張悅東 孫平平 李小燕 楊榮 王寶俠 張磊 李正男

摘要：【目的】明確通遼地區(qū)塞外紅蘋果（Malus pumila‘Saiwaihong）中蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）、蘋果莖痘病毒（ASPV）和蘋果莖溝病毒（ASGV）3 種蘋果潛隱病毒的普遍率和遺傳多樣性?！痉椒ā繌耐ㄟ|市開魯縣8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機(jī)采集了96 份塞外紅蘋果枝條，采用RT-PCR法對樣品進(jìn)行3 種蘋果潛隱病毒檢測。對檢測為陽性的樣品進(jìn)行病毒基因克隆、測序，并進(jìn)行序列一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析?！窘Y(jié)果】檢測結(jié)果表明，被檢測的塞外紅蘋果中3 種蘋果潛隱病毒均有不同程度的發(fā)生，并且存在2 種或3 種病毒的復(fù)合侵染?；贑P基因?qū)Σ《疽恢滦院妥儺惽闆r進(jìn)行分析，結(jié)果表明，來源于塞外紅蘋果的29 個(gè)ACLSV分離物的核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，與其他15 個(gè)已知的ACLSV分離物的一致性為69.1%～93.6%；來源于塞外紅蘋果的12 個(gè)ASPV分離物的核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，與其他15個(gè)已知的ASPV 分離物的一致性為75.4%～91.5%；來源于塞外紅蘋果的21 個(gè)ASGV分離物的核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，與其他已知的40 個(gè)ASGV分離物的一致性為89.9%～98.9%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，44 個(gè)ACLSV分離物聚集在7 個(gè)主支，其中29 個(gè)塞外紅蘋果的ACLSV分離物分別位于JB 組、Balatonl 組、B6 組和一個(gè)獨(dú)立分支；27 個(gè)ASPV分離物聚集為6 支，其中12 個(gè)塞外紅蘋果的ASPV分離物分別位于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ組；61 個(gè)ASGV分離物聚集為8 個(gè)支，其中塞外紅蘋果的21 個(gè)ASGV分離物聚集在一起，形成獨(dú)立分支?！窘Y(jié)論】ACLSV、ASGV、ASPV均能侵染塞外紅蘋果，并且發(fā)生率較高。與其他來源的病毒相比，塞外紅蘋果的3 種病毒分離物，各種內(nèi)各分離物彼此之間的序列一致性較好并且進(jìn)化關(guān)系較近。研究結(jié)果為塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)綠色、健康、持續(xù)發(fā)展提供基本理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：塞外紅蘋果；RT-PCR；蘋果褪綠葉斑病毒；蘋果莖痘病毒；蘋果莖溝病毒

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0978-10

塞外紅蘋果又名雞心果，是由通遼市林業(yè)和草原科學(xué)研究所王寶俠研究員團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)20多年自主選育出的小蘋果新品種，是內(nèi)蒙古自治區(qū)首個(gè)通過中國森林認(rèn)證的經(jīng)濟(jì)林樹種。因?yàn)槿饧t蘋果具有適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)性好、抗逆性強(qiáng)、果實(shí)色澤艷麗、口味香甜、耐貯藏等特性，已經(jīng)發(fā)展成為內(nèi)蒙古自治區(qū)種植面積最大的蘋果品種之一。目前，在內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市種植面積約為2 萬hm2，成為當(dāng)?shù)毓r(nóng)的主要收入來源。另外，在遼寧、河北、山東、甘肅等省也有引種。

