楊宇，張沁榮，謝佶芹，謝軍金，王黎明，鄭麗君，張文平 ，岳碧松

（1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023；3. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610081）

潰瘍性結(jié)腸炎是以直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的炎癥和潰瘍形成為病理特點(diǎn)的非特異性炎性腸病，多呈反復(fù)發(fā)作的病程，在人和動(dòng)物中均較常見(jiàn)（Okayasu & Mainka，1990）。大熊貓Ailuropoda melanoleuca的腸道疾病一直被研究者們認(rèn)為是造成其死亡的重要原因之一，由細(xì)菌引發(fā)的腸道疾病尤為嚴(yán)重，任何一種或者多種腸道微生物的變化都可能引起一系列的消化功能紊亂甚至疾?。≦iuet al.，1993；Azizet al.，2013）。引起大熊貓腸道疾病的病原菌包括大腸桿菌Escherichia coli、魏氏梭菌Clostridium welchii、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Yersinia enterocolitica和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae等（孫飛龍等，2002）。條件致病菌大腸桿菌在大熊貓生活環(huán)境變化等情況下會(huì)大量滋生，引起大熊貓腹瀉；肺炎克雷伯氏菌感染會(huì)導(dǎo)致大熊貓腸炎，體重減輕，排粘、便血等，嚴(yán)重時(shí)引起大熊貓死亡。王成東等（2006）報(bào)道一亞成年大熊貓因大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌合并感染出現(xiàn)敗血癥而死亡。目前為止還缺乏安全有效的治愈藥物。

腸道微生物不是單獨(dú)存在的，不同種類(lèi)間具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，相互依賴(lài)、相互制約形成一種微生態(tài)平衡（Belkaid & Harrison，2017）。盡管潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病原因尚不清楚，但越來(lái)越多證據(jù)表明，腸道共生菌群可以促進(jìn)腸道內(nèi)環(huán)境的平衡，調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能和腸上皮細(xì)胞的代謝活性；病原微生物的入侵會(huì)導(dǎo)致腸道微生態(tài)系統(tǒng)的紊亂，破壞腸道菌群之間的平衡（張開(kāi)，2017）。腸道菌群通過(guò)多種機(jī)制參與機(jī)體的能量代謝，包括對(duì)不能被消化的膳食纖維等的酵解（淀粉或寡糖）、肽類(lèi)或蛋白質(zhì)的無(wú)氧酵解、結(jié)合膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化、草酸鹽復(fù)合物的降解及一些維生素的合成（維生素B12 和維生素K），菌群失調(diào)可導(dǎo)致能量代謝紊亂（Nicholsonet al.，2005）；同時(shí)菌群失調(diào)可造成腸道黏膜免疫異常，全身免疫系統(tǒng)及腸道黏膜免疫的建立和成熟有賴(lài)于腸道細(xì)菌的定植和菌群的形成，腸相關(guān)淋巴組織起到了對(duì)腸道原籍菌群的耐受和對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)的作用。各種原因?qū)е履c道黏膜屏障功能減弱，其對(duì)菌群的免疫反應(yīng)調(diào)控就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，繼而引起局部甚至全身的免疫反應(yīng)紊亂（潘照等，2015），進(jìn)一步導(dǎo)致病原菌作用于腸道黏膜及其下的淋巴組織，從而引發(fā)結(jié)腸炎。近年來(lái)，乳桿菌Lactobacillusspp.作為安全有效的飼料添加劑，因能夠提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能、免疫功能與腸道黏膜形態(tài)而受到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可（唐仁龍，2019）。乳桿菌可通過(guò)誘導(dǎo)黏液素分泌、阻止上皮細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生可溶性肽等機(jī)制，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的屏障功能；也能減少致病菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的黏附和侵襲（Wineet al.，2009）。如口服植物乳桿菌L. plantarumK68 可通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性來(lái)改善小鼠的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎（Liuet al.，2011）。L. plantarum-12 可通過(guò)增加乳桿菌和減少致病菌來(lái)恢復(fù)腸道菌群平衡，并通過(guò)激活Janus 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子來(lái)提高免疫力、增強(qiáng)腸道屏障功能，從而減輕結(jié)腸炎小鼠的發(fā)病癥狀（Sunet al.，2020）；L. casei也可使由2，4，6-三硝基苯磺酸/無(wú)水乙醇的混合物誘發(fā)結(jié)腸炎的小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分和脂質(zhì)過(guò)氧化明顯改善，從而進(jìn)一步緩解結(jié)腸炎的發(fā)作（Ghasemi-Niriet al.，2011）。乳桿菌在預(yù)防和治療腹瀉的有效性方面得到了大量的驗(yàn)證（Kimet al.，2018；Liet al.，2019；Yueet al.，2020）。

