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干性年齡相關(guān)性黃斑變性動物模型研究進展

2023-10-06 07:24:01張鵬孟永宋碩熊亞妮謝金華劉楚喬付莉莉陶巧玉常艷
中國藥理學與毒理學雜志 2023年8期
關(guān)鍵詞:光感受器干性補體

張鵬,孟永,宋碩,熊亞妮,謝金華,劉楚喬,3,5,付莉莉,3,5,陶巧玉,3,5,常艷

(1.江西中醫(yī)藥大學藥學院,江西南昌 330000;2.益諾思生物技術(shù)南通有限公司,江蘇南通 226000;3.南通市海門長三角藥物高等研究院,江蘇南通 226133;4.上海益諾思生物技術(shù)有限公司,上海 201203;5.江蘇安徽中醫(yī)藥大學藥學院,安徽合肥 230012)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)指年齡增長與環(huán)境因素共同作用下,視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithe?lium,RPE)代謝異常,導致視細胞外節(jié)膜盤吞噬消化功能下降,細胞外基質(zhì)在基底膜沉積,逐漸形成玻璃疣,導致黃斑區(qū)形態(tài)與功能改變所產(chǎn)生的疾?。?]。截止2019 年,全球≥50 歲華人早期AMD患病率約為4.9%。預計至2040 年,全球AMD 患者將達2.88 億[2]。根據(jù)臨床病理改變和表現(xiàn),AMD 可分為萎縮性(干性)和滲漏性(濕性)2 類,其中干性AMD 患病率更高,約占AMD 患者80%,其早期一般不影響視力,但隨著玻璃疣數(shù)量逐漸增多,導致脂質(zhì)沉積[3]、光感受器丟失、RPE 逐漸萎縮[4]和地圖狀萎縮(geographic atrophy,GA)。臨床表現(xiàn)為視物變形、中心視野喪失和視物模糊,隨病程發(fā)展,最終導致不可逆性失明[5]。

當前研究認為,AMD由遺傳因素、環(huán)境因素、高脂高糖飲食以及年齡增長等多種因素共同作用所引發(fā),與氧化應激、脂代謝和炎癥等反應密切相關(guān)。目前通過藥物誘導、手術(shù)誘導和基因敲除等方法成功建立了不同種屬(小鼠、大鼠、猴和家兔[6])和不同機制的干性AMD 動物模型用于機制研究與藥物篩選,但迄今尚無理想的干性AMD 模型。已報道的干性AMD 模型均有所欠缺,均不能表現(xiàn)出干性AMD 完整的病理改變和臨床表現(xiàn)。本文根據(jù)機制將現(xiàn)有或正在研究的干性AMD 動物模型進行分類,闡述單一模型的優(yōu)劣勢和適用性及其與氧化應激、炎癥、脂代謝失調(diào)等發(fā)病機制的關(guān)系,為合理選擇動物模型進行干性AMD 的深入研究提供幫助。

1 基于氧化損傷的干性AMD模型

視網(wǎng)膜因含有大量不飽和脂肪酸及光敏分子(視紫紅質(zhì)或脂褐素),特別易受到氧化損傷,光敏分子暴露于光時會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)中間體[7],導致脂質(zhì)過氧化和線粒體損傷。機體為避免氧化反應過度損傷視網(wǎng)膜,會通過特定酶〔超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase D,CatD)〕和小分子抗氧化劑(硫醇和谷胱甘肽)抑制ROS累積,維持動態(tài)平衡狀態(tài)。但隨著年齡增加及與諸多環(huán)境、遺傳因素共同作用下,氧化應激和發(fā)生AMD 的可能性增加,導致AMD 的發(fā)病率持續(xù)增加。人為干預導致抗氧化機制缺乏或增加額外氧化損傷的動物模型可表現(xiàn)出AMD的多種病理特征。

