李曼，劉偉江，袁福臨，白海濤，李雪，王洋，劉元林，焦宏，張毅

（1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北張家口 075000；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一種起源于中胚層具有良好多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其來源廣泛，可自骨髓、臍帶、臍帶血、胎盤、牙髓和脂肪等多種組織中分離獲得，可分化為骨、軟骨、脂肪、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。由于具有自我更新和多向分化潛能，MSC被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞，其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用也成為研究的熱點(diǎn)［1-2］。相對其他來源的MSC，人臍帶來源MSC（human umbilical cord-derived MSC，hUCMSC）具有取材方便、免疫原性小、多潛能特性在體外保留時間長等優(yōu)點(diǎn)，每厘米臍帶含約4×105MSC，數(shù)量遠(yuǎn)高于骨髓，因而被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)的候選細(xì)胞，在組織工程和細(xì)胞療法中受到廣泛關(guān)注［3］。

MSC 可在特定的組織內(nèi)環(huán)境下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞，其向成脂和成骨分化是一個動態(tài)平衡過程，不同的誘導(dǎo)分化條件會改變MSC的微環(huán)境，調(diào)控其向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的分化平衡［4-5］。當(dāng)此平衡被打破，尤其是成脂分化能力占優(yōu)勢時，會引起骨質(zhì)疏松和年齡相關(guān)性骨丟失等骨代謝方面的疾?。?］。因此，近年來關(guān)于如何調(diào)控MSC 分化能力并維持成脂與成骨細(xì)胞的分化平衡成為關(guān)注熱點(diǎn)，為更好地治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過MSC 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序發(fā)現(xiàn)，殼多糖酶3 樣蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）基因在hUC-MSC 中高表達(dá)，且生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其可參與MSC多向分化調(diào)控。CHI3L1是哺乳動物幾丁質(zhì)酶基因家族成員，其編碼的蛋白是分泌型糖蛋白，與殼質(zhì)酶同屬18 糖基水解酶家族，是Johansen 等［7］于1992 年在人軟骨瘤細(xì)胞MG63 中發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為40 000 的蛋白質(zhì)。以往研究表明，在一些諸如支氣管哮喘、肺炎和腦膜炎等炎性疾病中，CHI3L1 均發(fā)揮一定的生物學(xué)作用［8］。CHI3L1 還參與輔助性T 細(xì)胞2（helper T cells 2，Th2）和Th17 細(xì)胞及白細(xì)胞介素18 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和組織纖維化過程，抑制Ⅰ型免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性［9］。亦有研究表明，CHI3L1對內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞功能均有一定的誘導(dǎo)作用［10］。

CHI3L1 參與Smads 通路形成，激活轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）下游的信號通路等，且這些通路均與MSC 成脂和成骨分化功能密切相關(guān)［11］，但關(guān)于CHI3L1 調(diào)控MSC 多向分化作用的研究目前尚未見報道。為此，本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定敲低CHI3L1的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染hUC-MSC，觀察CHI3L1 對hUC-MSC 成脂和成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

hUC-MSC，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所。胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖溶液、0.25%胰酶、FITC-抗人CD14 或APC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34 或APC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45或APC-抗人CD45、PE-抗人CD105、RIPA 裂解液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和ECL 化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司；吉姆薩染液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；10%中性甲醛和異丙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；慢病毒載體由吉凱基因生物工程有限公司構(gòu)建；實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1；吲哚美辛、嘌呤霉素鹽酸鹽、地塞米松、紅油O 粉、胰島素、維生素C 磷酸鹽、β-磷酸甘油、丙酮溶液、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobuty-1-methylxanthine，IBMX）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染液和TRIzol試劑，美國Sigma公司；兔抗人CHI3L1單克隆抗體和小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體，美國Cell Signaling 公司；RTase M-MLV、RNA 酶抑制劑、dNTP、5×RTase M-MLV 緩沖液、Oligo dT 和隨機(jī)引物，日本TaKaRa 公司；DTT、ddH2O 和2×Ultra SYBR 混合物，康為世紀(jì)有限公司。梯度PCR 儀、7500 Real time system 和低溫高速離心機(jī)，美國ThermoFisherScientific公司；倒置顯微鏡（CKX53SF-R）和熒光顯微鏡（U-LH100HG），日本Olympus 公司；酶標(biāo)儀（Bio-Tek）和流式細(xì)胞儀（BD FACSCali?burTM），美國BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，新加坡ESCO 科技有限公司。

Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR(RT-qPCR)

1.2 hUC-MSC培養(yǎng)和鑒定［12］

復(fù)蘇的P2 代hUC-MSC 接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)約80%棄培養(yǎng)基，PBS 潤洗2 次，0.125%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液；離心（110×g，10 min），用α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

取3×105細(xì)胞接種于35 mm 平皿中，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型，流式抗體為FITC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45和PE-抗人CD105。其他細(xì)胞接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

取部分hUC-MSC 接種于6 孔板，按文獻(xiàn)［13］進(jìn)行誘導(dǎo)分化。成脂誘導(dǎo)分化體系為：地塞米松1 μmol·L-1，胰島素10 μg·L-1，IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛0.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)分化14 d。成骨誘導(dǎo)分化體系為：地塞米松0.1 μmol·L-1，維生素C磷酸鹽50 μmol·L-1和β?磷酸甘油10 mmol·L-1，誘導(dǎo)分化12 d。分別采用油紅O 染色和ALP 染色檢測成脂和成骨分化能力，RT-qPCR 檢測成脂和成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA 表達(dá)，即脂肪酶（adipsin，ADI）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxi?some proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）mRNA 表達(dá)及ALP和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）mRNA表達(dá)。

1.3 穩(wěn)定敲低CHI3L1的慢病毒載體感染hUC-MSC和鑒定

構(gòu)建含有shCHI3L1基因序列（ACCCACAT?CATCTACAGCTTT）和對照基因序列（TTCTCC?GAACGTGTCACGT）及綠色熒光蛋白（green fluo?rescent protein，GFP）基因和嘌呤霉素抗藥基因的慢病毒載體（shCHI3L1）和對照載體（shNC）并收獲慢病毒。將培養(yǎng)的P3 代hUC-MSC 按每孔1×105接種于6 孔板，分為細(xì)胞對照組、shNC-MSC 組和shCHI3L1-MSC 組，shNC-MSC 組和shCHI3L1-MSC 組感染病毒載量均為1×1010L-1，病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）=10；細(xì)胞對照組未加慢病毒懸液。感染24 h 后，各組棄原培養(yǎng)基，更換為α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），并進(jìn)行嘌呤霉素抗藥基因的篩選，嘌呤霉素濃度為2 mmol·L-1。篩選72 h，待細(xì)胞對照組無存活細(xì)胞，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 組更換為α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)并擴(kuò)增細(xì)胞。

設(shè)hUC-MSC 細(xì)胞對照組，將hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 培養(yǎng)至融合度約80%，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；熒光顯微鏡觀察GFP 表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP+細(xì)胞百分率，鑒定轉(zhuǎn)染效率；收集各組細(xì)胞分別提取總RNA和蛋白質(zhì)，RT-qPCR 和Western 印跡法檢測CHI3L1 mRNA和蛋白表達(dá)。

1.4 吉姆薩染色鑒定hUC-MSC，shCHI3L1-MSC和shNC-MSC細(xì)胞形態(tài)［13］

P2 代hUC-MSC 或P3 代hUC-MSC，shNCMSC 和shCHI3L1-MSC 接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%，用0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心（110×g，10 min），細(xì)胞計(jì)數(shù)；取3×105細(xì)胞接種于35 mm平皿中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度約80%時進(jìn)行吉姆薩染色并拍照。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC表面標(biāo)志物

收集P2 代或P3 代hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC，制備成單細(xì)胞懸液，每管200 μL，加流式抗體（FITC-抗人CD14/APC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34/APC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45/APC-抗人CD45或PE-抗人CD105）避光孵育30 min；用1 mL PBS洗2次，加PBS 400 μL重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 RT-qPCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

TRIzol 法提取細(xì)胞RNA，測定RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，程序?yàn)?0 ℃，10 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。以Master Mix、雙蒸水、cDNA和引物配制qPCR 體系，每管20 μL，置qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)；檢測CHI3L1，ADI，PPAR-γ，ALP和OPNmRNA 表達(dá)。2-△△Ct表示待測基因mRNA相對表達(dá)水平。