蘋果褪綠葉斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）和蘋果莖溝病毒（apple stem grooving virus，ASGV）是蘋果上發(fā)生率最高的3 種病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生[1]。1959 年，Mink 等[2]等首次報(bào)道了蘋果上發(fā)生ACLSV。隨后發(fā)現(xiàn)ACLSV還侵染梨、桃、山楂等果樹[3-5]。1954 年，Smith[6]在出現(xiàn)莖痘斑和壞死癥狀的蘋果砧木上發(fā)現(xiàn)了ASPV，近年發(fā)現(xiàn)ASPV 在梨、山楂、櫻桃、枇杷等果樹上都會(huì)發(fā)生[7-9]。Lister 等[10]于1965 年最先在蘋果上發(fā)現(xiàn)ASGV，伴隨著RT-PCR和siRNA 高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，ASGV的寄主范圍從薔薇科果樹上擴(kuò)展到百合、月季、竹等觀賞植物[11-14]。這3 種蘋果病毒單獨(dú)侵染時(shí)，在大多數(shù)商業(yè)蘋果品種上不引起明顯癥狀，但復(fù)合侵染時(shí)可以引起蘋果樹“高接病”、樹勢衰退、果實(shí)畸形、皺縮等，是蘋果無病毒苗木生產(chǎn)中需要脫除的對象。伴隨著塞外紅蘋果種植面積的不斷擴(kuò)大，病毒侵染導(dǎo)致蘋果品質(zhì)下降已成為制約塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，開展3 種病毒的檢測和分子變異研究，對塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義，也將為無病毒苗木生產(chǎn)提供指導(dǎo)數(shù)據(jù)。

筆者在本研究中采用RT-PCR對采自內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的96份塞外紅蘋果樣品進(jìn)行了檢測及分析，明確了通遼市塞外紅蘋果中3 種蘋果潛隱病毒的發(fā)生情況和遺傳多樣性。

1 材料和方法

1.1 供試材料

2021 年2 月25 日在開魯縣的開魯鎮(zhèn)、大榆樹鎮(zhèn)、建華鎮(zhèn)、小街基鎮(zhèn)、東風(fēng)鎮(zhèn)、東來鎮(zhèn)、麥新鎮(zhèn)、吉日嘎郎吐鎮(zhèn)等8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集了96 份塞外紅蘋果枝條樣品（每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機(jī)采集12 份），選擇15～20 cm長的一年生枝條，用石蠟封口，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1 主要試劑 TaKaRa MiniBEST plant RNAExtraction Kit[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]、M5 超光速mix（北京聚合美生物科技有限公司）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、零背景pTOPO-TA克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）、E.coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]等；具體實(shí)驗(yàn)操作步驟根據(jù)試劑盒說明書完成。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 生工Sangon Biotech 臺式高速微量離心機(jī)（Hico21）、電子天平、海爾醫(yī)用低溫保存箱、Scllogex sloloe 離心機(jī)、渦輪振蕩機(jī)、臥式冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜、恒溫水浴鍋、微波爐、Allsheng 微量分光光度計(jì)（Nano-300）、微型渦旋混合儀、流水式制冰機(jī)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、BIO-RAD Thermal Cycler、移液槍、DLAB數(shù)顯恒溫金屬浴。

1.3 方法

1.3.1 植物總RNA 提取 按照TaKaRa MiniBESTplant RNA Extraction Kit 說明書步驟，從植物枝條中提取總RNA。得到的總RNA使用Allsheng 微量分光光度計(jì)（Nano-300）進(jìn)行濃度和純度的測定。存放于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈 以提取的樣品總RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，過程如下：1 μL 隨機(jī)引物（50 μmoL · L- 1）、1 μL dNTP（10 mmoL·L-1）、1.5 μL模板RNA、6.5 μL無酶水，將反應(yīng)液放入PCR儀內(nèi)65 ℃ 5 min；冰上迅速冷卻后繼續(xù)加入4 μL 5 × PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μLRNase Inhibitor（40 U · μL- 1）、1 μL PrimeScript Ⅱ RTase（200 U·μL-1）、4.5 μL無酶水。將上述20 μL反應(yīng)液輕輕混勻，放入PCR 儀內(nèi)42 ℃ 30 min、70 ℃15 min后，取出冷卻。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以在-20 ℃冰箱保存。

1.3.3 病毒基因組克隆 （1）引物設(shè)計(jì)。根據(jù)NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫中存儲的ACLSV、ASGV、ASPV基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)了3 對病毒檢測引物（表1）。ACLSV1-F/R 用于擴(kuò)增ACLSV 的部分復(fù)制蛋白和部分移動(dòng)蛋白基因；ASPV1-F/R用于擴(kuò)增ASPV的部分外殼蛋白基因和3非編碼區(qū)；ASGV1-F/R 用于擴(kuò)增ASGV的部分移動(dòng)蛋白和外殼蛋白基因。

