黃義星，鄭鎮(zhèn)譽，徐國潮，鄒盛濤

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027

現(xiàn)代骨科學的創(chuàng)立與進步，離不開金屬內(nèi)植入物的參與。但是骨內(nèi)植入物引發(fā)的相關感染讓廣大臨床醫(yī)護人員感到非常棘手。四肢骨折手術后的相關感染發(fā)生率為5%～15%，脊柱手術后的相關感染發(fā)生率也高達2%～5%[1]。感染一旦發(fā)生，處理非常麻煩，局部應用抗生素也成為越來越多臨床醫(yī)師的首選方法[2]。骨內(nèi)植入物表面抗菌涂層設計是在不改變骨內(nèi)植入物基本結構和力學性能的前提下，賦予其緩釋抗生素的功能[3]。且研究人員目前在響應性藥物緩釋方面取得了一定的進展，包括酶、pH、光、熱和溫度響應等[4-5]。相關研究顯示，骨內(nèi)植入物相關感染的發(fā)生主要與金黃色葡萄球菌相關，而其感染與繁殖會大量釋放透明質(zhì)酸酶、鏈激酶和血漿凝固酶等[6]。本研究期望用細菌感染后產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶自動降解抗菌涂層中的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA），從而促成抗生素的釋放，實現(xiàn)涂層的智能響應性緩釋效果。

1 材料和方法

1.1 材料 蒙脫土（montmorillonite,MMT）購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；透明質(zhì)酸和萬古霉素（vancomycin,VA）購自西安普瑞斯生物工程有限公司；原子力顯微鏡（FM-NanoviewRa-AFM）購自蘇州飛時曼精密儀器有限公司；掃描電鏡（SEM3300）購自北京大束科技有限責任公司；金黃色葡萄球菌購自上海撫生實業(yè)有限公司；鬼筆環(huán)肽和DAPI購自北京索萊寶科技有限公司；克氏針購自東莞市聯(lián)順精密金屬材料有限公司；橢圓偏振光譜儀（UVISEL Plus）購自蘇州上器試驗設備有限公司；共聚焦顯微鏡（LSM900）購自北京普瑞賽司儀器有限公司；核酸蛋白檢測儀（HD-2000）購自深圳三莉科技有限公司；MC3T3細胞購自上海通派生物科技有限公司；TNF-α ELISA試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、鉀離子檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；硅片購自蘇州晶矽電子科技有限公司；涂菌棒購自北京龍谷天成科技發(fā)展有限公司；透明質(zhì)酸酶購自上海弘順生物科技有限公司；生化培養(yǎng)箱（LRH-250）購自上海瑞穩(wěn)儀器設備廠；SD大鼠購自南京君科生物工程有限公司[SCXK（滬）2018-0006]。

1.2 方法

1.2.1 聚合物抗菌涂層的制備：0.5 g MMT溶解于200 mL去離子水中，獲得濃度為2.5 mg/mL，放置在磁力攪拌器上（60 r/min）攪拌24 h后，在4 ℃冰箱中靜置1周。同樣方法配置HA溶液，濃度為2 mg/mL。進一步在HA溶液中加入VA，獲得HA-VA（透明質(zhì)酸-萬古霉素）終濃度為1 mg/mL。按照實驗設計要求準備組裝基材，如克氏針、硅片、對聚二甲基硅氧烷（PDMS）等；并依次在去離子水、無水乙醇、去離子水中超聲處理20 min，烘干，放置在4 ℃冰箱中。在組裝開始之前，將所有預配溶液超聲過夜。依次將組裝基材浸泡在MMT和HA-VA溶液中30 min，每次從溶液中取出后均先在氮氣下吹干，然后再次浸入下一步溶液中，以此記為一組裝雙層。重復上述組裝步驟，獲得最終所需的蒙脫土/透明質(zhì)酸-萬古霉素5[（MMT/HA-VA）5]多層膜聚合物抗菌涂層。

