文/朱凱莉 劉虎 卞從明 董世建 程婷 李增禮[安徽安科生物工程（集團）股份有限公司]

多肽藥物是指通過生物合成法（天然原料提取法、酶解法、發(fā)酵法、基因重組法）或化學(xué)合成法（液相合成法和固相合成法）獲得的具有特定治療作用的多肽，具有生物活性高、特異性強、免疫原性低及穩(wěn)定性強等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于抗病毒、抗腫瘤、抗菌、疫苗、內(nèi)分泌、心血管及糖尿病等醫(yī)療領(lǐng)域。目前，合成多肽藥物應(yīng)用最普遍的是固相合成法，以保護氨基酸（Boc-氨基酸或Fmoc- 氨基酸）作為起始物料，定向獲得目標肽，由于Fmoc- 氨基酸具有在堿性條件下進行脫保護的優(yōu)勢，因此是目前固相合成法中最為常用的起始物料。關(guān)于起始物料中雜質(zhì)的控制，食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）以及ICHQ11、《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》均對原料藥（API）起始物料質(zhì)量控制提出評估意見或要求。芴甲氧羰基氨基酸作為固相合成多肽中的起始物料，引入的雜質(zhì)及所產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)在純化過程中可能與目標肽共同洗脫，因此雜質(zhì)很難減少或消除，為了盡量減少對終產(chǎn)物的潛在影響，需對此類雜質(zhì)建立嚴格的質(zhì)控要求。

檢測固相合成多肽中起始物料的方法有很多，其中高效液相色譜法（HPLC）具有靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好及操作簡單等諸多優(yōu)點。有關(guān)物質(zhì)檢測雜質(zhì)含量低、種類多，故更適合采用HPLC 法進行檢測。本文以芴甲氧羰基-L- 亮氨酸（Fmoc-L-Leu-OH）作為研究對象，建立了HPLC 檢測Fmoc-L-Leu-OH有關(guān)物質(zhì)的方法，并進行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗證。

一、材料

1.主要材料和試劑

Fmoc-L-Leu-OH 對照品，雜質(zhì)對照品：N- 羥基琥珀酰亞胺（HOSu）、9- 芴甲氧羰基- 琥珀酰亞胺碳酸酯（Fmoc-OSu）、9- 芴甲醇（Fmoc-OH）、N- 芴甲氧羰基-β- 丙氨酸（Fmoc-β-Ala-OH）、N- 芴甲氧羰基-β- 丙氨酸- 亮氨酸（Fmoc-β-Ala-Leu-OH）、N- 芴甲氧羰基- 亮氨酰- 亮氨酸（Fmoc-Leu-Leu-OH），乙腈，磷酸，注射用水。

2.主要儀器設(shè)備

賽默飛U3000 高效液相色譜儀，紫外檢測器，電子天平。

二、方法與結(jié)果

1.試液配制

系統(tǒng)適用性溶液：分別稱取Fmoc-L-Leu-OH 對照品與雜質(zhì)對照品HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 適量，精密稱定，加乙腈制成每1 mL 含F(xiàn)moc-Leu-OH 1.0 mg 與雜質(zhì) HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 各約3.0 微克的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

定位溶液：精密稱取各已知雜質(zhì)（HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH）適量，加乙腈溶解并稀釋分別制成濃度約1.0 毫克/毫升的雜質(zhì)定位溶液；精密稱取Fmoc-L-Leu-OH 適量，加乙腈溶解并稀釋配制成濃度約為1.0 毫克/毫升的樣品溶液。

供試品溶液：取本品適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋制成濃度約為1.0 毫克/毫升的溶液，作為供試品溶液。

對照溶液：精密量取供試品溶液適量，加乙腈定量稀釋制成每1 毫升中約含F(xiàn)moc-Leu-OH 1.0 微克的溶液，作為對照溶液。

以乙腈作為空白溶劑和稀釋液。

2.色譜條件

采用Waters XSelect CSHTM C18（4.6×250 mm，5微米）色譜柱，以0.15%磷酸∶乙腈（60∶40）為流動相進行梯度洗脫，洗脫程序如表1 所示，流速為1.0 毫升/分，進樣量為5 微升，柱溫為35 ℃，檢測波長為220納米。

