周秀娟,梁倩蓉,朱凝瑜,丁雪燕,朱 斐*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測(cè)技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 311300;2.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/浙江省漁業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)與疫病防控中心,浙江杭州 310023)

中華鱉因其具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。中華鱉營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味鮮美,具有較高的食用與藥用價(jià)值[1-4],養(yǎng)殖分布廣泛,湖南、湖北、江西、安徽、江蘇、浙江等省份產(chǎn)量較高[5-6]。浙江省中華鱉養(yǎng)殖品系眾多,包括中華鱉日本品系、清溪烏鱉等,并自主繁育了中華鱉“浙新花鱉”(GS-02-005-2015)等。然而,近年來(lái)中華鱉病害發(fā)生較多,導(dǎo)致養(yǎng)殖損失慘重。目前已報(bào)道的中華鱉病害包括病毒病、細(xì)菌病、真菌病和寄生蟲(chóng)病,其中病毒病和細(xì)菌病較為嚴(yán)重[7-9]。目前已知的中華鱉病毒主要有動(dòng)脈炎病毒、黃病毒、虹彩病毒等[10-11],細(xì)菌病病原主要為氣單胞菌和弧菌[12-13]。

2021年5月,浙江省諸暨市某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)中華鱉大量死亡病例。筆者實(shí)地采集該養(yǎng)殖場(chǎng)患病中華鱉,進(jìn)行組織解剖、平板劃線(xiàn)分離優(yōu)勢(shì)菌,并通過(guò)細(xì)菌生理生化試驗(yàn)和病毒分子生物學(xué)分析的方法進(jìn)行分類(lèi)鑒定,再通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選出能有效抑制病原菌的抗菌藥物,最后提出合理防控建議,旨在為中華鱉腮腺炎的科學(xué)診斷和防控提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。浙江諸暨某中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)連續(xù)性死亡,病鱉行動(dòng)遲緩,脖頸腫大且無(wú)法縮回殼內(nèi),底板發(fā)白,底板和四肢病鱉行動(dòng)遲緩、少食厭食,脖頸腫大、無(wú)法縮回殼內(nèi),底板和四肢有明顯出血點(diǎn)或斑塊。取該養(yǎng)殖場(chǎng)5只患病中華鱉作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.1.2主要試劑。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;96孔藥敏板購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司;RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3主要儀器。全自動(dòng)細(xì)菌生理生化鑒定儀(VITEK2 Compact,法國(guó)梅里埃);PCR儀(Arktik96,美國(guó)Thermofisher);多功能電泳儀(PowerPac HC,美國(guó)Bio-Rad);低溫冷凍離心機(jī)(Microfuge 20R,美國(guó)Beckman Coulter)等。

1.2 病鱉解剖與病原分離選取癥狀典型的瀕死病鱉,無(wú)菌條件下使用接種環(huán)從其腮腺、肝、脾、腎、腸等病灶部位蘸取劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,28 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜,挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),直至獲得純培養(yǎng)菌(編號(hào)為SR1),保存在含20%甘油的腦心浸出液中,置于-80 ℃冰箱中保存。取肝、腎、脾等內(nèi)臟組織保存于DNA/RNA保護(hù)液中,用于病毒檢測(cè)。

1.3 細(xì)菌鑒定將純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色,根據(jù)染色結(jié)果選擇相應(yīng)鑒定卡,用無(wú)菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至107～108CFU/mL,插上鑒定卡,放入全自動(dòng)細(xì)菌生理生化鑒定儀中培養(yǎng)鑒定。

1.4 病毒檢測(cè)利用RNA、DNA提取試劑盒分別提取病鱉肝、脾、腎組織RNA和DNA,利用中華鱉出血性綜合征病毒(TSHSV)、虹彩病毒(STIV)和黃病毒(FLV)3種已知中華鱉病毒特異性引物(引物見(jiàn)表1,引物參考Liu等[14]、范萬(wàn)紅等[15]報(bào)道以及經(jīng)NCBI網(wǎng)站序列信息設(shè)計(jì)),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳初步判定擴(kuò)增產(chǎn)物為目的條帶大小附近的單一條帶后,膠回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表1 病毒特異性引物對(duì)