1.1 光誘導模型

光敏分子之間相互作用下,視紫紅質(zhì)在漂白過程中,脂質(zhì)體過氧化產(chǎn)生的全反視黃醛或其代謝產(chǎn)物具有細胞毒性,從而啟動視網(wǎng)膜細胞凋亡程序。1966 年,Noell 等[8]首次成功建立光誘導干性AMD小鼠模型。此后許多研究者選擇不同的光源參數(shù)與實驗動物均成功建立了光誘導模型[9]。Nakamura等[10]用400~800 Lux 藍光誘導小鼠每天2 h,5 d后小鼠視網(wǎng)膜電生理(electroretinogram,ERG)振幅降低,外核層(outer nuclear layer,ONL)厚度下降。Qu 等[6]將兔暴露在含有大量藍光的225 w冷白光下成功建立光損傷模型,4 周后OCT 結(jié)果表明,兔脈絡膜反射降低、厚度減少。Pham 等[11]利用10 000 Lux藍光誘導2周,成功建立干性AMD 小鼠模型。該模型因具有光感受器死亡與光損傷同步發(fā)生、造模時間短等優(yōu)點而廣泛用于AMD 研究。此外,其發(fā)病機制與人類的發(fā)病機制存在一定相似,且可通過控制光強與暴露時間調(diào)整視網(wǎng)膜受損嚴重程度。

1.2 香煙煙霧模型

香煙和AMD 之間的關(guān)系已經(jīng)過體外和野生型小鼠實驗證明[12-14]。多種強氧化劑由肺部吸收進入血管,引起線粒體受損,同時產(chǎn)生ROS,介導蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化。香煙煙霧提取物(cigarette smoking extract,CSE)可使RPE 中的脂質(zhì)過氧化增加8 倍[15]。Wang 等[13]將C57BL/6J 小鼠暴露于自制的香煙煙霧發(fā)生器中,分別暴露3 個月(短期)和6個月(長期),每周暴露5 d,每天暴露6 h。結(jié)果表明,RPE損傷嚴重,出現(xiàn)功能異常甚至凋亡/壞死。Louer 等[16]通過在飲用水中加入CSE 誘導18~32周后,成功建立該模型。小鼠表現(xiàn)出氧化應激水平升高并伴隨視網(wǎng)膜改變,包括布魯赫氏膜(Bruch′smembrane,BM)沉積和增厚、炎癥和脈絡膜新生血管生成[13,17-18]。

1.3 羧乙基吡咯蛋白加合物免疫模型

羧乙基吡咯(carboxyethyl pyrrole,CEP)蛋白加合物是由二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)氧化后與蛋白加合物所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)加合物[19]。加合物具有免疫原性,可誘導視網(wǎng)膜產(chǎn)生抗體和炎癥[20]。Hollyfield 等[21]用CEP 修飾的小鼠血清白蛋白免疫小鼠誘導抗體生成,3 個月時可見BM 沉積,RPE 下層沉積,巨噬細胞浸潤;12 個月時,BM 增厚3~5 倍。Linetsky 等[22]在體外實驗中也發(fā)現(xiàn)氧化應激與炎癥均會導致CEP產(chǎn)生。該模型可模擬人早期AMD 變化,包括BM 變厚、RPE 沉積和光感受器丟失等。造模方法便利,適用于研究機體免疫反應與干性AMD 之間的聯(lián)系,探討氧化損傷細胞分子(脂質(zhì)和蛋白質(zhì))導致炎癥的機制和抗體參與AMD疾病過程的可能性。

1.4 碘酸鈉誘導模型

碘酸鈉(NaIO3)可在視網(wǎng)膜組織中產(chǎn)生大量ROS,加劇氧化應激反應,從而誘導AMD 形成,損傷程度隨NaIO3劑量提高而加重。一項ip 給予NaIO3100 mg·kg-1的研究表明[23],注射后6 h 開始,視網(wǎng)膜色素上皮出現(xiàn)快速和選擇性細胞死亡。注射后第3 天,感光細胞凋亡達到峰值,Müller 細胞增殖,視網(wǎng)膜內(nèi)巨噬細胞遷移,受損RPE 細胞再生。其他采用低劑量、多次注射給藥方式研究發(fā)現(xiàn),NaIO315~35 mg·kg-1RPE 損傷逐漸增加,但NaIO310 mg·kg-1時無明顯變化[24]。另有研究表明,NaIO330~40 mg·kg-1造模的小鼠模型適用于研究早期改變,第3周即可誘導出干性AMD 的大部分特征,包括ERG振幅下降、ONL變薄和RPE色素沉積等[25-26]。

