鄭彭瑋，林桂涵，陳煒越，陳春妙，應(yīng)海峰，紀(jì)建松

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 放射科 浙江省影像診斷與介入微創(chuàng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 麗水 323000

喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率正逐年增加[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)LSCC病例約有18萬例，死亡近10萬例[2]。盡管近年來以手術(shù)為主的多模式治療策略在喉癌領(lǐng)域中取得了一定的進(jìn)展，但仍有相當(dāng)數(shù)量的患者生存時(shí)間短、預(yù)后差[3-4]。Ki-67 是細(xì)胞增殖階段的核抗原，可準(zhǔn)確反映腫瘤的增殖活性[5]。研究[6-7]證實(shí)，較高的Ki-67表達(dá)水平與LSCC的侵襲性行為及不良預(yù)后密切相關(guān)。在臨床上，Ki-67 的表達(dá)主要是基于活檢或手術(shù)組織的免疫組化（immunohistochemistry,IHC）分析來確定，存在有創(chuàng)、耗時(shí)等不足。此外，由于腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性和相對較小的活檢樣本，最終獲得的Ki-67結(jié)果可能無法代表整個(gè)腫瘤。因此，尋找一種無創(chuàng)、全面且準(zhǔn)確的檢查手段來評估LSCC患者的Ki-67表達(dá)水平具有重要意義。雙能量CT是一種新興的功能學(xué)成像技術(shù)，其不僅可以獲得常規(guī)的形態(tài)學(xué)信息，還能夠提供諸多與腫瘤生物學(xué)特性相關(guān)的定量參數(shù)[8]。近年來，雙能量CT已廣泛用于術(shù)前預(yù)測肺癌[9]、胃癌[10]和直腸癌[11]等疾病的Ki-67表達(dá)水平。然而，其在評估LSCC Ki-67表達(dá)水平方面的報(bào)道國內(nèi)外仍罕見。本研究旨在探討基于雙能量CT參數(shù)聯(lián)合臨床病理特征構(gòu)建的列線圖在術(shù)前預(yù)測LSCC患者Ki-67表達(dá)水平的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為LSCC并接受雙能量CT檢查的患者96例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過IHC檢測Ki-67表達(dá)水平，且結(jié)果明確；②雙能量CT檢查于術(shù)前2周內(nèi)完成；③腫瘤最大徑＞1.0 cm。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無完整臨床病理資料；②術(shù)前接受化療或放療的患者；③CT圖像質(zhì)量較差，如有明顯運(yùn)動(dòng)或金屬偽影。最初收集了174例LSCC患者，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)排除了78例患者（包括18例Ki-67結(jié)果不明確、13例術(shù)前2周內(nèi)無雙能量CT影像資料、15例腫瘤直徑≤1 cm、9例臨床病理資料不完整、17例術(shù)前接受化療或放療、6例CT圖像質(zhì)量較差），最終納入了96例患者進(jìn)行分析。按照7:3比例隨機(jī)分為訓(xùn)練集（n=67）和驗(yàn)證集（n=29）。收集所有患者的臨床病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤位置、臨床T分期、CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)和分化程度。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2023-96）。

1.2 檢查方法 所有檢查均在第三代雙源CT掃描儀（德國西門子公司）上進(jìn)行，掃描范圍從顱底到胸廓入口。先行常規(guī)平掃，掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流180 mAs。采用高壓注射器（德國歐利奇公司）注射碘對比劑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），濃度320 mgI/mL，注射速率為2.5～3.0 mL/s，總量按1.5 mL/kg計(jì)算。在注射對比劑后25 s和60 s分別采集動(dòng)脈期和靜脈期圖像[12]。增強(qiáng)開啟雙能量模式，掃描參數(shù)：A、B球管管電壓分別為80 kVp、Sn 150 kVp，管電流分別為118 mAs、69 mAs，準(zhǔn)直器128×0.6 mm，螺距為0.6，轉(zhuǎn)速0.5 s/r，重建層厚和間距均為1.5 mm。