將測(cè)序所得的病毒序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì),選取相似度高的序列,使用Clustal X進(jìn)行多重序列同源性比對(duì),使用MEGA 8.0軟件采用鄰接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯連續(xù)稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。純化的菌落用無(wú)菌生理鹽水將濃度調(diào)至107～108CFU/mL,稀釋后加入96孔藥敏板,28 ℃下培養(yǎng)24～28 h后讀板。根據(jù)培養(yǎng)后96孔藥敏板的濁度,確定恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶8種漁用抗菌藥物對(duì)菌株的最低抑菌濃度(MIC值),統(tǒng)計(jì)8種抗菌藥物對(duì)病原菌的MIC50和MIC90。

1.6 回歸感染試驗(yàn)

1.6.1出血性綜合征病毒人工感染。按照Liu等[9]的方法,取病鱉肝、脾、腎等組織加入無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量體積比1∶10)充分研磨后12 000 r/min、4 ℃下離心10 min,取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾,并將其作為病毒粗提液進(jìn)行攻毒。在(25±1)℃水溫條件下,對(duì)20只平均質(zhì)量300 g的健康中華鱉進(jìn)行腹腔注射,每只鱉注射200 μL病毒粗提液(試驗(yàn)組),以等體積無(wú)菌生理鹽水注射20只相同規(guī)格的中華鱉作為對(duì)照組,觀(guān)察記錄2組中華鱉的死亡數(shù)量,并統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率。取感染中華鱉肝、脾、腎等組織提取核酸,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,方法同“1.4”。

1.6.2嗜水氣單胞菌人工感染。取分離菌株接種于腦心浸出液,30 ℃下培養(yǎng)24 h,5 000 r/min離心并去除培養(yǎng)液后,無(wú)菌生理鹽水重懸并調(diào)節(jié)濃度至107CFU/mL。在(25±1)℃水溫條件下,對(duì)20只平均質(zhì)量300 g的健康中華鱉進(jìn)行腹腔注射,每只鱉注射200 μL細(xì)菌懸液(試驗(yàn)組),用等體積無(wú)菌生理鹽水注射20只相同規(guī)格的中華鱉作為對(duì)照組,觀(guān)察記錄2組中華鱉的死亡數(shù)量,并統(tǒng)計(jì)累計(jì)死亡率。從感染中華鱉腮腺、肝、脾、腎等部位蘸取劃線(xiàn)培養(yǎng)并鑒定,方法同“1.2”和“1.3”。

2 結(jié)果與分析

2.1 病鱉臨床癥狀和剖檢結(jié)果病鱉行動(dòng)遲緩、少食厭食,脖頸腫大、無(wú)法縮回殼內(nèi),發(fā)白的底板和四肢有明顯出血點(diǎn)或斑塊。經(jīng)解剖可見(jiàn),病鱉腮部出現(xiàn)糜爛及出血,肝臟腫脹,腸道充血明顯,伴有腹水(圖1)。

注:A.脖頸浮腫,底板有血斑;B.腸道充血;C.腮部糜爛及出血;D.腹水。Note:A.Puffy neck,blood stains on the abdomen;B.Intestine hyperemia;C.Parotid erosion and bleeding;D.Ascites.圖1 病鱉臨床癥狀及病理變化Fig.1 The symptoms and pathological changes of diseased T.sinensis