1.2.2 聚合物抗菌涂層的材料學表征：在聚合物多層膜涂層的組裝過程中，通過原子力顯微鏡跟蹤了涂層表面粗糙度的變化情況，并記錄粗糙度的具體數(shù)值。

1.2.3 聚合物抗菌涂層的細菌響應和酶響應性緩釋行為的檢測：以硅片為組裝基材，在硅片表面構建（MMT/HA-VA）5多層膜涂層。在24孔板中分別加入2 mL PBS、104CFU/mL金黃色葡萄球菌溶液、106CFU/mL金黃色葡萄球菌溶液、100 U/mL透明質(zhì)酸酶溶液（HAS）和160 U/mL HAS。將表面負載（MMT/HA-VA）5多層膜涂層的硅片同時放入上述孔中，保證溶液可以完全浸沒過硅片，并將制備完畢的（MMT/HA-VA）5多層膜涂層作為（MMT/HA-VA）5組，不與細菌或酶接觸。繼續(xù)將24 孔板放置在細菌培養(yǎng)箱（37 ℃）中孵育48 h。待達到規(guī)定孵育時間后，同時取出所有硅片，使用氮氣進行完全吹干，使用掃描電鏡觀察各組多層膜涂層在共培養(yǎng)后表面形貌的變化情況。抑菌環(huán)實驗：制備瓊脂板，對金黃色葡萄球菌進行擴增，用移液槍吸取100 μL濃度為108CFU/mL的金黃色葡萄球菌，采用涂菌棒涂抹均勻，將硅片放置在瓊脂板中央，置于細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，隔日測量抑菌環(huán)直徑。利用橢圓偏振光譜儀，通過光譜橢圓偏振法測量各組多層膜涂層的厚度。

1.2.4 聚合物抗菌涂層的抗菌性能測試：細菌內(nèi)部存在豐富的堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質(zhì)和核酸，并且保持穩(wěn)定狀態(tài)以保證細菌的生命支持。當細菌的細胞壁完整性受到破壞后，以上細胞內(nèi)容物會被釋放到胞外。故可以通過檢測細菌胞外堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質(zhì)和核酸含量的多少來評價細菌的活性，進一步反映聚合物抗菌涂層的抗菌性能。以體積為1 cm3的PDMS為組裝基材，在其表面構建（MMT/HA-VA）5多層膜聚合物涂層，表面未經(jīng)任何修飾的空白PDMS作為空白組。將2組PDMS先經(jīng)紫外滅菌24 h，然后放置入15 mL離心管中。取對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，采用0.9%氯化鈉溶液稀釋至細菌濃度為1×106CFU/mL。在每個離心管中加入5 mL上述濃度金黃色葡萄球菌。將上述混合菌液放置在細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）。在第4 h、12 h和24 h提取菌液，5 000 r/min離心15 min，吸取上清液，使用堿性磷酸酶試劑盒按說明書操作步驟測上清液吸光度值（405 nm）。同時使用鉀離子檢測試劑盒，繼續(xù)測定吸光度值（450 nm）。實驗通過檢測共培養(yǎng)菌液中蛋白質(zhì)和核酸的含量變化來評估金黃色葡萄球菌生物膜通透性的改變。金黃色葡萄球菌混合菌液配置參數(shù)同上，在4、12和24 h分別提取菌液，離心機5 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清液，使用核酸蛋白檢測儀在波長280 nm（蛋白質(zhì)）處和260 nm（核酸）處檢測吸光度值。

1.2.5 聚合物抗菌涂層的細胞相容性檢測：制備聚合物抗菌涂層的提取液。實驗所需提取液應按照固體表面積與浸提液體積的比例為0.2 g/mL的原則進行提取。按照上述原則，以0.9%氯化鈉溶液為浸提液，獲得（MMT/HA-VA）5多層膜涂層提取液。使用24孔板培養(yǎng)細胞，單孔接種約5.0×104個小鼠前成骨細胞（MC3T3細胞），（MMT/HA-VA）5組加入200 μL上述獲得的提取液，空白組加入等量含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，多聚甲醛固定0.5 h，再次使用PBS清洗3次，進行鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）染色和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并采用計算機內(nèi)置軟件導出兩種染色合成圖。

