李倩倩,林 馨,韋依琳,崔昊宇,鄒榮華,吳曉妮,葛家振,黃國(guó)梁,張麗娟,鄭福英,藺國(guó)珍*

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,蘭州 730030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046)

鴨疫里默氏桿菌是一種革蘭陰性菌,屬于黃桿菌科,里默氏菌屬,可導(dǎo)致鴨的漿膜炎,嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn),可造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。該菌血清型眾多,目前國(guó)際公認(rèn)有21個(gè)血清型,各血清型之間缺乏交叉保護(hù),給疫苗的有效預(yù)防帶來了困難[2]?；诖?在實(shí)際生產(chǎn)中添加抗生素仍然是目前預(yù)防和治療鴨疫里默氏桿菌感染的重要手段。伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,耐藥菌株不斷出現(xiàn)并播散,進(jìn)一步增加了對(duì)鴨疫里默氏桿菌的防控難度[3]。為提高抗生素的應(yīng)用效果,并對(duì)實(shí)際生產(chǎn)給予指導(dǎo),需對(duì)鴨疫里默氏桿菌的耐藥機(jī)制開展研究。

外排泵介導(dǎo)的主動(dòng)外排是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制。目前已報(bào)道了5種外排泵系統(tǒng),分別是耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分裂超家族(resistance nodulation cell division family,RND)、主要易化子超家族 (major facilitator superfamily,MFS)、小多重耐藥家族 (small multidrug resistance family,SMR)、多藥和毒性化合物外排家族 (multidrug and toxic compound extrusion family,MTE)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族 (ATP binding cassette family)[4-5]。RND在革蘭陰性菌中廣泛存在,并且是發(fā)揮重要生物學(xué)功能的外排泵,由內(nèi)膜蛋白(inner membrane protein,IMP)、外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)和周質(zhì)膜融合蛋白(membrane fusion protein,MFP)構(gòu)成三重外排復(fù)合體,有些含有調(diào)控子[6]。前期研究在鴨疫里默氏桿菌中鑒定了3個(gè)RND外排泵,包括RaeC-RaeA-RaeB(外排氨基糖苷類抗生素和去污劑)、RaeE-RaeF-RopN(外排氨基糖苷類抗生素和去污劑)和RaeX-RaeY-RopM(外排重金屬離子)[7-9]。根據(jù)基因組注釋,RaeC-RaeA-RaeB包含一個(gè)自身調(diào)控子RaeR,組合成RaeR-RaeC-RaeA-RaeB,對(duì)應(yīng)于RA-LZ01基因組中的GE296_RS05175-GE296_RS05170-GE296_RS05165-GE296_RS05160。RaeR由GE296_RS05175基因編碼,讀碼框大小為615 bp,編碼204個(gè)氨基酸,蛋白大小約為22.44 ku。內(nèi)膜蛋白R(shí)aeB由GE296_RS05160基因編碼。

調(diào)控子可對(duì)RND外排泵的表達(dá)水平和功能發(fā)揮重要作用,目前對(duì)于RaeR對(duì)RaeC-RaeA-RaeB的調(diào)控作用還未見報(bào)道。本研究通過構(gòu)建RaeR和RaeB的缺失株及回復(fù)株,并對(duì)親本株RA-LZ01、缺失株和回復(fù)株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),測(cè)定菌株的生長(zhǎng)速率,研究RaeR對(duì)RaeC-RaeA-RaeB的調(diào)控作用,進(jìn)一步理解該外排泵的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號(hào):NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng);大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American type culture collection);大腸埃希菌X7213和自殺質(zhì)粒pRE112購(gòu)自NTCC國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心;穿梭質(zhì)粒pCPRA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)構(gòu)建;Trans-1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自美國(guó) BD difcoTM公司;LB肉湯、瓊脂粉和抗生素購(gòu)自北京Solarbio公司;2,6-二氨基更二酸(DPA)購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社;限制性內(nèi)切酶SacI、SphI、PstI,T4連接酶,質(zhì)粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司;細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司;0.22 μm無菌硝酸纖維素膜和過濾器購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司;SYBR qPCR Master Mix和HiScriptΙΙ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購(gòu)自南京Vazyme生物科技有限公司。