表1 流動相梯度洗脫程序

3.計算方式

本次方法學(xué)驗證各雜質(zhì)采用加校正因子的自身對照法計算，計算公式如下：

已知雜質(zhì)＝AS×f/AR×0.1%

單一未知雜質(zhì)＝Ai/AR×0.1%

總雜質(zhì)＝∑所有雜質(zhì)

式中：AS為供試品溶液中的已知雜質(zhì)峰峰面積；Ai為供試品溶液中的未知雜質(zhì)峰峰面積；AR為對照溶液的峰面積；f為已知雜質(zhì)的相對校正因子。

4.限度

HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 均不得大于對照溶液主峰面積（0.1%），其他單個雜質(zhì)不得大于對照溶液主峰面積的2 倍（0.2%），總雜質(zhì)不得大于對照溶液主峰面積的5 倍（0.5%）。

5.檢測波長的確定

取系統(tǒng)適用性溶液的Fmoc-Leu-OH 和已知雜質(zhì)（HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH）在190～400 納米紫外掃描光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOSu 在波長230納米以上幾乎無紫外吸收，流動相中乙腈的截止波長是190 納米，結(jié)合文獻研究結(jié)果，故將Fmoc-L-Leu-OH 有關(guān)物質(zhì)檢測波長定為220 納米。

6.方法學(xué)驗證

（1）專屬性：取各定位溶液分別進樣檢測，結(jié)果已知雜 質(zhì) HOSu、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-OSu、Fmoc-Leu-Leu-OH 與Fmoc-L-Leu-OH 的保留時間分別為2.647、8.593、9.163、10.277、11.580、14.022、13.155 分鐘。取空白溶劑、適用性溶液進樣檢測，色譜圖如圖1 所示。結(jié)果空白溶劑對各雜質(zhì)檢測無干擾，主峰與相鄰雜質(zhì)之間的分離度分別為11.59、6.07，雜質(zhì)峰之間的分離度分別為62.26、4.60、8.78、10.11，分離度遠大于2.0，表明方法專屬性良好。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

（2）系統(tǒng)重復(fù)性：精密稱取Fmoc-L-Leu-OH 對照品適量，加乙腈溶解并定量稀釋制成每毫升中約含F(xiàn)moc-L-Leu-OH 1.0 微克的對照溶液（0.1%），按“2.2色譜條件”連續(xù)進樣檢測6 次，結(jié)果顯示峰面積的RSD 為0.69%，說明系統(tǒng)穩(wěn)定，系統(tǒng)重復(fù)性較好。

（3）檢測限及定量限：取Fmoc-L-Leu-OH 對照品及各雜質(zhì)對照品，分別用稀釋液逐級稀釋至適宜濃度按前文所述“色譜條件”進樣檢測，分別以信噪比3∶1和10∶1 時注入儀器的量作為檢測限和定量限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各雜質(zhì)的檢測限均不高于主成分質(zhì)量的0.0040%，定量限均不高于主成分質(zhì)量的0.0100%，表明色譜條件靈敏度高，適合進行雜質(zhì)控制。

（4）定量限重復(fù)性：取“（3）檢測限及定量限”中規(guī)定的Fmoc-L-Leu-OH 對照品稀釋至定量限的溶液按前文所述“色譜條件”連續(xù)進樣6 次，結(jié)果主峰保留時間RSD 為0.03%，峰面積的RSD 為5.63%，表明定量限重復(fù)性良好。

（5）線性和范圍：分別精密量取各定位溶液適量，置于同一個10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得混合對照品儲備液。分別精密量取混合對照品貯備液適量，稀釋制成每毫升中含F(xiàn)moc-L-Leu-OH 和各已知雜質(zhì)均為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 微克的溶液，取Fmoc-LLeu-OH 和各已知雜質(zhì)的定量限溶液和上述系列濃度溶液進樣檢測，以濃度（微克/毫升）為x軸，峰面積A為y軸，進行線性回歸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fmoc-L-Leu-OH 和各已知雜質(zhì)在定量限至3 微克/毫升范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)標準曲線斜率計算校正因子（校正因子＝Fmoc-L-Leu-OH 的標準曲線斜率/雜質(zhì)的標準曲線斜率），HOSu、Fmoc-OSu、Fmoc-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-β-Ala-Leu-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH的雜質(zhì)校正因子在0.2～5.0，因此可采用加校正因子的主成分自身對照法計算各雜質(zhì)的含量。

