李思萍，韓金育，胡迪，王雅杰，于曉波

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院（信息與工程學(xué)院），浙江 溫州 325035；2.國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京（鳳凰中心）北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100015；4.旦生（北京）醫(yī)學(xué)科技有限責(zé)任公司，北京 102206

肝癌是高度致命的惡性腫瘤之一[1]，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌。當(dāng)前，常用于肝癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）雖被廣泛應(yīng)用，但應(yīng)用存在局限性[2-3]。肝癌相關(guān)指南建議對(duì)AFP陰性人群可以增加檢測(cè)異常凝血酶原（desγ-carboxy-prothrombin,DCP）、甲胎蛋白異質(zhì)體3（alpha-fetoprotein lens culinaris agglutinin 3,AFP-L3）、miRNA（microRNA）檢測(cè)試劑盒和GALAD模型等，從而提高肝癌檢出率，但可能由于靈敏度或特異度有限、檢測(cè)成本高等原因，仍未廣泛應(yīng)用于臨床，迫切需要探索新型有效標(biāo)志物來提供肝癌相關(guān)腫瘤信息。受體酪氨酸激酶AXL、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（cartilage oligomeric matrix protein,COMP）、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是近年來分別被發(fā)現(xiàn)，并經(jīng)臨床樣本驗(yàn)證的新型肝癌標(biāo)志物，聯(lián)合AFP檢測(cè)可以提高肝癌診斷性能[4-6]。但多數(shù)研究只是針對(duì)其中一種標(biāo)志物與AFP聯(lián)合檢測(cè)，以上三項(xiàng)標(biāo)志物與AFP結(jié)合對(duì)肝癌的診斷價(jià)值鮮見報(bào)道。以往這幾種標(biāo)志物的檢測(cè)多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）[7-9]，但ELISA樣本用量大、操作繁瑣且不能實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。流式熒光技術(shù)利用不同熒光編碼微球?qū)崿F(xiàn)單次實(shí)驗(yàn)多項(xiàng)標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快、標(biāo)志物組合靈活等優(yōu)勢(shì)[10-11]，可以節(jié)約試劑用量和人力成本。本研究基于流式熒光技術(shù)建立多重肝癌標(biāo)志物檢測(cè)方法，并進(jìn)行檢測(cè)性能分析，篩選肝癌血清樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證并初步探討四項(xiàng)標(biāo)志物對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本：標(biāo)本取自2019年6月至2022年1月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院被診斷為HCC的患者及同期體檢的健康對(duì)照者。訓(xùn)練隊(duì)列有30例健康對(duì)照者（男/女：21/9，年齡21～83歲）和30例HCC患者（男/女：23/7，年齡35～75歲）。驗(yàn)證隊(duì)列有20例健康對(duì)照者（男/女：13/7，年齡25～84歲）和20例HCC患者（男/女：15/5，年齡32～66歲）。

HCC組納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均為新診斷且未接受過治療。HCC組排除標(biāo)準(zhǔn)：血清采集前接受過抗癌治療的患者和有其他腫瘤病史的患者。健康對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①肝臟生化指標(biāo)正常且肝炎病毒血清學(xué)陰性；②無肝臟和胃腸道疾病及惡性腫瘤病史。所有血清樣品在冰上解凍，渦旋5～10 s，在4 ℃條件下1 500×g離心10 min，將上清液分裝后用于檢測(cè)，剩余樣本-80 ℃保存。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（編號(hào)：DTECKT2022-006-01），同時(shí)簽署了免知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器：人AXL、COMP、OPN標(biāo)準(zhǔn)品及抗體對(duì)購自美國R&D systems公司，人AFP標(biāo)準(zhǔn)品及抗體對(duì)購自杭州博岳生物技術(shù)有限公司，2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）水合物購自美國Sigma-Aldrich公司，1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）購自北京索萊寶科技有限公司，N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）、鏈霉親和素-藻紅蛋白（SA-PE）購自美國Thermo Scientific公司，EasyMagPlex磁性熒光編碼微球、流式細(xì)胞儀、磁力板均購自深圳唯公科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本檢測(cè)：磁性熒光微球成功連接捕獲抗體后，向反應(yīng)板每孔內(nèi)分別加入50 μL微球懸液和50 μL血清稀釋液（AFP以1:20稀釋，AXL、COMP、OPN以1:30稀釋）或標(biāo)準(zhǔn)品或空白對(duì)照，室溫振蕩孵育2 h，洗滌液清洗2次；每孔加入50 μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體而形成雙抗體夾心形式，室溫振蕩孵育1 h，洗滌液清洗2次；每孔加入50 μL稀釋后的SA-PE，室溫振蕩孵育0.5 h，洗滌液清洗2次；200 μL檢測(cè)緩沖液重懸微球，用EasyCell流式細(xì)胞儀的不同激光同時(shí)對(duì)羧基微球上的分類熒光和檢測(cè)抗體上的標(biāo)記熒光進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)待測(cè)靶標(biāo)分子進(jìn)行分類和定量，實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)肝癌標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)[12]。