1.7 Western印跡法檢測CHI3L1蛋白表達(dá)水平

用含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞團(tuán)沉淀，離心取蛋白上清液并定量，加入25%蛋白體積比的5×SDS 緩沖液，99 ℃煮沸10 min；制備10%膠板，分別加入各組蛋白樣品（20 μg），SDS-PAGE凝膠電泳約90 min；60 V轉(zhuǎn)膜180 min；PVDF 膜置5%脫脂奶粉封閉1 h，分別與兔抗人CHI3L1 單抗和小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體孵育12 h；TBST 洗3 次，與山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）孵育1 h，TBST 洗3 次，顯影，拍照，用Image J 軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。CHI3L1 蛋白表達(dá)水平用CHI3L1 條帶與GAPDH條帶積分吸光度比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC的鑒定

顯微鏡下觀察，培養(yǎng)的hUC-MSC 呈均一的長梭形、漩渦狀貼壁生長；經(jīng)吉姆薩染色，可見細(xì)胞核呈圓形或橢圓形（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型結(jié)果表明，hUC-MSC 高表達(dá)CD73，CD90 和CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD14，CD34 和CD45（圖1B）。油紅O染色結(jié)果顯示，hUC-MSC經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后，誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)紅色花環(huán)樣脂滴（圖1C1）；RT-qPCR 檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)組成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ADI和PPAR-γmRNA 相對表達(dá)顯著高于細(xì)胞對照組（P<0.01）（圖1C2）。hUC-MSC 經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，ALP 染色結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯高于細(xì)胞對照組（圖1D1）；RT-qPCR檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)組成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ALP和OPNmRNA 表達(dá)亦明顯高于細(xì)胞對照組（P<0.01）（圖1D2）。上述結(jié)果提示，培養(yǎng)的hUC-MSC 符合國際認(rèn)證的MSC評判標(biāo)準(zhǔn)［14］。

Fig.1 Identification of cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUC-MSCs）. A：Giamsa staining，cell morphology observed under a microscope；B：cell phenotype examined by flow cytometry；C：adipogenic differentiation ability detected by oil red O staining（C1）and RT-qPCR（C2）；D：osteogenic differentiation ability assessed by ALP staining（D1）and RT-qPCR（D2）.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group.

2.2 shCHI3L1-MSC的鑒定

2.2.1 慢病毒感染hUC-MSC的效率

慢病毒感染hUC-MSC 并培養(yǎng)8 d，倒置顯微鏡下觀察可見，hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC均呈均一的長梭形、纖維樣且漩渦狀貼壁生長（圖2A）。熒光顯微鏡下觀察可見，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 出現(xiàn)大量綠色熒光，而hUC-MSC未見熒光（圖2B）。流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，未轉(zhuǎn)染病毒的hUC-MSC 組GFP+細(xì)胞百分率為（1.8±1.2）%，shNC-MSC 組為（90.1±4.4）%，shCHI3L1-MSC組為（92.7±1.4）%（圖2C）。

Fig.2 Efficiency of lentivirus transfection for hUC-MSCs and CHI3L1 mRNA and protein expressions in shNC-MSCs and shCHI3L1 MSCs. A lentiviral vector (shCHI3L1) containing shCHI3L1 gene sequence, fluoresecent protein (GFP) of gene and purinomycin resistance gene and control vector (shNC) was constructed and transfected with P3 generation HUC-MSCs. After 72 h filtration and using puromycin (2 mmol·L-1) resistance gene , shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs were obtained. A: morphology observed under a inverted microscope;B:GFP expression cells identified by a fluorescent microscope;C:GFP+cell percent assessed by flow cytometry;D: the mRNA expression of CHI3L1 analyzed by RT-qPCR；E: the protein expression of CHI3L1 detected by Western blotting. ±s, n=3.＊＊P<0.01,compared with sh-NC-MSC group.