2.2 細(xì)菌分離與生化鑒定從患病中華鱉腮腺、肝、脾、腎、腸組織中均分離到一種主要優(yōu)勢(shì)菌,菌落呈圓形,邊緣完整,中央有突起,表面光滑,淺黃色,半透明,革蘭氏染色呈陰性(圖2)?；谌詣?dòng)細(xì)菌生理生化鑒定儀鑒定結(jié)果,該優(yōu)勢(shì)菌為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila),菌株相似性為99%。該優(yōu)勢(shì)菌生理生化特性見(jiàn)表2。

圖2 病鱉優(yōu)勢(shì)菌的分離與純化Fig.2 The separation and purification of the dominant colonies from diseased T.sinensis

表2 病原菌生理生化特性

2.3 病毒分子生物學(xué)鑒定利用3種中華鱉常見(jiàn)病毒特異性引物進(jìn)行病毒檢測(cè),其中STIV、FLV特異性引物未擴(kuò)增到條帶;TSHSV引物擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約308 bp的片段(圖3)。產(chǎn)物切膠回收測(cè)序,序列經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其與中華鱉出血性綜合征病毒(TSHSV)同源性為96.84%。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載動(dòng)脈炎屬病毒和中華鱉其他病毒序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示,此次分離病毒與TSHSV聚為一支(圖4)。

注:M.DNA Marker;L1.肝;L2.腎;L3.脾。Note:M.DNA Marker;L1.Liver;L2.Kidney;L3.Spleen.圖3 患病中華鱉不同組織病毒PCR擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of PCR fragments of the virus from different tissues of diseased T.sinensis

圖4 患病中華鱉病毒分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the isolated virus from diseased T.sinensis

2.4 藥敏試驗(yàn)96孔藥敏板試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示,病鱉體內(nèi)分離的嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素3種抗菌藥物敏感(MIC50≤2 μg/mL,MIC90≤4 μg/mL),而對(duì)氟苯尼考、甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲噁唑/甲氧芐啶4種抗菌藥物耐受(MIC50≥128 μg/mL,MIC90≥128 μg/mL)。

表3 8種漁用抗菌藥物對(duì)中華鱉嗜水氣單胞菌的MIC值

2.5 回歸感染后中華鱉累計(jì)死亡率從圖5可以看出,出血性綜合征病毒人工感染中華鱉2 d內(nèi)未出現(xiàn)明顯死亡,3 d后死亡率明顯增加,感染第6天試驗(yàn)組中華鱉全部死亡,對(duì)照組中華鱉均未死亡。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組中華鱉出現(xiàn)腹腔血水、腮出血、肝臟發(fā)黑、腸道紅腫等癥狀。感染后中華鱉肝、脾、腎等組織TSHSV檢測(cè)呈陽(yáng)性。

圖5 出血性綜合征病毒人工回歸感染中華鱉累計(jì)死亡率Fig.5 Accumulative mortality of T.sinensis artificially infected by TSHSV

嗜水氣單胞菌人工感染中華鱉第2天開(kāi)始出現(xiàn)死亡,此后死亡率明顯增加,感染第6天試驗(yàn)組中華鱉累計(jì)死亡率高達(dá)60%,對(duì)照組中華鱉均未出現(xiàn)死亡(圖6)。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組中華鱉出現(xiàn)肝臟發(fā)黑、腸道紅腫、腹腔血水等主要癥狀。從感染中華鱉腮腺、肝、脾、腎分離的細(xì)菌經(jīng)鑒定為嗜水氣單胞菌。

圖6 嗜水氣單胞菌人工回歸感染中華鱉累計(jì)死亡率Fig.6 Accumulative mortality of T.sinensis artificially infected by Aeromonas hydrophila