1.5 自噬抑制模型

自噬是由溶酶體介導的降解受損細胞、代謝廢物,以維持穩(wěn)態(tài)的自我保護過程[27]。一旦RPE細胞自噬功能發(fā)生障礙,則累積的細胞廢物得不到降解,誘發(fā)氧化損傷,伴隨褐質(zhì)素沉積和玻璃膜疣形成,隨后導致感光細胞凋亡,視力喪失,AMD急劇發(fā)展[28]。西羅莫司(雷帕霉素)[29]、氨基葡萄糖[30]和褪黑素[31]均能通過上調(diào)自噬抑制RPE炎癥,改善視網(wǎng)膜功能,表明自噬是視網(wǎng)膜中的重要抗氧化機制。Yao 等[32]將小鼠rb1cc1基因敲除,導致光感受器外段(photoreceptor outer segments,POS)吞噬喪失,出現(xiàn)包括RPE 萎縮、視網(wǎng)膜組織紊亂、小膠質(zhì)細胞激活和光感受器喪失。小鼠RPE 特異性自噬相關(guān)蛋白5(autophagy related 5,ATG5)或ATG7基因缺失可導致自噬缺陷[33]。8~24月齡ATG5ΔRPE小鼠和ATG7ΔRPE小鼠,視網(wǎng)膜變性的發(fā)生率分別為35%和45%,RPE 發(fā)生年齡依賴性退化。13 月齡ATG5ΔRPE和ATG7ΔRPE小鼠中均發(fā)現(xiàn)了早期AMD 樣RPE 損傷,包括RPE 厚度不均勻、RPE肥大/萎縮和色素異常。該模型用于研究自噬喪失導致外層視網(wǎng)膜變性的分子機制。

1.6 超氧化物歧化酶缺乏癥模型

SOD 是一種抗氧化酶,有3 種異構(gòu)體(分別為位于細胞質(zhì)的SOD1,胞外的CuZnSOD(SOD3)和存在于線粒體的MnSOD(SOD2),催化分解潛在有害的ROS。SOD 缺失導致DNA 氧化應激水平提高。Justilien 等[34]將表達核酶基因的腺病毒注射至成年C57BL/6 小鼠的視網(wǎng)膜下,建立SOD2-/-小鼠模型,注射后約2 個月可在視網(wǎng)膜中觀察到組織學和功能變化。Biswal 等[35]通過cre/lox 重組系統(tǒng)敲除視網(wǎng)膜內(nèi)SOD2 建立SOD2-/-小鼠模型,誘導6 周視網(wǎng)膜即可出現(xiàn)強烈免疫熒光,約4 個月出現(xiàn)視網(wǎng)膜萎縮,ERG a 波和b 波振幅均下降。6~9 月后萎縮加重,a 波和b 波主要波形丟失。該類模型能模擬多種人類干性AMD 晚期表現(xiàn),包括RPE 空泡、BM 增厚和基底層沉積等,且ERG 表現(xiàn)出漸進式減退。

1.7 核因子E2相關(guān)因子2缺乏模型

核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor ery?throid 2-related factor 2,Nrf2)是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白,可誘導多種抗氧化酶表達,調(diào)節(jié)抗氧化蛋白表達,保護視網(wǎng)膜免受損傷和炎癥引發(fā)的氧化損傷,是細胞氧化還原系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[36]。Zhao 等[37]研究表明,Nrf2-/-小鼠的視網(wǎng)膜變化隨年齡增長逐漸加重,出現(xiàn)黃褐斑和玻璃樣沉積物,及RPE 萎縮性病變和RPE 細胞空泡化。12 個月時,ERG a 波和b 波振幅均下降。喂食高脂飼料時,Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)出AMD加重癥狀,如RPE過度減退和色素減退[38]。該模型最大的優(yōu)點是可重現(xiàn)基底層黃褐色沉淀物,這與早期AMD 患者眼底圖像中觀察到的相似,但僅存在少數(shù)周圍型沉積,表明其可能不是AMD 患者中所見的玻璃體沉積。且小鼠的視網(wǎng)膜萎縮和光感受器丟失發(fā)生在RPE 變性之前,與人類AMD不同。