1.3 圖像分析與處理 將所有重建的圖像傳送至PACS系統(tǒng)和Syngo via后處理工作站，由兩名分別具有7年和13年頭頸部影像診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師采用盲法進(jìn)行評估和測量。在PACS系統(tǒng)中，對腫瘤位置（聲門上區(qū)、聲門區(qū)或聲門下區(qū)）、臨床T分期（T1-T2或T3-T4）和CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)（陰性或陽性）進(jìn)行評估。臨床T分期參考2017年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer）第8版腫瘤分期系統(tǒng)。根據(jù)此前研究[13-14]，CT報(bào)告淋巴結(jié)陽性應(yīng)至少滿足以下標(biāo)準(zhǔn)之一：①淋巴結(jié)短徑＞10 mm；②強(qiáng)化不均勻，且有內(nèi)部壞死；③多個(gè)淋巴結(jié)聚集、融合；④邊界不清，周圍器官或血管受累。當(dāng)兩人意見存在分歧時(shí)，通過協(xié)商達(dá)成一致。在Syngo via后處理工作站中，獲取碘濃度（iodine concentration,IC）圖、有效原子序數(shù)（effective atomic number,Zeff）圖和能譜曲線。選擇在腫瘤顯示的最大層面上勾畫感興趣區(qū)（region of interest,ROI），且ROI范圍應(yīng)至少包含腫瘤最大面積的2/3。勾畫時(shí)應(yīng)避開囊變、壞死、血管和鈣化等。每個(gè)腫瘤測量3次取平均值，并盡量保持不同期相ROI的位置和大小一致。測量的雙能量CT參數(shù)包括：①標(biāo)準(zhǔn)化碘濃度（normalized iodine concentration,NIC），計(jì)算公式：NIC=IC腫瘤/IC頸動(dòng)脈；②標(biāo)準(zhǔn)化有效原子序數(shù)（normalized effective atomic number,nZeff），計(jì)算公式：nZeff=Zeff腫瘤/Zeff頸動(dòng)脈；③能譜曲線斜率（the slope of the spectral hounsfield unit curve,λHU），計(jì)算公式：λHU=（CT40keV-CT100keV）/60。取兩名醫(yī)師測量的平均值作為最終結(jié)果。

1.4 病理學(xué)分析 所有組織標(biāo)本均經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)脫水和石蠟包埋處理，制備成4 mm厚的切片。采用Ventana Benchmark Ultra自動(dòng)IHC平臺(tái)評估LSCC組織中Ki-67的表達(dá)水平。由兩名具有5 年以上病理診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行閱片，當(dāng)觀察到腫瘤內(nèi)細(xì)胞核呈棕色時(shí)則視其為陽性。隨機(jī)選擇10個(gè)典型的高倍視野（×200），計(jì)算其中Ki-67 陽性細(xì)胞所占的百分比。參考此前研究[7，15]，以45%作為界定標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ki-67低表達(dá)組（≤45%）和Ki-67高表達(dá)組（＞45%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS26.0和R軟件（版本4.1.2，https://www.r-project.org/）進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25,P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用單因素和多因素Logistic回歸分析確定影響LSCC患者Ki-67高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并建立列線圖模型。使用受試者工作特征（receiver operator characteristic,ROC）曲線下面積（area under the curve,AUC）、靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度評價(jià)模型的預(yù)測效能。采用Delong檢驗(yàn)比較不同模型之間AUC的差異。使用“rms”包進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣繪制校準(zhǔn)曲線，以Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)評價(jià)列線圖的穩(wěn)健性。使用“rmda”包進(jìn)行決策曲線分析（decision curve analysis,DCA），以評價(jià)列線圖的臨床實(shí)用性，并計(jì)算其在不同閾值概率下的凈效益。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床及病理特征比較 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，LSCC患者Ki-67高表達(dá)的概率分別為55.22%（37/67）和55.17%（16/29）。在訓(xùn)練集中，Ki-67高表達(dá)組和Ki-67低表達(dá)組間CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)和分化程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其余特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。在驗(yàn)證集中，CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)和分化程度在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其余特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表1 訓(xùn)練集中臨床及病理特征比較

表2 驗(yàn)證集中臨床及病理特征比較

2.2 雙能量CT參數(shù)比較 兩名醫(yī)師對雙能量CT參數(shù)測量的一致性均良好（組內(nèi)相關(guān)系數(shù)：0.821～0.914）。在訓(xùn)練集中，Ki-67高表達(dá)組的動(dòng)脈期NIC、λHU、nZeff及靜脈期NIC均高于Ki-67 低表達(dá)組（均P＜0.05），而靜脈期λHU和nZeff在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3和圖1。