（2）病毒基因片段擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，使用2×M5 Hiper 超光速mix 分別擴(kuò)增ACLSV、ASPV、ASGV 基因片段。擴(kuò)增體系如下：10 μL 2×M5 Hipor 超光速mix、1 μL 上游引物、1 μL下游引物、5 μL cDNA、3 μL 無酶水。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，35 次循環(huán)：94 ℃變性25 s、退火25 s（ACLSV 61 ℃ ，ASPV 58 ℃ ，ASGV 58 ℃）、72 ℃延伸（ACLSV 60 s，ASPV 30 s，ASGV 30 s），72 ℃補(bǔ)平5 min。

（3）PCR 產(chǎn)物的純化、克隆及序列測定。將檢測到的ACLSV、ASGV、ASPV 目標(biāo)片段純化回收，純化后的PCR產(chǎn)物用pTOPO-TA試劑盒進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞并涂板。對培養(yǎng)出來的單個(gè)菌落進(jìn)行PCR 菌液鑒定。每個(gè)樣品隨機(jī)挑選3 個(gè)陽性克隆菌液送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.3.4 序列一致性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。運(yùn)用軟件Vector NTI Advance 11（Invitrogen Corporation，CA，USA）對測序結(jié)果進(jìn)行分析和拼接；使用SDT 軟件CLE序列比對程序?qū)y序基因序列與參考基因序列進(jìn)行兩兩比對，參考序列均從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載[15]。用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，處理序列采用ClustalW 算法進(jìn)行比對，選用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展校正值為1000，其他均為軟件默認(rèn)值[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的檢出率

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，96 份塞外紅蘋果枝條樣品中，有29 份樣品攜帶ACLSV，檢出率為30.2%；有12 份樣品攜帶ASPV，檢出率為12.5%；有21 份樣品攜帶ASGV，檢出率為22.0%。通過對每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的病毒檢出率比較，ACLSV檢出率最高的地區(qū)在開魯縣開魯鎮(zhèn)，為66.7%；ASPV 檢出率最高的地區(qū)在開魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)，為41.7%；ASGV檢出率最高的地區(qū)在開魯縣開魯鎮(zhèn)，為58.3%（表2）。在所采集的96份塞外紅蘋果枝條樣品中，有4份樣品同時(shí)攜帶ACLSV、ASPV 和ASGV，檢出率為4.2%；有4 份樣品同時(shí)攜帶ACLSV和ASPV，檢出率為4.2%；有13 份樣品同時(shí)攜帶ACLSV和ASGV，檢出率為13.5%；有3 份樣品同時(shí)攜帶ASPV和ASGV，檢出率為3.1%（表3）。

2.2 序列一致性分析

筆者在本研究中共獲得29 個(gè)來源于塞外紅蘋果的ACLSV 分離物（GenBank 登錄號：ON001687～ON001715），核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，其中ACLSV Kailu4-8（ON001702）與Kailu5-1（ON001704）的核苷酸序列一致性最高，為99.9%；Kailu3- 12（ON001699）與Kailu7-10（ON001713）之間的核苷酸序列一致性最低，為78.1%。該29個(gè)分離物與其他15個(gè)已知的ACLSV分離物的核苷酸序列一致性為69.1%～93.6%，其中分離物Kailu7-10（ON001713）與來源于中國蘋果的分離物XC-HF（MF678819）核苷酸序列一致性最高（93.6%）；分離物Kailu1-5（ON001689）與美國桃分離物Ta Tao 5（EU223295）核苷酸序列一致性最低（69.1%）（圖1）。根據(jù)擴(kuò)增得到的部分復(fù)制蛋白和移動(dòng)蛋白基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，44 個(gè)ACLSV 分離物聚集在7 個(gè)分支，即JB、MO-5、Balatonl、P863、組1、B6、Ta Tao 5（圖2）。來源于塞外紅蘋果的部分ACLSV分離物（ON001687～689、ON001692、ON001700～704、ON001706～708、ON001713～715）位于JB 組，與中國山楂分離物SY03 （KU870525） 、蘋果分離物XC- HF（MF678819）、梨分離物KMS、YH、JB（KC935954、KC935955、KC935956）聚為一支；分離物Kailu3-12（ON001699）與法國櫻桃分離物Balaton1（X99752）聚為一支，位于Balatonl 組；分離物Kailu6-9、Kailu5-11（ON001709、ON001705）單獨(dú)形成一個(gè)分支，位于1 組；其他的分離物（ON001690～691、ON001693～698、ON001710～712）位于B6 組，與日本蘋果分離物QD- 13（KJ522693）、中國蘋果分離物MS（KC847061）聚為一支。外參為櫻桃斑駁葉病毒（cherry mottle leaf virus，CMLV）（NC-002500）。