1.8 過氧化氫酶D缺乏模型

RPE 細胞可表達CatD,有研究[39]將帶有人類CatD突變基因的DNA 片段注射至C57BL/6 小鼠受精卵胚胎中,建立穩(wěn)定蛋氨酸膽堿缺乏性(MCD/MCD)小鼠品系。15月齡后,16只MCD/MCD 小鼠視網(wǎng)膜觀察到淡粉黃色斑塊,視網(wǎng)膜周邊出現(xiàn)萎縮,16~18 月齡時,斑塊覆蓋眼底3%~10%。24 月齡時,斑塊數(shù)量隨年齡的增長而增加,同時觀察到色素沉積改變跡象。MCD/MCD 小鼠視網(wǎng)膜組織HE 染色,光鏡觀察可見大部分組織肥大、萎縮,RPE 細胞排列雜亂、腫脹,ONL 明顯變薄或缺失,光感受器退化。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導缺口末端原位標記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)陽性細胞數(shù)顯著增加。該模型能夠重現(xiàn)色素改變、RPE 細胞增殖和萎縮、基底層狀和線狀沉積物堆積以及視網(wǎng)膜敏感性降低等大部分特征。

2 基于炎癥反應的干性AMD模型

針對玻璃疣成分的研究揭示了炎癥和免疫介導的過程,Hageman 等[40]在2001 年提出AMD 的退行性改變是由炎癥過程介導的。他們發(fā)現(xiàn),雖然玻璃疣中的一些成分來自眼睛,但更多成分來自眼外,如補體、脂質(zhì)、淀粉樣蛋白B 和載脂蛋白E,提示在AMD 疾病發(fā)病過程中炎癥反應也起作用[41]。當前根據(jù)炎癥機制所建立的AMD 模型主要有2種,趨化因子模型和補體途徑模型。

2.1 趨化因子模型

趨化因子能引導白細胞在全身的遷移,由于趨化因子及其受體在AMD 中的不同表達,活化的巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞在玻璃疣和萎縮周圍的浸潤增加[42-43]。而AMD 患者單核細胞表達較高水平的趨化因子受體,包括C-C 趨化因子受體1(C-C che?mokine receptor 1,CCR1)、CCR2 和CX3C 基序趨化因子受體1(C-X3-C motif chemokine receptor 1,CX3CR1)[44]。盡管此類模型有一些干性AMD的指標,但未能發(fā)展出人類AMD 的關(guān)鍵特征,包括視網(wǎng)膜楔形病變和ONL變?。?8]。

2.1.1CX3CR1-/-小鼠模型

CX3CR1是一種非典型趨化因子,通過CX3CR1受體表達,AMD與CX3CR1基因多態(tài)性相關(guān),CX3CR1蛋白功能障礙導致視網(wǎng)膜下小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞積聚,損害RPE 和光感受器,表明CX3C 配體1/CX3CR1信號通路功能障礙可能在AMD發(fā)病機制中起一定作用[45]。2~3 月齡CX3CR1-/-小鼠模型,視網(wǎng)膜下單核巨噬細胞增多,小膠質(zhì)細胞受損并積聚在視網(wǎng)膜中,視網(wǎng)膜下炎細胞浸潤,損傷視網(wǎng)膜,出現(xiàn)RPE 下沉積、光感受器變性、外核層變薄和感光細胞數(shù)量減少[46]。

2.1.2CCL2-/-/CX3CR1-/-雙重敲除模型

C-C趨化因子配體2(C-C chemokine ligand 2,CCL2)和CX3CR1雙基因敲除(CCL2-/-/CX3CR1-/-)小鼠較CCL2?/?和CX3CR1?/?單基因敲除小鼠表現(xiàn)出更多AMD 特征,但16~18 個月才表現(xiàn)出這些變化[47]。據(jù)報道,CCL2?/?/CX3CR1?/?小鼠早在6 周齡就出現(xiàn)了視網(wǎng)膜病變,到9 周齡時,所有CCL2?/?/CX3CR1?/?小鼠均出現(xiàn)視網(wǎng)膜下玻璃疣,且隨年齡增長而增大;免疫染色顯示,BM、RPE 和脈絡膜毛細血管補體增加[48]?;蚯贸∈蟪霈F(xiàn)局灶性Bruch 膜增厚,N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(Nretinylidene-N-retinylethanolamine,A2E)水平升高,小膠質(zhì)細胞浸潤和光感受器萎縮[49]。在大齡動物中,可觀察到萎縮區(qū)域和脈絡膜視網(wǎng)膜瘢痕。然而,該小鼠AMD 模型的重復性有待商榷。Raoul 等[48]獨立開發(fā)的CCL2?/?/CX3CR1?/?小鼠品系未表現(xiàn)出明顯的AMD 特征,且無表型上的區(qū)別。一份研究表明,這些小鼠可能受到CRB1突變的影響[50]。