1.1.3 主要設(shè)備 臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司;PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自杭州博日科技公司;紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Backman 公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;搖床購(gòu)自上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物 本研究中所用的引物、序列、退火溫度及擴(kuò)增的目的DNA片段見表1,引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.2.2 構(gòu)建GE296_RS05160和GE296_RS05175基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR 首先由武漢金開瑞生物工程有限公司合成用于GE296_RS05160(編碼RaeB蛋白)和GE296_RS05175(編碼RaeR蛋白)基因缺失的打靶片段。GE296_RS05160基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp,ermF基因讀碼框801 bp,下游同源臂600 bp。GE296_RS05175基因的打靶片段包含上游同源臂600 bp,ermF基因讀碼框801 bp,下游同源臂586 bp。打靶片段上、下游同源臂兩端分別加上SacI和SphI酶切位點(diǎn)。用SacΙ和SphΙ酶將打靶片段克隆進(jìn)自殺質(zhì)粒pRE112,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌X7213細(xì)胞中。參照文獻(xiàn)[8-9]的方法,利用氯霉素抗性篩選供體菌,利用紅霉素和多黏菌素B抗性篩選缺失株。缺失株構(gòu)建具體流程詳見圖1。用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5160-F/5160-R對(duì)缺失株ΔRaeB進(jìn)行PCR鑒定;用引物OmpA-F/OmpA-R、Erm-F/Erm-R和5175-F/5175-R對(duì)缺失株ΔRaeR進(jìn)行PCR鑒定。

圖1 缺失株構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic representation of the deletion strain constructs

1.2.3 構(gòu)建回復(fù)株cΔRaeB和cΔRaeR 以親本株RA-LZ01株的基因組為模板,以引物5160-F/5160-R和5175-F/5175-R分別擴(kuò)增GE296_RS05160和GE296_RS05175基因,用PstΙ和SphΙ內(nèi)切酶將目的DNA片段分別克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pCPRA,得到回復(fù)重組質(zhì)粒,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)X7213菌株。參照文獻(xiàn)[8-9]的方法,用氨芐青霉素抗性篩選供體菌,用頭孢西丁抗性篩選回復(fù)株,并用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R,以及OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R引物對(duì)分別對(duì)回復(fù)株進(jìn)行PCR鑒定,得到的回復(fù)株分別命名為cΔRaeB和cΔRaeR。

1.2.4 測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線 將親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR分別增菌至OD600 nm約為1.0,以10倍系列稀釋至10-9,取10-7、10-8和10-9三個(gè)濃度梯度的菌液涂布TSA平板,每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù),計(jì)算每個(gè)菌株的菌落形成單位(CFU)。取108CFU·mL-1的菌種,接種至10 mL TSB中,將培養(yǎng)物以37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng),每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其OD600 nm值,共測(cè)定12 h。每個(gè)菌株做3組平行試驗(yàn)[9],利用GraphPad Prism 6.0軟件中的One-way ANOVA對(duì)每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 測(cè)定菌株MIC 參照文獻(xiàn)[10],將菌株增菌至OD600 nm約為1.0,通過微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株對(duì)抗生素的最小抑菌濃度(MIC),大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株?？股氐臐舛确秶鸀? 024～0.062 5 mg·L-1,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(培養(yǎng)基)和陽(yáng)性對(duì)照(菌液)。96孔板中每孔加入100 μL稀釋好的菌液(含有106CFU)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,在酶標(biāo)儀中測(cè)量其OD600 nm值,確定抗生素抑制菌株生長(zhǎng)的MIC。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 點(diǎn)板試驗(yàn) 依據(jù)菌株的MIC,選出抗生素,并確定其濃度。參照文獻(xiàn)[9],將經(jīng)121 ℃、20 min高壓的TSA培養(yǎng)基冷卻至40 ℃左右,加入選定的合適濃度的抗菌素,制備TSA平板。將新鮮菌液以1∶100比例重新轉(zhuǎn)接后,增菌至OD600 nm約 1.0,稀釋至10 CFU·mL-1,取106～10 CFU·mL-1的菌液,每個(gè)菌液樣本取5 μL進(jìn)行點(diǎn)板,將培養(yǎng)板在含5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 對(duì)親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR培養(yǎng)至OD600 nm約為1.0,培養(yǎng)過程中一份RA-LZ01菌液不添加SDS,另外一份RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR菌液添加4 mg·L-1的SDS。提取RA-LZ01和ΔRaeR的總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為模板備用。實(shí)時(shí)定量RT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s 預(yù)變性,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40次循環(huán)。以特異性引物GAPDH-F/GADPH-R、q5160-F/q5160-R和q5175-F/q5175-R分別擴(kuò)增GAPDH、GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的靶標(biāo)片段,其中GADPH基因作為內(nèi)參。通過2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量,并利用GraphPad Prism 6.0軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行差異性分析。*P<0.05表示差異顯著;**P<0.01、***P<0.001、****P<0.000 1,表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 基因缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的構(gòu)建