1.2.6 聚合物抗菌涂層體內(nèi)實驗：以在SD大鼠脛骨內(nèi)插入髓內(nèi)針的模式構建大鼠骨內(nèi)植入物相關感染模型，本研究已通過溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準。分為3組：感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組。感染組在大鼠脛骨隧道內(nèi)注射5 μL金黃色葡萄球菌菌液（104CFU/mL）并植入未經(jīng)修飾的克氏針。（MMT/HA-VA）5組同樣注射等量等濃度的金黃色葡萄球菌，但植入表面經(jīng)（MMT/HA-VA）5多層膜聚合物涂層修飾的克氏針?？瞻捉M不注射細菌，但是植入未經(jīng)修飾的克氏針。動物造模結束后，飼養(yǎng)8周處死；分別在第1、2、4、6、8周從大鼠尾靜脈抽取血液，根據(jù)ELISA法跟蹤大鼠體內(nèi)炎癥因子（TNF-α）的變化趨勢。處死大鼠后，立即從脛骨隧道內(nèi)取出克氏針放置在瓊脂涂板上培養(yǎng)，并將大鼠骨組織脫鈣進行組織學分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 聚合物抗菌涂層的材料學表征 原子力顯微鏡檢測見涂層表面具有粗糙結構，起伏有致，凹凸不平。視覺上直觀的感覺就是組裝粒子聚集程度高的區(qū)域形成山峰，亮度大，而組裝粒子聚集程度低的區(qū)域形成山谷，亮度小，見圖1。隨著組裝過程的進行，復合物材料表面的表面粗糙度呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。當組裝完畢一雙層之后，涂層表面的粗糙度為（383.67±5.44）nm。組裝獲得（MMT/HA-VA）3多層膜涂層結構，其表面粗糙度為（425.33±10.78）nm。最終獲得目標涂層（MMT/HAVA）5，測試得其表面粗糙度為（576.33±8.96）nm，見圖2。（MMT/HA-VA）5和（MMT/HA-VA）1相比，表面粗糙度有所增加（P＜0.05）。

圖1 組裝過程中多層膜材料表面粗糙度3D圖

圖2 組裝過程中多層膜材料表面粗糙度數(shù)值變化

2.2 聚合物抗菌涂層的細菌響應和酶響應性緩釋行為的檢測 掃描電鏡見制備完畢的（MMT/HA-VA）5多層膜結構表面覆蓋均勻，涂層比較致密緊實。經(jīng)過PBS浸泡之后，其表面未發(fā)生明顯變化，顯示出比較優(yōu)異的穩(wěn)定性。但在與細菌或者酶接觸后，涂層表面發(fā)生不同程度的崩解剝落，但依然有部分結構殘留在涂層表面，而且隨著細菌或酶濃度的增加，涂層表面的崩解程度也在明顯增加，殘留結構進一步減少，見圖3。104CFU/mL金黃色葡萄球菌組、106CFU/mL金黃色葡萄球菌組、100 U/mL HAS組和160 U/mL HAS組與（MMT/HA-VA）5組比，形成的抑菌環(huán)的大小和表面涂層的厚度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖3 （MMT/HA-VA）5多層膜涂層與各組接觸后涂層表面掃描電鏡圖

圖4 （MMT/HA-VA）5組、PBS組、104 CFU/mL金黃色葡萄球菌組、106 CFU/mL金黃色葡萄球菌組、100 U/mL HAS組、160 U/mL HAS組形成的抑菌環(huán)的大小和表面涂層的厚度

2.3 聚合物抗菌涂層的抗菌性能測試 隨著時間的增加，空白組和（MMT/HA-VA）5組的胞外堿性磷酸酶、鉀離子、蛋白質(zhì)和核酸含量均表現(xiàn)出增加的趨勢；（MMT/HA-VA）5組所檢測的上述細菌內(nèi)容物含量都高于空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5-8。

圖5 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)4、12、24 h后胞外堿性磷酸酶含量

圖6 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)4、12、24 h后胞外鉀離子含量

圖7 （MMT/HA-VA）5組和空白組分別與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)4、12、24 h后胞外蛋白質(zhì)含量