1.2.2 方法學(xué)建立：根據(jù)唯公羧基編碼微球使用說明書，取四種不同熒光比例的微球各100 μL（8×106beads/mL），洗滌后加入Sulfo-NHS、EDC活化30 min；以MES為反應(yīng)緩沖液，分別向每種微球懸液中加入5.6 μg對(duì)應(yīng)的捕獲抗體孵育2 h；用Tris緩沖液反應(yīng)10 min，直接加入封閉緩沖液搖床混勻封閉14 h；于次日用種屬與微球結(jié)合的捕獲抗體種屬來源匹配的生物素化抗鼠IgG以及SA-PE來驗(yàn)證微球偶聯(lián)效率；利用四項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)中值熒光強(qiáng)度（median fluorescence intensity,MFI）優(yōu)化檢測(cè)抗體和SA-PE的工作濃度以及依次加入蛋白、檢測(cè)抗體和SA-PE的孵育時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，建立定量檢測(cè)肝癌血清標(biāo)志物的流式熒光免疫法。

1.2.3 方法學(xué)性能分析：①交叉反應(yīng)：使用3 個(gè)測(cè)試評(píng)估交叉反應(yīng)性[13]，多重偶聯(lián)微球、單個(gè)抗原和單個(gè)檢測(cè)抗體，用于確定蛋白是否與非靶標(biāo)偶聯(lián)微球結(jié)合；多重偶聯(lián)微球、單個(gè)抗原和多重檢測(cè)抗體，用于確定檢測(cè)抗體是否與非靶標(biāo)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)；多重偶聯(lián)微球、多重抗原和多重檢測(cè)抗體，用于確認(rèn)多重測(cè)定中不存在交叉反應(yīng)。②檢測(cè)范圍：結(jié)合靈敏度和最高檢測(cè)限得到檢測(cè)范圍。③靈敏度：以樣本稀釋液為空白對(duì)照，測(cè)定3個(gè)空白對(duì)照的MFI值，計(jì)算其均值（）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），以空白檢測(cè)限（limit of blank,LoB）=+2s[13]和最低檢測(cè)限（limit of detection,LoD）=+2s[14]分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算對(duì)應(yīng)濃度值。④精密度：檢測(cè)高、低兩個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度11個(gè)重復(fù)，進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。根據(jù)變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）公式：CV（%）=s/×100%，計(jì)算精密度。⑤回收率與線性度：以人混合血清樣本為未摻入組，向人混合血清樣本加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為摻入組，向稀釋液中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照組。根據(jù)樣本測(cè)定濃度值計(jì)算相應(yīng)的回收率和線性度，回收率（%）=（摻入組－未摻入組）/對(duì)照組×100%，以摻入組的樣本計(jì)算線性度，線性度（%）=稀釋樣本×稀釋倍數(shù)/未稀釋樣本×100%。