以菌液為模板,經(jīng)PCR鑒定,引物OmpA-F/OmpA-R擴(kuò)增出1 119 bp大小的目的條帶;引物Erm-F/Erm-R擴(kuò)增出801 bp大小的ermF基因,引物5160-UF/5160-DR擴(kuò)增到2 038 bp大小的DNA片段,經(jīng)測(cè)序確認(rèn)為打靶片段;引物5160-F/5160-R未擴(kuò)增到目的片段(圖2A)。以上結(jié)果說明菌株為鴨疫里默氏桿菌,并且ermF基因替換了GE296_RS05160基因,缺失株ΔRaeB構(gòu)建成功。對(duì)缺失株ΔRaeR的PCR鑒定結(jié)果顯示,引物OmpA-F/OmpA-R和Erm-F/Erm-R均擴(kuò)增到合適大小的目的條帶,5175-UF/5175-DR擴(kuò)增到2 026 bp大小的DNA片段,經(jīng)測(cè)序確認(rèn)為打靶片段;5175-F/5175-R未擴(kuò)增出目的片段(圖2B),說明ermF基因成功替換了GE296_RS05175基因,ΔRaeR菌株構(gòu)建成功。

A. 缺失株ΔRaeB的鑒定;B. 缺失株ΔRaeR的鑒定;M. DL2000 DNA Marker;1. OmpA-F/OmpA-R引物擴(kuò)增(1 119 bp);2. Erm-F/Erm-R引物擴(kuò)增(801 bp);3. 5160-UF/5160-DR(A,2 038 bp)和5175-UF/5175-DR(B,2 026 bp)引物擴(kuò)增;4. 5160-F/5160-R(A,3 156 bp)和5175-F/5175-R(B,615 bp)引物擴(kuò)增A. Identification of the deletion mutant ΔRaeB; B. Identification of the deletion mutant ΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with ErmF/ErmF primers (801 bp); 3. PCR amplification with 5160-UF/5160-DR primers (A, 2 038 bp) and 5175-UF/5175-DR primers (B, 2 026 bp); 4. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5 175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 圖2 缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的鑒定Fig.2 Identification of the deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR

2.2 回復(fù)株cΔRaeB和cΔRaeR的構(gòu)建

以菌液為模板,用引物OmpA-F/OmpA-R和5160-F/5160-R分別擴(kuò)增出1 119 bp和3 156 bp的目的片段(圖3A),說明回復(fù)株 cΔRaeB構(gòu)建成功。以引物OmpA-F/OmpA-R和5175-F/5175-R分別擴(kuò)增出1 119 bp和615 bp的目的片段,說明回復(fù)株cΔRaeR構(gòu)建成功(圖3B)。

A. 回復(fù)株cΔRaeB的鑒定;B. 回復(fù)株cΔRaeR的鑒定;M. DL2000 DNA Marker;1. OmpA-F/OmpA-R引物擴(kuò)增(1 119 bp);2. 5160-F/5160-R(A,3 156 bp)和5175-F/5175-R(B,615 bp)引物擴(kuò)增A. Identification of the complemented strain cΔRaeB; B. Identification of the complemented strain cΔRaeR; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. PCR amplification with OmpA-F/OmpA-R primers (1 119 bp); 2. PCR amplification with 5160-F/5160-R primers (A, 3 156 bp) and 5175-F/5175-R primers (B, 615 bp) 圖3 回復(fù)株cΔRaeB和cΔRaeR的鑒定Fig.3 Identification of the complemented strains cΔRaeB and cΔRaeR

2.3 菌株的生長(zhǎng)速率

為確定GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的缺失是否影響菌株的生長(zhǎng)速率,測(cè)定了親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h的OD600 nm值,每次測(cè)定間隔1 h。依據(jù)測(cè)定的OD600 nm值繪制了菌株的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明,與親本株RA-LZ01相比,缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的生長(zhǎng)速率沒有發(fā)生明顯變化,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明GE296_RS05160和GE296_RS05175基因?qū)甑纳L(zhǎng)無顯著影響(圖4)。