3 討論

中華鱉出血性綜合征病毒(TSHSV)能引起中華鱉腮腺紅腫、內(nèi)臟器官病變和全身性出血,是一種感染性強(qiáng)、致死率高的動(dòng)脈炎病毒[16]。其典型臨床癥狀為腮腺糜爛紅腫,肝臟組織腫大質(zhì)脆、點(diǎn)狀嚴(yán)重充血,腸道紅腫出血。2015年,中華鱉出血性綜合征病毒序列首次被浙江省淡水水產(chǎn)研究所劉莉團(tuán)隊(duì)報(bào)道[14],隨后感染該病毒中華鱉的組織病理學(xué)特征[17]、組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)和腮腺差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)被逐一分析研究[7,9]。同時(shí),丁軍等[18]利用光鏡和電子顯微鏡觀(guān)察海龜肝臟和腎臟的組織病理學(xué)特征,結(jié)果與中華鱉出血性綜合征病毒感染相似,說(shuō)明海龜也存在被該病毒感染的潛在可能。上述報(bào)道為中華鱉出血性綜合征病毒感染特性研究提供了有力參考,近年來(lái)學(xué)者們對(duì)該病毒的關(guān)注度有所提高。

氣單胞菌屬是一類(lèi)革蘭氏陰性條件致病菌,廣泛存在于自然界中,可引起水生動(dòng)物出現(xiàn)潰瘍、疥瘡、敗血等病癥,并能在一定條件下導(dǎo)致人急性腸炎乃至嚴(yán)重的腹膜炎以及骨髓炎等[19]。常見(jiàn)致病氣單胞菌包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌等,可感染草魚(yú)、鲆鰈類(lèi)、中華絨螯蟹等多種常見(jiàn)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)品種[20-22],也能引起中華鱉多種病癥,包括鱉紅脖子病、腮腺炎、白底板、紅底板、出血性腸道壞死癥、腐皮病等[23]。

根據(jù)疾病流行病學(xué)特征,筆者對(duì)此次患病中華鱉分別開(kāi)展病毒和細(xì)菌檢測(cè),結(jié)果同時(shí)鑒定到中華鱉出血性綜合征病毒和嗜水氣單胞菌,并分別進(jìn)行了回歸感染試驗(yàn),由此確定此例中華鱉腮腺炎為嗜水氣單胞菌與中華鱉出血性綜合征病毒混合感染所引起。此病例發(fā)病時(shí)間為5月底至6月,也是中華鱉腮腺炎的主要流行季節(jié)[24],此時(shí)養(yǎng)殖水溫為26～30 ℃,適宜病毒和病原菌的快速生長(zhǎng)。過(guò)高的養(yǎng)殖密度和不適宜的飼料投喂量引起水體中餌料殘?jiān)图S便的過(guò)度富集,勢(shì)必導(dǎo)致水質(zhì)變差,另外也會(huì)營(yíng)造病原滋生的“溫床”。加上高溫狀態(tài)下中華鱉機(jī)體免疫力也會(huì)下降,會(huì)致使感染加劇。因此,病毒和細(xì)菌的混合感染往往是造成養(yǎng)殖動(dòng)物高致死率的主要原因。

目前,未有針對(duì)中華鱉出血性綜合征的特效治療藥物,該病防控的核心原則仍是“防重于治”。必須從優(yōu)質(zhì)苗種、水質(zhì)調(diào)控、合理密度、日常管理等方面做到“防病于未然”,在疾病高發(fā)季節(jié),合理使用國(guó)家批準(zhǔn)使用的含氯石灰等消毒藥物對(duì)水體定時(shí)消殺;同時(shí)也可從推廣“稻鱉共生”“蝦鱉混養(yǎng)”[25-26]等生態(tài)養(yǎng)殖模式、優(yōu)化中華鱉養(yǎng)殖環(huán)境方面入手,減少病毒病的暴發(fā)。一旦發(fā)病,應(yīng)首先確診病原,及時(shí)撈出病死鱉、徹底消毒;若發(fā)現(xiàn)伴有細(xì)菌感染,應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選擇抗菌效果好的抗菌藥物進(jìn)行治療,使用國(guó)家批準(zhǔn)的中草藥和維生素C等制劑拌飼投喂,對(duì)患病動(dòng)物進(jìn)行免疫調(diào)理,以降低死亡率、減少損失。