1.2.4 方法學(xué)初步應(yīng)用：本研究以訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列作為研究對(duì)象，流式熒光免疫法測(cè)定同一批血清樣本中四項(xiàng)蛋白濃度，比較HCC組與健康對(duì)照組的組間差異，分析流式熒光免疫法與化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)AFP水平的一致性，受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線用于評(píng)估標(biāo)志物在HCC中的診斷性能，二元Logistic回歸分析用于構(gòu)建標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)模型，以探討流式免疫熒光法檢測(cè)四項(xiàng)肝癌標(biāo)志物在診斷中的初步應(yīng)用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS25.0、GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩種方法的一致性分析采用Pearson相關(guān)；標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；標(biāo)志物診斷性能評(píng)估采用ROC曲線分析；標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)模型構(gòu)建采用二元Logistic回歸分析；標(biāo)志物間的交叉反應(yīng)圖采用Excel繪制。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微球偶聯(lián)驗(yàn)證 在分析開發(fā)之前進(jìn)行微球偶聯(lián)效率評(píng)估，以MFI為縱坐標(biāo)，抗鼠IgG濃度值為橫坐標(biāo)，采用四參數(shù)Logistic回歸模型分別繪制AFP、AXL、COMP和OPN的曲線。隨著生物素標(biāo)記的抗鼠IgG濃度不斷增加，相應(yīng)的MFI信號(hào)值也會(huì)增加（見圖1）。四項(xiàng)標(biāo)志物的最高M(jìn)FI信號(hào)均在170 000以上[在設(shè)置的光電倍增管（photomultiplier tube,PMT）下，飽和狀態(tài)最高M(jìn)FI信號(hào)值在200 000左右]，說明四項(xiàng)標(biāo)志物的捕獲抗體已經(jīng)成功連接在微球上。

圖1 微球偶聯(lián)驗(yàn)證結(jié)果

2.2 檢測(cè)性能

2.2.1 交叉反應(yīng)：分析肝癌標(biāo)志物AXL、COMP和OPN之間的交叉反應(yīng)性，顯示三個(gè)靶標(biāo)蛋白之間不存在交叉反應(yīng)（見圖2），可以實(shí)現(xiàn)三項(xiàng)標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)。

圖2 交叉反應(yīng)結(jié)果圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)定量測(cè)量至關(guān)重要，以MFI為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)，采用四參數(shù)Logistic回歸模型繪制AFP、AXL、COMP和OPN的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3）。四項(xiàng)標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)的檢測(cè)范圍、LoB和LoD分析結(jié)果見表1。結(jié)果表明四項(xiàng)標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)人血清中AFP、AXL、COMP和OPN的蛋白濃度（R2=0.999）。

表1 四項(xiàng)標(biāo)志物性能分析結(jié)果

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.3 性能分析：四項(xiàng)標(biāo)志物對(duì)應(yīng)精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表1，檢測(cè)高、低兩個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度11個(gè)重復(fù)，得到四項(xiàng)標(biāo)志物的批內(nèi)CV均＜8%；3次獨(dú)立檢測(cè)得到四項(xiàng)標(biāo)志物的批間CV均＜5%；測(cè)定每個(gè)蛋白梯度稀釋的四個(gè)濃度，計(jì)算四項(xiàng)標(biāo)志物的平均回收率在84%～101%范圍內(nèi)，平均線性度在95%～102%之間。

2.3 肝癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

2.3.1 方法學(xué)比對(duì)：為了驗(yàn)證流式熒光免疫法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將其與臨床化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)HCC患者的AFP結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，訓(xùn)練隊(duì)列（n=30）和驗(yàn)證隊(duì)列（n=20）的結(jié)果均顯示兩種方法具有很高的相關(guān)性（r=0.994，P＜0.001），見圖4。