（6）準確度：已知供試品溶液中Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 含量分別約為0.03%、0.06%。取供試品溶液適量，分別加入各已知雜質(zhì)對照品，并用乙腈稀釋至刻度，使各雜質(zhì)的含量為質(zhì)控限度的80%、100%、120%，每個濃度各配制3 份，并分別配制自身對照溶液（0.1%），按前文所述“色譜條件”進樣檢測。計算平均回收率和RSD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各雜質(zhì)均能被準確測出。

（7）精密度：

①重復(fù)性：精密稱取待測樣品適量，平行配制6份供試品溶液按前文所述“色譜條件”進樣檢測，結(jié)果顯示6 份供試品溶液均僅檢測出Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質(zhì)，兩個雜質(zhì)的RSD 分別為3.22%、3.58%，表明本方法重復(fù)性較好。

②中間精密度：在不同時間，由不同操作人員平行配制6 份供試品溶液，采用不同儀器考察樣品的有關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)個數(shù)，與重復(fù)性試驗的6 份實驗結(jié)果比較，結(jié)果顯示6 份供試品溶液檢測出Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質(zhì)，兩個雜質(zhì)的RSD 分別為3.35%、2.48%，兩個操作人員共12 份供試品溶液Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 兩個雜質(zhì)的RSD 分別為3.81%、3.00%，表明本方法中間精密度良好。

（8）溶液穩(wěn)定性：取供試品溶液于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 小時，按色譜條件分別進樣檢測，按面積歸一化法計算各雜質(zhì)的含量，結(jié)果顯示供試品溶液在室溫放置12 小時后，已知雜質(zhì)Fmoc-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH 無增長，其他已知雜質(zhì)、其他單雜均未檢出，溶液穩(wěn)定，溶劑峰無干擾。

（9）耐用性：在不同流速（0.9、1.0、1.1 毫升/分）、柱溫（32、35、38℃）及色譜柱（Waters XSelect CSHTM C18 4.6×250 毫米，5 微米柱、島津GL WondaSil C18，4.6×250 毫米，5 微米）條件下，系統(tǒng)適用性溶液各峰的相對遷移時間、理論塔板數(shù)均無明顯變化，各峰分離度均大于2，能滿足雜質(zhì)的分離要求，且供試品溶液有關(guān)物質(zhì)檢測結(jié)果基本一致。

三、結(jié)論與展望

本文對高效液相色譜法測定Fmoc-L-Leu-OH 中的有關(guān)物質(zhì)進行系統(tǒng)的方法學(xué)驗證，驗證結(jié)果表明：該方法空白溶劑無干擾，F(xiàn)moc-L-Leu-OH 中的6 種已知雜質(zhì)能達到有效分離；6 種雜質(zhì)的檢測限為主成分質(zhì)量的0.0006%～0.0040%，定量限為主成分質(zhì)量的0.0020%～0.0100%，可有效檢測出各雜質(zhì)；各雜質(zhì)在定量限至3 微克/毫升范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，平均回收率在91.6%～103.6%（n＝9），可準確檢測各雜質(zhì)；且精密度與系統(tǒng)重復(fù)性良好；該方法對流速、柱溫及色譜柱耐受性良好，可用于Fmoc-L-Leu-OH 中有關(guān)物質(zhì)的檢測和控制。

由于多肽原料藥起始物料的雜質(zhì)水平直接關(guān)系到目標藥物的安全性和有效性，在其分析方法開發(fā)過程中，應(yīng)充分考慮藥物特點、風(fēng)險評估、靈敏度目標、可接受誤差及試驗可行性等，合理選擇分析方法和平臺，提高分析方法開發(fā)的效率，有效地對原料藥起始物料進行質(zhì)量控制。