表3 訓(xùn)練集中LSCC患者Ki-67高表達(dá)組和Ki-67低表達(dá)組雙能量CT參數(shù)比較[ M（P25，P75）]

2.3 危險(xiǎn)因素篩選及模型構(gòu)建 將兩組間P＜0.05 的臨床病理特征和雙能量CT參數(shù)納入多因素Logistic回歸分析中，分別建立臨床模型、雙能量CT模型以及二者聯(lián)合模型。臨床模型納入CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)和分化程度兩個(gè)特征；雙能量CT模型納入動(dòng)脈期NIC和動(dòng)脈期nZeff兩個(gè)參數(shù)；聯(lián)合模型納入上述四個(gè)指標(biāo)（見表4），并生成列線圖（見圖2）。通過各項(xiàng)指標(biāo)對應(yīng)得分相加計(jì)算出總分，總分所對應(yīng)的預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)值即為LSCC患者Ki-67高表達(dá)概率。

圖2 預(yù)測LSCC患者Ki-67高表達(dá)概率的列線圖

表4 臨床病理特征和雙能量CT參數(shù)的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 列線圖的評估及臨床價(jià)值 不同模型的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度見表5。在訓(xùn)練集中，臨床模型、雙能量CT模型和列線圖的AUC分別為0.809、0.882和0.939；在驗(yàn)證集中，臨床模型、雙能量CT模型和列線圖的AUC分別為0.752、0.834和0.875（見圖3A、圖3B）。DeLong檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集中，列線圖的AUC明顯高于臨床模型（Z=2.758，P=0.006），而與雙能量CT模型之間比較無明顯差異（Z=1.823，P=0.068）。在驗(yàn)證集中，列線圖的AUC與臨床模型、雙能量CT模型之間比較均無明顯差異（Z=1.573、0.767，均P＞0.05）。訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的校正曲線均接近理想線，表明列線圖對Ki-67 表達(dá)水平的預(yù)測與實(shí)際結(jié)果擬合度較高（見圖3C、圖3D）。DCA顯示，當(dāng)訓(xùn)練集中閾值概率為0.03～1.0 和0.52～0.83、驗(yàn)證集中閾值概率為0.33～1.0 和0.34～0.76 時(shí)，列線圖模型的凈獲益優(yōu)于臨床模型和雙能量CT模型。提示該列線圖在預(yù)測LSCC患者Ki-67表達(dá)水平方面具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值（見圖3E、圖3F）。

圖3 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中列線圖的ROC曲線、校準(zhǔn)曲線、DCA

表5 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中不同模型預(yù)測效能的比較

3 討論

術(shù)前無創(chuàng)識(shí)別LSCC患者的Ki-67表達(dá)水平對于其最佳治療方案選擇和預(yù)后評估具有重要的臨床意義。在本研究中，筆者基于雙能量CT參數(shù)（動(dòng)脈期NIC和動(dòng)脈期nZeff）和臨床病理特征（CT報(bào)告淋巴結(jié)狀態(tài)和分化程度）構(gòu)建了一種可視化的列線圖模型，用于預(yù)測LSCC患者的Ki-67表達(dá)水平。ROC曲線分析顯示，該列線圖在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中均表現(xiàn)出較高的預(yù)測性能，AUC分別為0.939和0.875，優(yōu)于單一的臨床模型或雙能量CT模型。此外，校準(zhǔn)曲線和DCA表明，列線圖具有良好的穩(wěn)健性和臨床實(shí)用性。