圖4 AFP結(jié)果的相關(guān)性分析

2.3.2 差異表達(dá)分析：血清樣本中AFP、AXL、COMP及OPN在HCC組與健康對(duì)照組存在顯著差異（見圖5），在訓(xùn)練隊(duì)列（n=60）中，HCC組四項(xiàng)標(biāo)志物表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列（n=40）證實(shí)了訓(xùn)練隊(duì)列的發(fā)現(xiàn)，相比于健康對(duì)照，四項(xiàng)標(biāo)志物在HCC中均過度分泌（均P＜0.01）。在訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中，血清四項(xiàng)蛋白水平表現(xiàn)出相似的分布（見圖5和表2）。

表2 各項(xiàng)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果[ M（P25，P75），ng/mL]

圖5 四項(xiàng)標(biāo)志物在健康對(duì)照組與HCC組的差異表達(dá)

2.3.3 臨床應(yīng)用價(jià)值探討：繪制HCC與健康對(duì)照的ROC曲線，以約登指數(shù)確定最佳臨界值，在最佳臨界值條件下對(duì)比各項(xiàng)標(biāo)志物的診斷性能。在訓(xùn)練隊(duì)列中，單項(xiàng)標(biāo)志物中，OPN對(duì)HCC的診斷性能最佳，AUC達(dá)到0.891，表現(xiàn)出比AFP（AUC為0.859）更好的診斷價(jià)值；AXL、OPN和AFP組合的AUC為0.953，P4的AUC為0.951，二者具有相似的診斷性能；評(píng)估各項(xiàng)標(biāo)志物對(duì)HCC的識(shí)別能力，在30例HCC中，21例（70.0%）為AXL陽性，15例（50%）為COMP陽性，24例（80.0%）為OPN陽性，23例（76.7%）為AFP陽性，共有30例（100%）為AXL、COMP、OPN、AFP或四者陽性。為了進(jìn)一步挖掘AXL、COMP、OPN對(duì)AFP陰性HCC患者的識(shí)別能力，訓(xùn)練隊(duì)列中，有9例AFP陰性HCC患者，其中6例（66.7%）為AXL陽性，5例（55.6%）為COMP陽性，7例（77.8%）為OPN陽性，共有9例（100%）為AXL、COMP、OPN或三者陽性。見圖6A。

圖6 血清四項(xiàng)標(biāo)志物診斷性能的評(píng)估

使用訓(xùn)練隊(duì)列中相同的臨界值，分析了驗(yàn)證隊(duì)列中的40 例參與者，得到與訓(xùn)練隊(duì)列相似的診斷性能（見圖6B和表3），AXL、OPN和AFP組合的AUC為0.955，P4的AUC為0.965。在兩個(gè)隊(duì)列的所有參與者（n=100）中，ROC曲線分析產(chǎn)生了與訓(xùn)練隊(duì)列相似的診斷性能（見圖6C）。

表3 四項(xiàng)標(biāo)志物的診斷性能

用Logistic回歸模型評(píng)估兩個(gè)隊(duì)列中四項(xiàng)標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)HCC的性能，發(fā)現(xiàn)回歸模型中COMP與AXL自變量之間存在中度共線性，方差膨脹因子（variance inflation factor,VIF）：COMP=3.986，AXL=4.688（VIF為3～10時(shí)被認(rèn)為有中等程度的共線性），可能會(huì)影響回歸方程的預(yù)測(cè)結(jié)果，最終將AXL、OPN和AFP納入預(yù)測(cè)模型中，通過二元Logistic回歸獲得的方程創(chuàng)建了HCC的新變量預(yù)測(cè)概率（p）：Log（p/(1-p)）=-4.563+0.009×AFP+0.017×OPN+0.09×AXL，（AFP，P=0.023；OPN，P=0.004；AXL，P=0.108）。

3 討論

隨著新型標(biāo)志物和新技術(shù)的不斷更新，檢測(cè)肝癌相關(guān)標(biāo)志物的新方法不斷涌現(xiàn)，它們的創(chuàng)新之處可能在于分析方法，充分地將成熟標(biāo)志物AFP與新型標(biāo)志物應(yīng)用于各種創(chuàng)新型統(tǒng)計(jì)模型中[15-16]。盡管臨床血清學(xué)標(biāo)志物AFP仍然飽受爭(zhēng)議，但所有新方法一經(jīng)提出都得與AFP進(jìn)行比較[6，15，17]。