筆者在本研究中共獲得12 個(gè)來源于塞外紅蘋果的ASPV 分離物（GenBank 登錄號：OL953372～OL953383），這12 個(gè)分離物間核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，其中來源于塞外紅的ASPV 分離物Kailu2-9（OL953373）與Kailu7-12（OL953382）的核苷酸序列一致性最高（99.7%）；分離物Kailu2- 9（OL953373）、Kailu7- 6（OL953380）與Kailu8- 1（OL953383）之間的核苷酸序列一致性最低（83.6%）。該12 個(gè)ASPV分離物與其他15 個(gè)已知的ASPV分離物的核苷酸序列一致性為75.4%～91.5%，其中ASPV 分離物Kailu7-12（OL953382）與加拿大蘋果分離物Aurora-1（HE963831）的核苷酸序列一致性最高（91.5% ）；ASPV 分離物Kailu7- 6（OL953380）與中國梨ASPV 分離物PR1（EU095327）的核苷酸序列一致性最低（75.4%）（圖3）。根據(jù)部分外殼蛋白基因和3非編碼區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，27 個(gè)ASPV分離物聚集為6 支，塞外紅蘋果的ASPV 分離物分別位于組Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ（圖4）。部分塞外紅蘋果的ASPV 分離物（OL953372～75、OL953379、OL953381～83）與加拿大蘋果分離物Aurora-1（HE963831）聚集在同一個(gè)分支上形成組Ⅰ ；部分塞外紅蘋果的ASPV 分離物（OL953379、OL953380）與德國蘋果的ASPV 分離物PM8（KF319056）、印度蘋果的ASPV 分離物Palampur（FR694186）、日本蘋果的ASPV 分離物IF38（AB045371）聚為一支，位于組Ⅳ；其余塞外紅蘋果的ASPV分離物（OL953378、OL953377）形成單獨(dú)的一個(gè)分支Ⅴ。外參為沙地葡萄莖痘病毒（grapevinerupestris stem pitting- associated virus，GRSPaV）（JX559646）。

筆者在本研究中共獲得21個(gè)來源于塞外紅的ASGV分離物（GenBank登錄號OL960733～OL960753），核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，來自塞外紅蘋果的ASGV 分離物Kailu1-1（OL960733）與Kailu1-12（OL960739）核苷酸序列一致性最高（100.0%）；ASGV 分離物（OL960734～735、OL960745～747、OL960749～750）與分離物Kailu8-1（OL960753）之間的核苷酸序列一致性最低（96.4%）。來自塞外紅蘋果的21 個(gè)ASGV 分離物與其他已知的38 個(gè)ASGV分離物核苷酸序列一致性為89.9%～98.9%，其中塞外紅蘋果的ASGV 分離物Kailu7- 5、Kailu7- 10（OL960751、OL960752）與加拿大蘋果的ASGV 分離物13TF163B（MZ126539）的核苷酸序列一致性最高（98.9%）；分離物Kailu1-7（OL960738）與中國滇黃精ASGV分離物PG（MK427058）核苷酸序列一致性最低（89.9%）（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示59 個(gè)ASGV分離物聚集成8 個(gè)大的分支。塞外紅蘋果的ASGV分離物獨(dú)自聚集形成一支，記為組Ⅰ（圖6）。外參為櫻桃病毒A（Cherry Virus A，CVA）（AB181355）。