2.4 聚合物抗菌涂層的細胞相容性檢測 共聚焦顯微鏡可見骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞核被染成藍色，而細胞質(zhì)內(nèi)的肌動蛋白絲則被鬼筆環(huán)肽染成紅色。2組細胞的伸展狀態(tài)均比較充分，沒有明顯差異。2組細胞骨架中的肌動蛋白微絲在數(shù)量和分布密度方面對比也比較類似。提示（MMT/HA-VA）5多層膜涂層具有良好的細胞相容性，浸提液安全可靠，對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞沒有明顯的不良反應和不良干擾，見圖9。

圖9 空白組和（MMT/HA-VA）5組與MC3T3細胞共培養(yǎng)后Phalloidin染色、DAPI染色和兩種染色合成圖（×100）

2.5 聚合物抗菌涂層體內(nèi)實驗 感染組在最初的6周內(nèi)，炎癥因子急劇升高，之后一直穩(wěn)定在較高水平，證明該感染模型設計合理；空白組的TNF-α水平始終維持在正常水平，未發(fā)生感染，提示該操作人員的實驗技術、動物管理過關；對于植入表面負載（MMT/HA-VA）5多層膜涂層克氏針的大鼠，在髓腔內(nèi)注射有較高濃度的菌液，但檢測其炎癥因子依然穩(wěn)定在正常水平以內(nèi)；感染組和空白組間TNF-α水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明該骨內(nèi)植入物相關感染模型造模成功；感染組和（MMT/HA-VA）5組間TNF-α水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明（MMT/HA-VA）5涂層具有優(yōu)異的抗感染功能；而（MMT/HA-VA）5組和空白組間TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明含涂層克氏針植入大鼠體內(nèi)后未引起額外的炎癥反應。見圖10。在感染組中的克氏針表面檢測出細菌，而（MMT/HA-VA）5組中未能檢測到，見圖11?？瞻捉M代表正常骨組織的結構形態(tài)，感染組中由于細菌大量繁殖，出現(xiàn)大量炎癥細胞，（MMT/HA-VA）5組中沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細胞，骨小梁結構清晰，見圖12。

圖10 大鼠模型術后各組TNF-α水平檢測

圖11 感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組克氏針表面細菌培養(yǎng)（光鏡，×4）

圖12 感染組、（MMT/HA-VA）5組和空白組骨組織HE染色結果（×200）

3 討論

在醫(yī)學技術飛速發(fā)展的今天，骨內(nèi)植入物材料是骨科最常見和最重要的手術耗材，但是由其引發(fā)的相關感染問題卻嚴重困擾著廣大臨床醫(yī)師。近年來，據(jù)相關文獻報道，骨折內(nèi)固定手術后骨感染總體發(fā)生率為0.4%～16.1%，其中閉合性骨折手術之后感染發(fā)生率為0.4%～2.0%，而開放性骨折手術后感染發(fā)生率為1.0%～55.0%，并且骨折情況越嚴重，手術后相關感染發(fā)生率越高[7]。感染發(fā)生后，如果不能有效及時處理，將會導致骨髓炎或者骨壞死的發(fā)生[8]。究其主要原因是常見的引起感染的細菌，如金黃色葡萄球菌，對各種骨科內(nèi)植入物材料具有很強的親和力，非常容易黏附在材料表面上[9]。其次人體受到骨折等創(chuàng)傷后，機體局部免疫系統(tǒng)受損也會促使細菌增殖并進一步形成難以根除的細菌生物膜[10]?，F(xiàn)階段臨床醫(yī)師對骨內(nèi)植入物相關感染采取的治療策略主要集中在早期清創(chuàng)和全身應用大劑量抗生素治療這兩個方面[11]。然而從細菌感染的進展過程來看，患者一旦需要清創(chuàng)，說明細菌已經(jīng)在骨內(nèi)植入物周圍繁殖增長了一段時間，而全身應用大劑量抗生素會對患者的正常組織和臟器產(chǎn)生不良反應[12]。