本研究對(duì)流式熒光技術(shù)檢測(cè)四項(xiàng)標(biāo)志物的方法進(jìn)行性能分析，四項(xiàng)標(biāo)志物表現(xiàn)出較好的檢測(cè)范圍、靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，揭示本項(xiàng)目開發(fā)的檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確定量血清中AFP、AXL、COMP和OPN水平。AXL、COMP和OPN之間沒有觀察到交叉反應(yīng)，基于流式熒光技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三項(xiàng)標(biāo)志物同步檢測(cè)，可顯著節(jié)省樣本用量和檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)而降低標(biāo)志物檢測(cè)成本。因AFP與這個(gè)組合的AXL檢測(cè)抗體存在交叉反應(yīng)且AFP與這個(gè)組合的樣本稀釋倍數(shù)相差懸殊而進(jìn)行單項(xiàng)檢測(cè)。

本研究篩選兩個(gè)隊(duì)列的血清樣本進(jìn)行臨床驗(yàn)證并探討新型肝癌標(biāo)志物的初步應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)HCC組的血清AXL、COMP、OPN和AFP均顯著高表達(dá)，證實(shí)這四項(xiàng)標(biāo)志物在HCC患者中具有較高的表達(dá)水平，與以往研究[4-6]報(bào)道結(jié)果一致。ROC曲線分析顯示，單項(xiàng)標(biāo)志物中，OPN對(duì)肝癌的診斷效果最佳，表現(xiàn)出比AFP更優(yōu)的診斷性能[6]。利用四項(xiàng)標(biāo)志物構(gòu)建HCC預(yù)測(cè)模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)Logistic回歸模型中COMP與AXL自變量之間存在中度共線性，可能會(huì)影響Logistic回歸方程的預(yù)測(cè)結(jié)果，最后僅用AXL、OPN和AFP構(gòu)建HCC預(yù)測(cè)模型。與以往報(bào)道的AFP、AFP-L3、DCP組合[18]（AUC為0.910），GALAD模型[15]（AUC為0.930），7個(gè)miRNAs組合[17]（AUC為0.888）等對(duì)HCC的診斷性能相比，AXL、OPN和AFP組合能達(dá)到相當(dāng)?shù)臋z測(cè)性能，且AXL、COMP、OPN對(duì)AFP陰性HCC患者具有一定的識(shí)別能力，表明AXL、COMP、OPN是診斷HCC的潛在血清學(xué)標(biāo)志物，需要在更大臨床隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。

流式熒光技術(shù)具有通量高、速度快、易自動(dòng)化、按需組合等優(yōu)勢(shì)受到臨床廣泛關(guān)注和積極推動(dòng)[11]。本研究的流式熒光免疫法與臨床化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)AFP結(jié)果具有顯著相關(guān)性（r=0.995，P＜0.001），這說明此方法可以滿足臨床檢測(cè)性能。AXL、COMP、OPN還沒應(yīng)用于臨床，因此沒有臨床相關(guān)的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以進(jìn)行比對(duì)，在我們未來的研究計(jì)劃中，利用ELISA檢測(cè)AXL、COMP、OPN與流式免疫法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)流式熒光技術(shù)檢測(cè)三項(xiàng)標(biāo)志物的可靠性。

最后，本研究不足在于樣本量較小，研究結(jié)果需要在更大臨床隊(duì)列中得到驗(yàn)證；同時(shí)考慮到肝臟相關(guān)疾病對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響，例如肝炎、肝硬化等，我們還需要加入相關(guān)疾病隊(duì)列以得到對(duì)肝癌更加特異的標(biāo)志物。總之，我們建立了一種同時(shí)檢測(cè)血清AXL、COMP和OPN的多重檢測(cè)方法，在兩個(gè)臨床隊(duì)列中平行驗(yàn)證了以上標(biāo)志物在肝癌中的檢測(cè)能力。