唾液聯(lián)合乳桿菌Ligilactobacillus salivarius103是成都大熊貓繁育研究基地實(shí)驗(yàn)室從健康大熊貓新鮮糞便樣品中分離篩選得到的優(yōu)良菌株，具有生物特性好、抑菌效果明顯、不含耐藥基因等特點(diǎn)（王黎明等，2019）。本研究采取先用菌懸液灌胃、再用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的方法，評(píng)估唾液聯(lián)合乳桿菌103對(duì)結(jié)腸炎的預(yù)防作用，為其在圈養(yǎng)大熊貓種群中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 唾液聯(lián)合乳桿菌

從成都大熊貓繁育研究基地實(shí)驗(yàn)室凍存管中取唾液聯(lián)合乳桿菌103菌液1 mL于200 mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)培24 h，用生理鹽水調(diào)整濃度到1×109cfu·mL-1。

1.2 主要試劑

DSS［分子量：36 000～50 000；翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫ELISA 試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司），髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），MRS 培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

急性結(jié)腸炎造模是常用的結(jié)腸炎模型之一，因其制備簡(jiǎn)單、成功率高，且與人類(lèi)結(jié)腸炎病變相似，是研究急性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制和評(píng)估藥物療效較為理想的模型。急性造模一般采用較高濃度的DSS 建立，給藥時(shí)間較短，給予3%～5%DSS 自由飲用1 周即可（http：//www.bioon.com.cn/）。本研究選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體重22～25 g，由成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030，動(dòng)物試驗(yàn)由成都大熊貓繁育研究基地動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)并監(jiān)督（批準(zhǔn)號(hào)：202015）。將27只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)空白對(duì)照組、DSS模型組和唾液聯(lián)合乳桿菌處理組，每籠3 只。適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后，唾液聯(lián)合乳桿菌處理組灌胃唾液聯(lián)合乳桿菌103 菌懸液14 d，活菌濃度為109cfu·mL-1，每天每只200 μL，空白對(duì)照組和DSS 模型組每只每天灌胃200 μL 生理鹽水。灌胃14 d 后，DSS 模型組和唾液聯(lián)合乳桿菌處理組自由飲用3%DSS 水溶液，空白對(duì)照組自由飲用超純水，7 d 后用頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹，取肛門(mén)至回盲部的結(jié)腸并用游標(biāo)卡尺測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度（精度為1 mm），剪取中段約1 cm 結(jié)腸，用生理鹽水清洗后迅速固定于4%甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4 造模成功標(biāo)準(zhǔn)

7 d造模周期結(jié)束后，以小鼠體重下降10%、出現(xiàn)血便作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)（李富鳳等，2015）。

1.5 血清炎癥因子檢測(cè)

ELISA 法測(cè)定小鼠血清中的IL-6、TNF-α 含量和MPO活性，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析比較各組間的差異。數(shù)據(jù)采用xˉ±SD表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 癥狀觀察及體重變化

空白對(duì)照組和唾液聯(lián)合乳桿菌處理組在7 d造模期間的體重保持基本穩(wěn)定或略有增長(zhǎng)，而DSS模型組體重下降13.65%（表1）。造模結(jié)束時(shí)，DSS模型組全部出現(xiàn)嚴(yán)重便血、腹瀉、蜷縮成堆、精神萎靡、毛色無(wú)光、大便松散、飲水量減少等現(xiàn)象；而唾液聯(lián)合乳桿菌處理組癥狀明顯減輕，僅1只出現(xiàn)明顯癥狀。

表1 造模期間小鼠體重變化Table 1 Changes in body weight of mice during modeling

2.2 結(jié)直腸長(zhǎng)度

DSS 模型組的平均長(zhǎng)度為7.37 cm±0.12 cm，空白對(duì)照組的平均長(zhǎng)度為8.65 cm±0.36 cm；唾液聯(lián)合乳桿菌處理組的平均長(zhǎng)度（8.25 cm±0.23 cm）明顯大于DSS模型組的（圖1：A）。