針對以上問題，研究人員將目光鎖定在骨內(nèi)植入物的表面涂層研發(fā)上，希望能在第一時間殺滅黏附在骨內(nèi)植入物表面的細菌，從而在病情發(fā)生發(fā)展的起點進行有效干預[13]。這樣既可以保證骨內(nèi)植入物內(nèi)固定的力學作用，也能預防或者治療內(nèi)植入物相關感染，并且減少了全身應用抗生素的不良反應。為此，研究人員和臨床醫(yī)師做出了巨大的研究和努力，并取得了一定的成果。例如：BRAEM等[14]在鈦金屬表面構建介孔二氧化硅（SiO2）擴散屏障，可以有效實現(xiàn)金屬表面釋放抗生素。MCMANAMON等[15]采用超聲噴涂技術將慶大霉素負載到鈦金屬表面，并繼續(xù)涂覆聚乳酸。RADIN等[16]以萬古霉素、硅酸乙酯、乙醇、鹽酸和去離子水為原料，利用浸泡法成功在骨內(nèi)植入物表面構建水凝膠-萬古霉素涂層。盡管上述骨內(nèi)植入物表面的抗菌涂層都具備優(yōu)異的抗感染性能，但是研究人員還是從中發(fā)現(xiàn)一部分問題，其中最重要的問題是，上述設計的藥物緩釋行為不可調(diào)控，即在內(nèi)植入物植入生物體內(nèi)的起始階段基本都存在藥物的“暴釋”現(xiàn)象，難以實現(xiàn)長效的緩釋和按需緩釋[17]。而長效的藥物緩釋和按需緩釋效果恰恰是預防和治療骨內(nèi)植入物相關感染的最理想要求。研究人員希望骨內(nèi)植入物表面抗菌涂層的藥物釋放行為能夠實現(xiàn)適量可控，在保證殺滅細菌的同時盡量減少不良反應[18]。HAS是一種線性大分子酸性黏多糖，在人體內(nèi)廣泛分布，具有調(diào)控細胞增殖分化，潤滑關節(jié)腔，保護軟骨、促進創(chuàng)傷修復等重要生理作用[19]。MMT別名膠嶺石，由于特殊的結構構造，具有很強的吸附能力，廣泛用作醫(yī)用材料的載體[20]。VA主要通過干擾細胞壁中肽聚糖的合成，從而達到抑菌效果，在實際臨床應用中主要用于骨內(nèi)植入物相關感染的治療[21]。筆者認為，本研究所制備的（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具備以下優(yōu)點。在體外實驗中，該抗菌涂層具備顯著的細菌濃度依賴性特點，可以根據(jù)細菌釋放的HAS按需釋放抗生素。這將在臨床上具備實際的應用意義，即在沒有細菌感染發(fā)生的情況下，抗生素可以比較穩(wěn)定的“儲存”在（MMT/HA-VA）5復合物多層膜結構中，一旦發(fā)生細菌感染，其釋放的HAS將會觸發(fā)抗菌涂層發(fā)生崩解，該緩釋特點不僅可以根據(jù)細菌感染發(fā)生的嚴重程度可調(diào)控地釋放抗生素，同時可以延長抗菌涂層的有效作用時間，我們認為該涂層在一定程度上可以實現(xiàn)基本的“智能”化藥物緩釋?；谝陨象w外抗菌特點，本研究經(jīng)過進一步探索，證實（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具有高效的殺菌能力和可靠的生物安全性。在大鼠在體實驗中進一步發(fā)現(xiàn)，該抗菌涂層依然表現(xiàn)穩(wěn)定，抗感染效果顯著。

綜上所述，本研究制備的（MMT/HA-VA）5復合物多層膜涂層具有良好的生物安全性和高效的體內(nèi)體外殺菌效果。并能夠根據(jù)感染的嚴重程度，自動調(diào)控抗生素緩釋的劑量，在有效保證殺滅細菌的前提下，盡可能減少不良反應并延長抗菌涂層的有效作用時間，是一種相對理想的骨內(nèi)植入物表面抗感染涂層，對解決臨床相關問題具有潛在的應用價值。