圖4 親本株RA-LZ01和缺失株ΔRaeB、ΔRaeR的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of parental strain RA-LZ01, deletion mutants ΔRaeB and ΔRaeR

2.4 MIC測(cè)定

測(cè)定了11類、27種抗菌素對(duì)親本株RA-LZ01、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR、回復(fù)株cΔRaeB和cΔRaeR的MIC值。結(jié)果表明,GE296_RS05160基因滅活后,僅氨基糖苷類的鏈霉素和卡那霉素以及去污劑類的SDS的MIC發(fā)生了改變,分別降低至1/2、1/2和1/8,并且回復(fù)株恢復(fù)到了和親本株相同的水平;而GE296_RS05175基因缺失后,菌株對(duì)鏈霉素、卡那霉素的MIC值無變化,而對(duì)SDS的MIC值增加了2倍。其他抗菌藥物的MIC值均無變化。具體結(jié)果如表2所示。

表2 抗菌藥物對(duì)鴨疫里默氏桿菌親本株、缺失株及回復(fù)株的MICsTable 2 MICs of antimicrobial agents to R. anatipestifer wild strain, deletion mutants and complemented strains mg·L-1

2.5 點(diǎn)板試驗(yàn)

MIC試驗(yàn)結(jié)果顯示,只有鏈霉素、卡那霉素和SDS對(duì)缺失株ΔRaeB和ΔRaeR的MIC發(fā)生改變,并且鏈霉素、卡那霉素只降至親本株的1/2,而SDS降至親本株的1/8。因此,選擇差異較大的SDS進(jìn)行點(diǎn)板試驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證GE296_RS05160基因在外排SDS中的作用及GE296_RS05175基因?qū)υ撏馀疟玫恼{(diào)控作用。結(jié)果顯示,在8 mg·L-1的SDS濃度下,與親本株RA-LZ01株相比,缺失株ΔRaeB對(duì)SDS的敏感性顯著升高,而缺失株ΔRaeR對(duì)SDS的敏感性有所降低,回復(fù)株cΔRaeB和cΔRaeR基本恢復(fù)了對(duì)SDS的耐受水平(圖5)。

圖5 菌株對(duì)SDS的敏感性Fig.5 Sensitivity of the strains to SDS

2.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR

對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行分析后,以親本株GE296_RS05160基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平為1,發(fā)現(xiàn)在添加4 mg·L-1的SDS后,親本株GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平升高至2.26,而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平升高至4.64(圖6)。與此結(jié)果相反,親本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分別下降至0.36和0.35(圖6)。

A. RA-LZ01和ΔRaeR菌株在SDS作用下GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平;B. RA-LZ01和ΔRaeB菌株在SDS作用下GE296_RS05175基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平;****P<0.000 1,差異極顯著A. The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 gene of RA-LZ01 and ΔRaeR strains treated with SDS; B. The relative transcriptional levels of GE296_RS05175 gene of RA-LZ01 and ΔRaeB strains treated with SDS;****P<0.000 1,the differences are highly significant圖6 GE296_RS05160和GE296_RS05175基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 The relative transcriptional levels of GE296_RS05160 and GE296_RS05175 genes

3 討 論

RND是一種在革蘭陰性菌中廣泛存在的外排泵,目前的研究已在多種細(xì)菌中鑒定到RND外排泵,研究的比較清晰、深入的包括大腸埃希菌、沙門菌和銅綠假單胞菌的RND外排泵,包括大腸埃希菌的AcrB、AcrD、AcrF、CusA等[11-14];沙門菌的AcrB、AcrD、AcrF等[15-17];銅綠假單胞菌的MexB、MexD、MexF、MexY等[18-21]。外排底物是RND外排泵的重要生物學(xué)功能,并且這些外排泵有非常廣泛的底物譜,包括多種抗菌素、重金屬離子、膽汁、腸桿菌素、游離脂肪酸、激素等。除了外排底物,RND外排泵還可發(fā)揮其他多種生物學(xué)功能,包括維持細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)、毒力、新陳代謝、生物膜形成等[11-21]。

