)VEGF 使血管生成活性和血管通透性增加［16］。CXCL8 是α 型趨化因子，在未受刺激的細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到CXCL8。CXCL8-趨化因子受體（CXCR）1/2 軸還通過(guò)NF-κB 通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF 的轉(zhuǎn)錄來(lái)刺激VEGFR2 活化，CXCL8-CXCR2 軸還可反式激活EGFR，從而介導(dǎo)毛細(xì)血管形成［17］。實(shí)驗(yàn)研究［18］表明，痔瘡組織血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGFA表達(dá)明顯高于正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞。楊奕婷等［19］研究發(fā)現(xiàn)，痔瘡組織的新血管生成可能與VEGF 和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF-2）的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，且會(huì)隨著病情的加重而升高。PTGS2是非甾體抗炎藥（NSAID）的靶標(biāo)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，PTGS2 會(huì)大量合成，從而促使前列腺素的合成，從而介導(dǎo)對(duì)生理壓力（如感染和炎癥）的反應(yīng)［20，21］。EGFR 分子及其相關(guān)信號(hào)通路可以直接對(duì)各種表皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分裂過(guò)程和細(xì)胞誘導(dǎo)及分化凋亡過(guò)程等細(xì)胞生理活性反應(yīng)發(fā)揮重要的作用。MMP9、MMP2均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，馮大勇等［22］研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常組織，痔組織中的MMP-9 的表達(dá)率更高，MMP-2 則無(wú)較大差異。并且，在伴有血栓形成等并發(fā)癥的痔組織［23］中MMP-9表達(dá)明顯增高。FN1 參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、調(diào)理作用、傷口愈合和細(xì)胞形狀的維持［24］。

本項(xiàng)研究主要通過(guò)對(duì)KEGG 通路進(jìn)行富集和分析，一共找到了123 條通路。數(shù)據(jù)研究［25］表明，NF-κB 誘導(dǎo)激酶在腸上皮細(xì)胞中由IL-17、TNF-α和IL-1β觸發(fā)的NF-κB 信號(hào)級(jí)聯(lián)中充當(dāng)共同介質(zhì)。此外，有研究［26］顯示成人神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)TNF-α 受體信號(hào)傳導(dǎo)被系統(tǒng)性炎癥警報(bào)。PI3K-Akt 信號(hào)通路是一個(gè)從細(xì)胞膜向細(xì)胞核傳導(dǎo)的通路，活化的PKB（Akt）可直接作用于前體凋亡蛋白，進(jìn)而阻止細(xì)胞死亡、促進(jìn)細(xì)胞存活［27］。汪元等［28］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）可通過(guò)激活VEGF轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對(duì)PI3K-Akt進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)大鼠滑膜血管的新生。曹立睿［29］研究表明，山柰酚可以通過(guò)作用于HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信息通路等來(lái)減少細(xì)胞氧化破壞，并控制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，槐角丸可能是通過(guò)作用于IL-6、MMP2、VEGFA 等54 個(gè)靶點(diǎn)，抑制PI3K-Akt、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，從而起到清熱涼血、消腫止痛的功效。本研究主要依賴于網(wǎng)絡(luò)，且目前國(guó)內(nèi)對(duì)于槐角丸治療痔瘡的研究較少，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。