3 討論

對病毒的種群多樣性和遺傳特性進(jìn)一步深入分析，能夠更好地掌握病毒的流行特點(diǎn)，筆者在本研究中對在開魯縣塞外紅蘋果上發(fā)生的3 種蘋果潛隱病毒病進(jìn)行了報(bào)道。通過RT-PCR獲得了29 個(gè)塞外紅蘋果ACLSV 分離物，GenBank 登錄號：ON001687～ON001715；12個(gè)塞外紅蘋果ASPV分離物，GenBank登錄號：OL953372～OL953383；21個(gè)塞外紅蘋果ASGV分離物，GenBank登錄號：OL960733～OL960753。

根據(jù)第九次國際病毒分類會(huì)議的建議標(biāo)準(zhǔn)可知，凹陷病毒屬不同種的RdRp 基因或者CP 基因的核苷酸序列一致性應(yīng)高于72%或者氨基酸序列一致性高于80%。塞外紅蘋果的ACLSV分離物之間核苷酸序列一致性為78.1%～99.9%，與其他15 個(gè)ACLSV分離物之間核苷酸序列一致性為69.1%～93.6%，其中塞外紅蘋果的ACLSV分離物（ON001689）與美國桃分離物Ta Tao 5（EU223295）核苷酸序列一致性最低（69.1%），基因組序列一致性低于國際病毒分類委員會(huì)第九次會(huì)議中給出的范圍。但通過與其他已經(jīng)報(bào)道過的ACLSV核苷酸序列一致性比對分析均大于分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究認(rèn)為來自塞外紅蘋果的ACLSV分離物Kailu1-5（ON001689）仍屬于ACLSV。通過對ACLSV 進(jìn)化樹分析，ACLSV 未表現(xiàn)地理位置相關(guān)性和寄主相關(guān)性。通過核苷酸序列一致性分析可以發(fā)現(xiàn)塞外紅蘋果的ASPV分離物之間核苷酸序列一致性為83.6%～99.7%，與其他15 個(gè)ASPV 分離物之間的核苷酸序列一致性為75.4%～91.5%，塞外紅蘋果的ASPV分離物與已經(jīng)報(bào)道的ASPV分離物具有較高的核苷酸一致性，這些數(shù)據(jù)可以說明該分離物屬于ASPV。根據(jù)Ma 等[17]的研究結(jié)果，ASPV 分離物與地理位置和寄主有相關(guān)性，但筆者在本研究中構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹不支持ASPV分離物間呈現(xiàn)地理位置相關(guān)性和寄主相關(guān)性，這可能與樣本量較少有關(guān)。本研究結(jié)果表明，塞外紅蘋果的ASGV分離物之間核苷酸序列一致性為96.4%～100.0%，與其他38 個(gè)ASGV分離物之間核苷酸序列一致性為89.9%～98.9%。塞外紅蘋果的ASGV分離物與已經(jīng)報(bào)道的ASGV 分離物具有較高的核苷酸序列一致性，這些數(shù)據(jù)表明該分離物屬于ASGV?；诨蛐蛄械南到y(tǒng)發(fā)育分析表明，這些ASGV分離物在地理來源特異性或寄主專一性方面沒有明確的歸類。

筆者在本研究中對開魯縣塞外紅上3 種蘋果潛隱性病毒的分子變異情況進(jìn)行分析，進(jìn)一步明確了各個(gè)病毒分子變異規(guī)律及相應(yīng)株系的分類情況，以及開魯不同塞外紅蘋果產(chǎn)區(qū)的病毒分離物系統(tǒng)發(fā)育的親緣關(guān)系，本研究對更好地了解塞外紅蘋果潛隱性病毒的發(fā)生規(guī)律及制定有效的防治措施具有重要的理論指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

ACLSV、ASPV和ASGV均能侵染塞外紅蘋果，雙重復(fù)合侵染和三重復(fù)合侵染也有發(fā)生。與ASPV和ASGV相比，ACLSV的發(fā)生率較高，達(dá)30%。對比于其他已經(jīng)報(bào)道的病毒分離物之間的一致性，來自于塞外紅蘋果的3種病毒種內(nèi)分離物的核苷酸序列一致性均較高，并且進(jìn)化關(guān)系較近。研究結(jié)果為塞外紅蘋果產(chǎn)業(yè)綠色、健康、持續(xù)發(fā)展提供基本理論依據(jù)。

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