圖1 造模期結(jié)束時(shí)小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比Fig. 1 Comparison of different indexes of the mice at the end of modeling

2.3 血清炎癥因子含量

DSS 模型組的IL-6 和TNF-α 含量比空白對(duì)照組顯著上升，唾液聯(lián)合乳桿菌處理組的IL-6 和TNF-α含量明顯低于DSS模型組（圖1：B，C）。

2.4 MPO活性

與空白對(duì)照組相比，DSS 模型組的MPO 活性顯著增加（P＜0.000 1）；與DSS 模型組相比，唾液聯(lián)合乳桿菌處理組的MPO 活性降低，但差異不顯著（圖1：D）。

2.5 病理組織切片觀察

空白對(duì)照組的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜分層明顯，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)病理變化。而DSS模型組的黏膜層變性壞死，壞死區(qū)域形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，上皮明顯脫落、缺失，固有層內(nèi)腸腺結(jié)構(gòu)基本不見(jiàn)，杯狀細(xì)胞消失，壞死區(qū)域或萎縮腸腺周?chē)梢?jiàn)淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞聚集，局部黏膜下層水腫伴輕微炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表明具有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。唾液聯(lián)合乳桿菌處理組的組織黏膜層輕微受損，局部腸腺萎縮，體積減小，周?chē)Y(jié)締組織內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞聚集，表現(xiàn)出局部炎癥反應(yīng)，但嚴(yán)重程度比DSS模型組明顯減輕（圖2）。

圖2 小鼠結(jié)腸HE染色對(duì)比Fig. 2 Comparison of HE staining in the colon of mice

5 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚（Bohl & Sobba，2015）。目前益生菌已成為治療結(jié)腸炎的研究熱點(diǎn)，其中，乳桿菌被廣泛研究，其能夠通過(guò)抑制病菌、調(diào)整腸胃微生物的多樣性、產(chǎn)生生態(tài)天然屏障來(lái)維持腸道平衡。研究表明，乳桿菌可以通過(guò)增加有益腸道菌群如阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬Bifidobacteriumsp.，減少有害菌群如埃希氏菌屬Escherichia，從而改善宿主結(jié)腸炎（Wanget al.，2016；Maet al.，2020）。最近浙江大學(xué)李蘭娟院士團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，唾液聯(lián)合乳桿菌Li01（CGMCC7045）的攝入能夠促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道屏障功能的恢復(fù)，并展現(xiàn)出潛在的抗炎作用（Feiet al.，2022）；同時(shí)也有研究表明唾液聯(lián)合乳桿菌在處理小鼠巨噬細(xì)胞的脂多糖中表現(xiàn)出更高的胃腸道條件耐受性和更顯著的抗炎作用（翟齊嘯等，2020）。

本研究探討了大熊貓?jiān)赐僖郝?lián)合乳桿菌對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠預(yù)防作用及其機(jī)制，采用了來(lái)自大熊貓腸道的益生菌，而非常規(guī)的腸道菌群，這為開(kāi)發(fā)針對(duì)大熊貓腸道疾病的益生菌制劑提供了新的方向。王黎明等（2019）完成了對(duì)唾液聯(lián)合乳桿菌103 耐酸耐鹽、抑菌實(shí)驗(yàn)、藥敏實(shí)驗(yàn)的體外篩選，但并沒(méi)有進(jìn)行小鼠的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究探究了大熊貓?jiān)赐僖郝?lián)合乳桿菌103的作用機(jī)理，并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)保護(hù)性黏蛋白的增加，從而減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)，降低結(jié)腸組織損害。由此可見(jiàn)，大熊貓?jiān)赐僖郝?lián)合乳桿菌103 能夠有效改善潰瘍性結(jié)腸炎，在潰瘍性結(jié)腸炎出現(xiàn)時(shí)，能在一定程度上減輕結(jié)腸炎的不良反應(yīng)，可能具有較好的安全性。

本研究通過(guò)探究大熊貓腸道益生菌的治療作用，為治療大熊貓腸道疾病提供了新的思路，并為研究其他動(dòng)物腸道菌群的應(yīng)用提供了啟示。值得注意的是，未來(lái)需要進(jìn)一步研究該菌株在不同病理狀態(tài)下的治療效果，并對(duì)該菌株的安全性進(jìn)行評(píng)估。