鑒于RND外排泵的多種重要的生物學(xué)功能,其表達(dá)水平受到多種調(diào)控子的嚴(yán)格調(diào)控。如大腸埃希菌的經(jīng)典RND外排泵AcrAB-tolC,受到AcrR、MarA、MarB、MarC、SdiA等調(diào)控子的正向或負(fù)向調(diào)控[22];AcrD受到BaeSR和CpxAR雙組分系統(tǒng)的調(diào)控[23];AcrS和H-NS分別對(duì)AcrEF進(jìn)行負(fù)調(diào)控以及正調(diào)控[24]。對(duì)于沙門菌的RND外排泵,RamA、RamR、AcrR、MarA以及SoxS等調(diào)控子對(duì)AcrAB發(fā)揮調(diào)控作用[22];雙組分系統(tǒng)BaeSR和CpxAR調(diào)控AcrD的表達(dá)[23];AcrEF受到雙組分系統(tǒng)AcrS和H-NS的調(diào)控[25-26]。銅綠假單胞菌含有多個(gè)RND外排泵,鑒定到MexR、NalC、NalD、RocS1/S2-A2等二十多個(gè)調(diào)控因子和雙組分系統(tǒng)[6]。

目前對(duì)于鴨疫里默氏桿菌的RND外排泵研究的較少,只鑒定到3個(gè)RND外排泵系統(tǒng),包括外排氨基糖苷類抗生素和去污劑的RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN,外排重金屬離子的RaeX-RaeY-RopM,其中內(nèi)膜蛋白為RaeB、RaeF和RaeY,周質(zhì)膜融合蛋白為RaeA、RaeE和RaeX,外膜蛋白為RaeC、RopN和RopM[7-9]。目前研究?jī)H初步鑒定了上述外排泵的外排底物、與菌株生長(zhǎng)和毒力相關(guān)的生物學(xué)表型,對(duì)于調(diào)控其表達(dá)水平的調(diào)控子還未見報(bào)道。根據(jù)基因組注釋,RaeC-RaeA-RaeB有一個(gè)屬于TetR/AcrR家族的調(diào)控子RaeR,本研究對(duì)該調(diào)控子是否對(duì)RaeB發(fā)揮調(diào)控作用進(jìn)行了驗(yàn)證。

首先對(duì)菌株的生長(zhǎng)能力進(jìn)行了檢測(cè)。親本株、缺失株ΔRaeB和ΔRaeR在12 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線無明顯差異,說明RaeC-RaeA-RaeB外排泵與菌株的生長(zhǎng)能力無明顯相關(guān)性,也保證了缺失株ΔRaeB和ΔRaeR其他生物學(xué)表型的改變不是由生長(zhǎng)速率改變而引起。

前期研究表明,以RA CH-1作為親本株,RaeC-RaeA-RaeB可以外排氨基糖苷類的慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素,去污劑SDS和Triton X-100。本研究以RA-LZ01作為親本株,缺失株ΔRaeB僅對(duì)鏈霉素、卡那霉素和SDS的敏感性上升,并且鏈霉素和卡那霉素的MIC值只減小至1/2,SDS的MIC值減小至1/8。這種差異應(yīng)該是由于親本株不同引起的,不同的菌株有不同的耐藥表型。缺失株ΔRaeR與ΔRaeB相反,表現(xiàn)為對(duì)鏈霉素、卡那霉素和SDS的敏感性降低。點(diǎn)板試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種表型改變。這些結(jié)果說明RaeR對(duì)RaeB外排底物有負(fù)向調(diào)控作用。

對(duì)親本株和缺失株ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)。在添加SDS后,親本株GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平升高,而ΔRaeR的GE296_RS05160基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。進(jìn)一步對(duì)親本株和ΔRaeB的GE296_RS05175基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),當(dāng)受到SDS刺激時(shí),親本株和缺失株ΔRaeB中該基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降。這些結(jié)果表明,底物SDS促使GE296_RS05175基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),GE296_RS05175基因?qū)E296_RS05160基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

GE296_RS05160基因編碼的RaeB和GE296_RS05175基因編碼的RaeR與鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01株的生長(zhǎng)無明顯相關(guān)性;與菌株對(duì)鏈霉素、卡那霉素和SDS的耐受性相關(guān)。藥物敏感性試驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)結(jié)果表明,RaeR對(duì)RaeB的表達(dá)發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。