Ki-67 是反映細(xì)胞增殖的特異性指標(biāo)，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。此前已有研究探討了臨床病理特征與LSCC患者Ki-67表達(dá)水平之間的相關(guān)性。于學(xué)文等[16]發(fā)現(xiàn)隨著Ki-67增殖指數(shù)的增加，LSCC患者頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)將顯著升高。另一項(xiàng)關(guān)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的研究[17]指出，Ki-67 表達(dá)水平的高低與腫瘤分化程度密切相關(guān)。與上述研究相似，在本研究中，Ki-67 高表達(dá)組LSCC患者同樣更容易觀察到CT報(bào)告的淋巴結(jié)陽性（OR=3.555）和更低的分化程度（OR=10.219）。然而，臨床T分期與Ki-67表達(dá)水平之間的關(guān)系仍存在爭議。張曉靜等[18]證實(shí)T1-T2期LSCC的Ki-67增殖指數(shù)明顯低于T3-T4期LSCC。然而，在本研究中不同Ki-67表達(dá)組間LSCC的臨床T分期并無顯著差異，這與RODRIGUES等[19]的結(jié)果一致。推測可能是腫瘤分期系統(tǒng)主要依賴于解剖學(xué)信息，忽略了腫瘤在生物學(xué)和病理生理學(xué)方面的異質(zhì)性。進(jìn)一步將上述特征納入多因素Logistic回歸分析中，建立臨床模型。結(jié)果顯示，該模型對LSCC患者Ki-67表達(dá)水平的預(yù)測效能一般，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中的AUC分別為0.809、0.752。這表明僅依賴常規(guī)特征可能難以有效鑒別Ki-67 表達(dá)水平，有必要尋找另一種更加準(zhǔn)確的方式來彌補(bǔ)上述不足。

細(xì)胞增殖是腫瘤內(nèi)部微血管生成和血流供應(yīng)驅(qū)動(dòng)的發(fā)展過程。此前MARCON等[20]證實(shí)雙能量CT參數(shù)中的IC與微血管密度呈正相關(guān)，表明IC可作為一種間接反映腫瘤血流灌注的量化指標(biāo)。然而，在臨床實(shí)踐中，IC的測量可能受到多種因素的影響，如心輸出量、對比劑濃度等。因此，本研究引入了NIC，作為IC的校正結(jié)果，它可更加準(zhǔn)確地反映腫瘤對碘的攝取能力。研究結(jié)果顯示，Ki-67 高表達(dá)組LSCC的動(dòng)脈期和靜脈期NIC均高于Ki-67低表達(dá)組，這與既往研究結(jié)果[8-11]一致。分析可能是惡性腫瘤具有相似的生物學(xué)和病理生理學(xué)特征，即持續(xù)的細(xì)胞高增殖水平促進(jìn)了更多的新生血管生成。而在不同期相NIC的比較中，筆者發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈期NIC在預(yù)測Ki-67表達(dá)水平方面具有更高的價(jià)值。這可能因?yàn)轭^頸部腫瘤通常呈現(xiàn)出速升平臺(tái)型的強(qiáng)化特點(diǎn)[21]，即在注射對比劑后的20～30 s，腫瘤內(nèi)部血流灌注的差異最為顯著。此外，動(dòng)脈期nZeff是預(yù)測Ki-67表達(dá)水平的另一個(gè)重要指標(biāo)。既往研究[22]指出，腫瘤內(nèi)部細(xì)胞密度越高，nZeff將越高。在本研究中，與Ki-67低表達(dá)組LSCC相比，Ki-67高表達(dá)組具有更高的nZeff。推測原因可能是隨著Ki-67增殖指數(shù)的增加，腫瘤組織中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的比例以及大分子蛋白質(zhì)的含量也隨之提高，從而導(dǎo)致細(xì)胞密度增加[9]。最近一項(xiàng)研究[23]顯示，Ki-67 高表達(dá)組頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的ADC值低于Ki-67低表達(dá)組（P=0.036）。而ADC值通常用于量化水分子在組織中的擴(kuò)散能力，與組織中的細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。因此，這一觀點(diǎn)也間接驗(yàn)證了本研究的結(jié)論。

本研究存在一些局限性：首先，這是一項(xiàng)單中心、小樣本的回顧性研究，未來需要通過來自多個(gè)中心的更大隊(duì)列以及前瞻性研究來驗(yàn)證；其次，為了降低測量誤差，筆者排除了小于1 cm的LSCC；第三，盡管已在腫瘤最大層面勾畫ROI，但仍可能無法與病理切片選擇的組織匹配。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)基于雙能量CT參數(shù)和臨床病理特征構(gòu)建的列線圖能夠準(zhǔn)確區(qū)分LSCC患者的Ki-67表達(dá)水平，可為術(shù)前實(shí)現(xiàn)個(gè)體化、精準(zhǔn)化醫(yī)療決策提供重要的參考依據(jù)。