沈紅楓，查渭，金志江，夏海江，劉龍斌

紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院 紹興市立醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 紹興 312000

血管緊張素II（angiotensin II,Ang II）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensinaldosterone system,RAAS）重要的效應(yīng)分子之一，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，在生理?xiàng)l件下維持心血管系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能狀態(tài)中具有重要的作用[1]。在病理?xiàng)l件下，Ang II通過激活多條信號(hào)通路來參與血管內(nèi)膜增生、心肌肥大、心臟重塑等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，而使用血管緊張素受體抑制劑（如纈沙坦）能顯著延緩上述病理過程[2]。研究[3]顯示Ang II可以通過引發(fā)微血管通透性增加，從而參與多種心血管疾病的進(jìn)展，但是其破環(huán)微血管的具體機(jī)制目前尚未闡明。

血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性是維持正常血管通透性的基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在著許多緊密連接。這些緊密連接常圍繞細(xì)胞的頂端并呈連續(xù)帶狀，使相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接在一起，填充細(xì)胞間隙，形成一道天然的物理屏障，起著維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、選擇性通透等細(xì)胞基本功能的作用[4]。緊密連接相關(guān)跨膜蛋白（zonula occludens-1,ZO-1）是細(xì)胞間緊密連接的主要成分，其在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和分布對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的功能具有決定性的作用[5]。孫瑞等[6]發(fā)現(xiàn)通過微小RNA干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而調(diào)控其ZO-1蛋白的表達(dá)升高，能有效抑制缺氧導(dǎo)致的血管通透性增高。同時(shí)，有研究[7]表明雷公藤內(nèi)酯干預(yù)在增加ZO-1蛋白表達(dá)的同時(shí)可以提高結(jié)腸內(nèi)膜的緊密連接數(shù)量。本研究擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ang II對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)及分布的影響，以及血管內(nèi)皮鈣粘連蛋白（vascular endothelialcadherin,VE-cadherin）在其中的作用，以期探究Ang II破環(huán)微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 M199培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司；SYBR Green熒光染料試劑盒購自美國Roche公司；兔或鼠抗人ZO-1、VE-cadherin、β-actin多克隆抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購自美國ABCAM公司；脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen公司；蛋白質(zhì)印跡（Western blot）相關(guān)試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞通過I型膠原酶酶消化法分離獲得，并在含20%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)[8]。細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang II組、Ang II+纈沙坦組以驗(yàn)證Ang II對(duì)細(xì)胞通透性的影響。根據(jù)是否使用Ang II和VEcardherin過表達(dá)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，分別設(shè)置對(duì)照組、Ang II組和Ang II+VE-cadherin過表達(dá)組，并予以對(duì)應(yīng)干預(yù)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將內(nèi)皮細(xì)胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時(shí)，以脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染VEcadherin過表達(dá)質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒各100 pmol，24 h后提取總RNA/蛋白后，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）鑒定轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)：提取內(nèi)皮細(xì)胞中總RNA，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃、15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃、5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活，4 ℃保存。運(yùn)用SYBR Green法檢測(cè)ZO-1 mRNA、VE-cadherin mRNA的表達(dá)情況，反應(yīng)條件為：94 ℃、15 min預(yù)變性，94 ℃、30 s變性，60 ℃、30 s退火，72 ℃、30 s延伸，共循環(huán)40次。每組樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)量：提取各組細(xì)胞中的總蛋白，用BCA法定量蛋白，SDS-PAGE膠每孔加入20 μL的樣品，75 V、30 min進(jìn)行蛋白濃縮，110 V、2 h進(jìn)行蛋白電泳，并用孔徑0.45 μm的PVDF膜240 mA、90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h后，以1:1 000濃度加入兔（鼠）抗人ZO-1一抗（或抗VE-cadherin、β-actin一抗），4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（鼠）二抗孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Quantity One軟件分析。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ZO-1在細(xì)胞中的分布及表達(dá)：各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton X 100穿破細(xì)胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的ZO-1抗體，4 ℃過夜，PBST清洗3遍，加入結(jié)合有FICT的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用Image pro plus 6.0分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang II抑制內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)水平和細(xì)胞膜分布 相比于對(duì)照組，Ang II組ZO-1的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01），且ZO-1蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)趨勢(shì)減弱；與Ang II組比，Ang II+纈沙坦組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），且ZO-1蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)恢復(fù)，見圖1。

圖1 Ang II對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)及分布的影響

2.2 Ang II對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，Ang II組中VE-cadherin蛋白的表達(dá)減少（P＜0.01），VE-cadherin mRNA的表達(dá)也減少（P＜0.01）；相比于Ang II組，Ang II+纈沙坦組內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin表達(dá)增加（P＜0.01），見圖2。