2.2 補體因子模型

2.2.1 補體因子H基因敲除與人源化轉(zhuǎn)基因模型

補體是先天免疫的重要組成部分,負責調(diào)理和清除細菌和細胞碎片。與AMD 風險最緊密相關(guān)的遺傳變異之一是補體因子H(complement factor H,CFH)中402 位氨基酸(Y402H)。Landowski等[51]對比觀察發(fā)現(xiàn),CFH-/-小鼠視網(wǎng)膜下出現(xiàn)脂質(zhì)沉積,RPE 變薄,ERG 表明其光感受器功能受損。Ding 等[52]通過將具有人源CFH細菌人工染色體的轉(zhuǎn)基因小鼠與CFH?/?小鼠雜交,得到了人源化CFH小鼠,或通過將含有人CFHY402H 變異體的質(zhì)粒注射到野生型小鼠受精卵中[51],以替代小鼠CFH,導致組織內(nèi)丙二醛水平上升,激活巨噬細胞,誘導炎癥產(chǎn)生[53]。12~14 月齡的成熟轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜顯示脂質(zhì)沉積。小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞聚集,基底層沉積,脂褐素顆粒堆積[54]。與野生型或CFH?/?小鼠相比,具有這種人源化CHF轉(zhuǎn)基因小鼠有更多玻璃膜疣樣沉積,還表現(xiàn)出視網(wǎng)膜下腔和BM增厚,免疫細胞和補體聚集增加[55]。

2.2.2 C3過表達模型

補體因子C3 通過整合來自3 條不同補體激活途徑的信號,在補體激活中起關(guān)鍵作用。C3裂解為C3a 和C3b,C3b 與補體因子B 結(jié)合形成C3bB 復合體,啟動補體級聯(lián)反應,最后形成膜攻擊復合體[56],因此可認為該蛋白的過度表達可能導致補體加速活化和視網(wǎng)膜病理的發(fā)展。成年野生型小鼠視網(wǎng)膜下注射攜帶C3 的重組腺病毒后,2 周內(nèi),C3過度表達,小鼠的暗視ERG即可出現(xiàn)異常。組織學和免疫組織化學顯示,病理表現(xiàn)包括RPE 萎縮、POS 丟失、膠質(zhì)增生和視網(wǎng)膜脫離;POS 萎縮、補體沉積[57]。然而,該模型存在一定局限性,因為小鼠出現(xiàn)的視網(wǎng)膜脫離并非是AMD的臨床表現(xiàn),而可能是由于注射腺病毒導致的視網(wǎng)膜變化[58]。

2.2.3 聚乙二醇誘導模型

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)會在RPE 和脈絡膜之間形成酒渣樣沉積物激活補體系統(tǒng),進而啟動一系列炎癥反應,最終引發(fā)RPE 與脈絡膜變性[59]。2011 年,Lyzogubov 等[60]通過視網(wǎng)膜下注射PEG 1 mg 成功誘導出脈絡膜新生血管。2014 年,在此基礎(chǔ)上降低劑量至0.5 mg 模擬干性AMD 的病變[61],實驗結(jié)果表明,PEG 導致的視網(wǎng)膜形態(tài)學與病理學改變與人干性AMD 基本一致,主要影響ONL 中的光感受器,介導細胞凋亡,導致ONL 厚度減少和細胞密度降低。2017 年,Cam?malleri 等[59]發(fā)布了PEG 誘導的AMD 模型的使用。他們研究了基于脂肪酸口服喂養(yǎng)是否能限制急性炎癥反應,再現(xiàn)了RPE 和脈絡膜間的“玻璃膜疣”樣沉積物及視網(wǎng)膜和RPE的退化。