2.2.2 shCHI3L1-MSC 中CHI3L1 mRNA 和蛋白表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，shCHI3L1-MSC 中CHI3L1mRNA 表達(dá)顯著低于hUC-MSC 和shNC-MSC（圖2D）。Western 印跡法結(jié)果表明，與hUC-MSC 和shNC-MSC 相比，shCHI3L1-MSC CHI3L1 蛋白表達(dá)明顯降低（圖2E）。以上結(jié)果提示，帶有shCHI3L1敲減序列的慢病毒可高效感染hUC-MSC，且可有效敲低CHI3L1在hUC-MSC的表達(dá)。

2.2.3 shNC-MSC和shCHI3L1-MSC生物學(xué)特性

經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 在形態(tài)上仍呈長梭形、漩渦狀貼壁生長（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型結(jié)果顯示，其高表達(dá)CD73，CD90 和CD105，不表達(dá)或低表達(dá)CD14，CD34 和CD45（圖3B）。shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC體外成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14 d，油紅O染色結(jié)果顯示，細(xì)胞對照組未見紅色脂滴，誘導(dǎo)組可見較多的紅色脂滴（圖4A1）；RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ADI和PPAR-γmRNA表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞對照組（P<0.01）（圖4A2）。shNCMSC 和shCHI3L1-MSC 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)12 d，ALP 染色結(jié)果表明，誘導(dǎo)組ALP 活性明顯高于細(xì)胞對照組（圖4B1）；RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ALP和OPNmRNA 表達(dá)水平顯著高于細(xì)胞對照組（P<0.05，P<0.01）（圖4B2）。

Fig.3 Morphology and phenotype of shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A: Giemsa staining，morphology observed under a microscope；B:the phenotype assessed by flow cytometry.

Fig.4 Adiopogentic（A）and osteopogentic（B）differentiation abilities of shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1：oil red O staining；A2：expression of PPAR-γ and ADI mRNA；B1：ALP staining；B2：expression of OPN and ALP mRNA. ±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group.

2.3 shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 成脂分化能力的差異

將shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化14 d，油紅O 染色結(jié)果顯示，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 誘導(dǎo)組均有脂滴出現(xiàn)，shCHI3L1-MSC 組脂滴數(shù)量明顯多于shNC-MSC 組（圖5A1）。經(jīng)Image J 統(tǒng)計(jì)脂滴數(shù)目，shCHI3L1-MSC誘導(dǎo)組明顯多于shNC-MSC 誘導(dǎo)組（P<0.01）（圖5A2）；RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，兩誘導(dǎo)組PPAR-γ和ADImRNA 表達(dá)均高于細(xì)胞對照組（P<0.01），shCHI3L1-MSC 誘導(dǎo)組PPAR-γ和ADImRNA 表達(dá)明顯高于shNC-MSC 誘導(dǎo)組（P<0.01）（圖5B1 和B2）。以上結(jié)果表明，敲低CHI3L1后hUC-MSC 成脂分化能力增強(qiáng)，CHI3L1 可抑制hUC-MSC 成脂分化。

Fig.5 Comparison of adipogentic ability in shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1: oil red O staining; A2: the number of lipid droplets analyzed by Image J; B1 and B2: expressions of PPAR-γ and ADI mRNA，respectively. ±s, n=3. ＊＊P<0.01,compared with cell control group；##P<0.01，compared with shNC-MSC induced group.

2.4 shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 成骨分化能力的差異

將shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化12 d，ALP 染色結(jié)果顯示，兩誘導(dǎo)組ALP 活性明顯高于細(xì)胞對照組（P<0.01），而shCHI3L1-MSC 誘導(dǎo)組明顯低于shNC-MSC 誘導(dǎo)組（P<0.01）（圖6A1 和A2）；RT-qPCR 檢測結(jié)果（圖6B1 和B2）顯示，兩誘導(dǎo)組成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OPN和ALPmRNA 表達(dá)明顯高于細(xì)胞對照組（P<0.01），shCHI3L1-MSC誘導(dǎo)組亦明顯低于shNC-MSC誘導(dǎo)組（P<0.01）。以上結(jié)果表明，敲低CHI3L1后hUC-MSC成骨分化能力降低，CHI3L1 可增強(qiáng)hUC-MSC 成骨分化。

Fig.6 Comparison of osteogenic ability in shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1：ALP staining；A2：ALP activity analyzed by Image J；B1 and B2：expressions of OPN and ALP mRNA，respectively. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with shNC-MSC induced group.