圖2 Ang II抑制內(nèi)皮細(xì)胞中VE-cadherin的表達(dá)

2.3 VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)成功 脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)?；蛘呖召|(zhì)粒后，相比于空白對(duì)照組，空質(zhì)粒組和VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒組中都可以觀察到綠色熒光的質(zhì)粒，見圖3A。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組，VE-cadherin過表達(dá)組內(nèi)皮細(xì)胞中VEcadherin mRNA表達(dá)升高（P＜0.01），見圖3B。

圖3 VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功

2.4 VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)Ang II的作用與對(duì)照組比，Ang II組內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)降低（P＜0.01）；相比于Ang II組，Ang II+VE-cadherin過表達(dá)組內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1表達(dá)增加（P＜0.01），見圖4A；Ang II+VE-cadherin過表達(dá)組相較于Ang II組，細(xì)胞膜上ZO-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，見圖4B。

圖4 VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)Ang II的作用

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持正常血管通透性具有關(guān)鍵性作用，內(nèi)皮功能損傷是多種心血管疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，Ang II對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響越來越受到國內(nèi)外心血管系統(tǒng)研究者的關(guān)注。Ang II可通過刺激產(chǎn)生活性氧、促進(jìn)血栓形成、抑制一氧化氮產(chǎn)生以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等多種途徑促使細(xì)胞功能受損。研究[9-10]表明，Ang II可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合酶，誘導(dǎo)細(xì)胞中炎癥反應(yīng)等作用損傷內(nèi)皮細(xì)胞。最近又有研究[11-12]表明Ang II可以通過破環(huán)微血管通透性從而參與多種心血管疾病的進(jìn)展。

ZO蛋白包括3個(gè)異構(gòu)體ZO-1、ZO-2和ZO-3，三者以異聚體形式組成復(fù)合體，并通過與occludin、claudin和肌動(dòng)蛋白相連接，對(duì)維持緊密連接復(fù)合體（tight junction complex,TJC）完整性和功能發(fā)揮有著重要的作用。有研究[13]表明，不管是抑制ZO-1蛋白的表達(dá)還是干預(yù)ZO-1蛋白的關(guān)鍵氨基酸序列，都會(huì)增加上皮細(xì)胞通透性，提高藥物呈遞效率[13-14]。張冰等[15]發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白表達(dá)水平下降，而中藥復(fù)方制劑能逆轉(zhuǎn)ZO-1蛋白的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而起到保護(hù)腸道屏障的作用。在本研究中，Ang II不僅可以減少內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)，還可以使原先規(guī)則分布在細(xì)胞膜周圍的ZO-1分布變得紊亂，提示Ang II可破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，這可能是其引發(fā)微血管通透性增加的機(jī)制。

鈣粘連蛋白（cadherin）家族是一組介導(dǎo)同型細(xì)胞黏附的鈣依賴性I型跨膜糖蛋白，參與形成和維護(hù)正常細(xì)胞間的連接和極性，對(duì)干細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖也具有一定的調(diào)控作用[16]。VE-cadherin屬于經(jīng)典cadherin家族，主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞，是內(nèi)皮細(xì)胞所特有的cadherin，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞間的連接[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，VEcadherin除了介導(dǎo)細(xì)胞間連接之外，同時(shí)也具有傳導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)的作用。MAHALANOBISH等[19]研究發(fā)現(xiàn)，VE-cadherin參與了Ang II誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障損傷，而通過褪黑素上調(diào)VE-cadherin水平能有效拮抗Ang II以前的肺部水腫，減輕肺部毛細(xì)血管的細(xì)胞凋亡水平。此外，MüLLER等[20]研究發(fā)現(xiàn)，VEcadherin和claudin-5還能同時(shí)被miR-125a靶向抑制，從而引起巨噬細(xì)胞浸潤和局部血管炎癥水平增加。本研究發(fā)現(xiàn)，Ang II在抑制ZO-1表達(dá)的同時(shí)，也可以抑制細(xì)胞中VE-cadherin的表達(dá)，所以我們推測(cè)Ang II可能是通過下調(diào)VE-cadherin的表達(dá)從而發(fā)揮抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，我們構(gòu)建了VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)事先用VE-cadherin過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后，Ang II不能再抑制細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)。綜上所述，Ang II可通過下調(diào)VE-cadherin的表達(dá)從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1蛋白的表達(dá)，這可能是Ang II引發(fā)微血管通透性增加的分子機(jī)制。