3 干性黃斑變性與脂代謝紊亂模型

AMD 的特征是RPE 沉積物的積累,這些沉積主要由脂質(zhì)組成。脂蛋白通過BM 將膽固醇運送到RPE 和光感受器,或從RPE 和光感受器轉(zhuǎn)運膽固醇。脂蛋白積聚會損害脈絡膜毛細血管和RPE 之間跨越BM 的營養(yǎng)交換,并損害視網(wǎng)膜功能[62]。通過基因敲除或改變飲食等方法誘導動物視網(wǎng)膜變性,進一步支持了這一機制參與AMD。

3.1 載脂蛋白E基因敲除模型

載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)存在3 種亞型(ApoE 2,ApoE 3 和ApoE 4)。Souied 等[63]研究解釋了ApoE 在AMD 發(fā)病過程中的保護機制。ApoE-/-小鼠在高脂喂養(yǎng)8 周后,出現(xiàn)了與年齡相關(guān)的視網(wǎng)膜變性改變[64-65],并伴有BM 增厚和視網(wǎng)膜下沉積。Espinosa-Heidmann 等[66]研究報道,暴露于藍綠光后,喂食高脂飲食的小鼠視網(wǎng)膜退化速度加快。Miura 等[67]對比ApoE-/-小鼠與Nrf2-/-小鼠發(fā)現(xiàn),11 月齡ApoE-/-小鼠BM 內(nèi)脂質(zhì)沉積更多。該模型僅適用于探討ApoE 在早期AMD中的表現(xiàn)。

3.2 人源化載脂蛋白轉(zhuǎn)基因模型

為模擬和研究人類中的各種ApoE基因,有研究使用各種人類ApoE(即ApoE1,ApoE2和ApoE3)取代原生小鼠的ApoE等位基因,制備了人源化轉(zhuǎn)基因動物[68-69]。其中,Levy 等[68]對比了e2,e3 和e4 轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn),與e3 和e4 相比,e2 小鼠產(chǎn)生了年齡依賴性視網(wǎng)膜下單核巨噬細胞積聚,與e3小鼠相比,12 月齡e2 小鼠視網(wǎng)膜外核層變薄,眼內(nèi)ApoE 表達水平顯著高于e3 和e4 小鼠;而e4 型小鼠視網(wǎng)膜下炎細胞浸潤程度降低,這可能與ApoE e4 等位基因抑制ApoE 水平,減少先天免疫受體復合體(innate immunity receptor complex,IIRC)激活和炎癥有關(guān)。這一不同在Wickremasinghe 等[70]的研究中也有提及。

3.3 ApoB100轉(zhuǎn)基因模型+高脂飼料

ApoB100 是低密度脂蛋白(low-density lipo?protein,LDL)膽固醇中的主要載脂蛋白,在RPE 中高度表達。Fujihara 等[71]對人類ApoB轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn),2 月齡轉(zhuǎn)基因小鼠僅在急性藍綠色激光照射時會形成基底層狀沉積物,經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后,12月齡轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)色素丟失,在BM上可見層狀沉積物,比喂食高脂飲食的野生型小鼠更厚。電鏡表明,視網(wǎng)膜組織胞質(zhì)內(nèi)有大量空泡,RPE 出現(xiàn)明顯萎縮。而喂食高脂飼料的小鼠表現(xiàn)出少量的細胞質(zhì)空泡,基底層生理折疊減少,外膠原層沉積物和薄而均勻的基底層沉積物。

3.4 人類白細胞分化抗原36敲除模型

人類白細胞分化抗原36(cluster of differentia?tion 36,CD36)也被稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶,是一種膜糖蛋白,負責識別和結(jié)合特定的氧化型LDL、氧化型磷脂和長鏈脂肪酸,然后轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。在視網(wǎng)膜中,RPE 大量表達CD36,并參與氧化POS 的識別和吞噬。CD36 的表達調(diào)節(jié)RPE 中環(huán)氧合酶2和血管內(nèi)皮生長因子的表達。CD36 缺乏會導致緩慢的、與年齡相關(guān)的脈絡膜退化和輕度視網(wǎng)膜變性[46]。12 月齡CD36-/-小鼠氧化LDL 積累,導致BM 增厚、BM 脂質(zhì)沉積和光感受器死亡[72]。而4 月齡轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)檢測到年齡依賴性沉積碎片。通過CD36 激動劑治療,可顯著降低血漿膽固醇水平,防止RPE沉積物的積累和BM增厚。