3 討論

MSC 的定向分化能力是其發(fā)揮組織修復(fù)與再生作用的重要基礎(chǔ)。在MSC 分化過程中，成骨分化與成脂分化呈負(fù)相關(guān)性，正常生理狀態(tài)下MSC成脂與成骨分化處于動態(tài)平衡狀態(tài)。臨床研究表明，當(dāng)機(jī)體發(fā)生諸如卵巢功能低下或大劑量糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的股骨頭壞死或老年性骨質(zhì)疏松等疾病時，MSC 功能明顯下降，其增殖活性和分化能力明顯降低［15］。此時外源性應(yīng)用MSC 或通過誘導(dǎo)自身MSC增強(qiáng)成骨分化且抑制成脂分化，將有助于機(jī)體骨骼重建和恢復(fù)。因此，闡明MSC 向成骨和成脂細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制可為此類疾病的治療提供新的治療策略。以往對MSC 成骨和成脂定向分化的研究主要關(guān)注改變各種因子、藥物種類或調(diào)整誘導(dǎo)劑各成分濃度等［16］。在MSC 誘導(dǎo)分化過程中，當(dāng)?shù)厝姿墒褂脻舛?1×10-8mol·L-1時，可使成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2（Runt-related transcrip?tion factor 2）表達(dá)顯著降低，進(jìn)而顯著抑制MSC 成骨分化。同時，由于成骨分化能力降低，又促進(jìn)成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ 和C/EBP 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MSC成脂分化。因此，選擇誘導(dǎo)劑的合適濃度對有效控制MSC定向分化至關(guān)重要。

MSC 向成骨和成脂細(xì)胞分化是一個精細(xì)而復(fù)雜的過程，需要多種轉(zhuǎn)錄因子和多個信號通路參與調(diào)控［17］，具體機(jī)制尚不十分清楚。目前關(guān)于某一特定基因?qū)SC 成脂和成骨定向分化調(diào)控的研究少有報道。本研究觀察CHI3L1 對hUC-MSC 成脂和成骨分化平衡的調(diào)控作用。首先，利用慢病毒載體穩(wěn)定敲低hUC-MSC 中的CHI3L1基因，驗(yàn)證其對hUC-MSC 生物學(xué)特性和誘導(dǎo)分化能力的影響。結(jié)果表明，敲低CHI3L1的hUC-MSC 即shCHI3L1-MSC 仍具有成脂和成骨分化能力。體外成脂和成骨誘導(dǎo)分化過程中，shCHI3L1-MSC 形成的紅色脂滴和ALP 活性均高于未誘導(dǎo)組，且成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和ADImRNA 表達(dá)及成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ALP和OPNmRNA 表達(dá)均顯著高于未誘導(dǎo)組。

研究表明，Wnt信號通路在MSC成脂和成骨分化平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用，激活的Wnt 信號通路可促進(jìn)MSC 成骨分化并抑制其成脂分化［18］。在MSC 的培養(yǎng)基內(nèi)加入Wnt 信號傳導(dǎo)抑制劑Dick?kopf-1 后，調(diào)控成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和ALPmRNA 表達(dá)水平顯著降低，同時成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γmRNA 表達(dá)顯著升高［19］。此外，CHI3L1可激活Wnt/β連環(huán)蛋白（catenin）信號通路，并通過IL-13/Rα2 依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)氧化損傷、細(xì)胞凋亡、抗菌反應(yīng)及黑色素瘤轉(zhuǎn)移［20］。本研究結(jié)果表明，shCHI3L1-MSC 成脂誘導(dǎo)分化后，紅色脂滴數(shù)目及成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和ADImRNA 表達(dá)顯著高于shNC-MSC；而成骨誘導(dǎo)分化后，其ALP 活性及成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OPN和ALDmRNA 表達(dá)明顯低于shNC-MSC。由此提示，CHI3L1可能通過Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路調(diào)控hUC-MSC成脂和成骨分化平衡。

綜上，本研究結(jié)果表明，CHI3L1參與hUC-MSC的分化調(diào)控，抑制其成脂分化，促進(jìn)其成骨分化。將CHI3L1 作為調(diào)控MSC 成脂分化及多向分化的新靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究，將為MSC治療成脂與成骨平衡失調(diào)所導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎、骨折不愈合、原發(fā)和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等多種骨代謝相關(guān)疾病及脂肪組織移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，且有助于提高M(jìn)SC治療的精準(zhǔn)性和靶向性。