3.5 低密度脂蛋白注射模型

Yin 等[73]研究表明,7 d 持續(xù)iv給予LDL 可導致視網(wǎng)膜變性。模型大鼠表現(xiàn)出與AMD 相似的特征,如RPE 色素改變,BM 增厚,視網(wǎng)膜TUNEL 陽性細胞、炎細胞浸潤和視網(wǎng)膜敏感性降低。暗適應ERG 顯示a 波和b 波振幅顯著降低,表明光感受器退化。該模型的性狀改變與人類早期AMD 改變相似,適用于早期干性AMD 研究,而與人類AMD 不同,光感受器最先改變,且未觀察到基底層沉積。

3.6 LDL受體敲除小鼠+高脂飼料

LDLR缺陷小鼠在攝入脂肪后會進一步增加BM中的脂質(zhì)顆粒積累[74]。Bretillon 等[75]觀察14 月齡LDLR-/-小鼠發(fā)現(xiàn),小鼠的暗視和明視b 波幅度顯著降低(在25 cd·s·m-2時為-60%),視網(wǎng)膜色素上皮細胞基底層積聚。喂食高脂飲食后,LDLR-/-小鼠表現(xiàn)出以BM 增厚和半透明物質(zhì)沉積為特征的BM 異常,這可能是與AMD 患者中觀察到的基底層狀沉積物和玻璃疣類似。

4 結(jié)語與展望

理想的AMD 動物模型應能最大化模擬人類干性AMD 的臨床表現(xiàn)、發(fā)展過程與病理改變。非人靈長類是目前較為理想的實驗動物,其眼球解剖結(jié)構(gòu)與人最為相似,且具備黃斑區(qū),其實驗數(shù)據(jù)具有重要臨床價值,是最為理想的實驗動物,適用于藥物臨床前毒理學、藥效學和藥理學的研究,但存在成本高、難以獲取、個體差異大等限制。而嚙齒類動物根據(jù)實驗目的采用不同造模方法可模擬出晚期或早期人類疾病改變而被廣泛使用,其造模周期短、繁殖快,其遺傳背景明確,具備較為完整的基因信息和成熟的基因敲除技術(shù),可幫助深入探索氧化損傷、脂代謝失調(diào)、炎癥反應與干性AMD 的相互作用。但由于無黃斑區(qū),病理表現(xiàn)與人存在一定差異等因素而限制其發(fā)展與使用。家兔適應性好,繁殖力強,來源廣,兔眼較大,便于手術(shù)和觀察。與嚙齒類動物相比,兔眼更接近人的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),但解剖結(jié)構(gòu)無黃斑區(qū)即為其最大弊端。

環(huán)境性誘導通過改變動物飼養(yǎng)環(huán)境或飲食來誘導AMD 模型,如光誘導模型、高脂飼料誘導模型和CSE 誘導模型,具有周期短、成本低、發(fā)病機制與人類似等特點,適用于批量造模,能模擬人類早期病理改變,但維持時間短、不能體現(xiàn)年齡依賴性等缺陷限制其大范圍使用。藥物誘導通過玻璃體腔給藥、視網(wǎng)膜下給藥等方式,選擇某一藥物損傷視網(wǎng)膜來誘導AMD 模型,如NaIO3誘導模型、PEG 誘導模型和CEP 誘導模型,該類方法具有方法簡單、可重復性高、成本低、成模率高、模型穩(wěn)定等特點,但需重復給藥,易破壞眼組織,對于施術(shù)者要求一定技術(shù)水平,可能造成眼內(nèi)炎、視網(wǎng)膜脫落等不良反應?;蚯贸哉T導,如ApoE-/-模型、CFH-/-模型和SOD-/-模型,病理表現(xiàn)與人極為相似,存在年齡依賴性,可用于觀察AMD 病理改變的全過程,適用于研究AMD 的形成機制,但造模周期長,成本高,技術(shù)難度高。

綜上所述,盡管造模方法眾多,但每種模型存在不同的劣勢與優(yōu)點,而相對重現(xiàn)性好的模型也不免存在過程復雜、造價高昂、可靠性受到質(zhì)疑等缺點。因此需要進一步研究,尋找更為理想的AMD模型,為未來AMD 發(fā)病機制研究和進一步優(yōu)化非臨床藥物篩選提供新平臺。

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