確山縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊 連敏 王勇

維生素C 普遍存在于植物體內(nèi)，在植物的多個生理代謝活動中發(fā)揮著非常重要的作用。在對植物的研究中發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)維生素C 含量越高，其抗逆性越強。同時，維生素C 具有抗氧化、防止衰老等功效。但是，人類本身缺少維生素C，人體內(nèi)生物合成代謝途徑中的一種關(guān)鍵酶無法合成人體所需的維生素C，因此，人們身體所需的維生素C 只能從新鮮的水果或蔬菜中獲取。蘋果富含維生素C、果膠、有機酸、膳食纖維和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是老少皆宜的大眾水果。鑒于蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及維生素C 對動植物必不可少的作用，篩選蘋果中維生素C 含量測定方法就顯得尤為重要。

維生素C 具有氧化性和還原性，在蘋果果實中維生素C 具有很強的還原性，蘋果切開后，維生素C 在空氣中很不穩(wěn)定，容易氧化。維生素C 的檢測方法有很多，如滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等，本文對這幾種常用的檢測方法進行比較分析，篩選出一種適合蘋果維生素C 含量測定的方法。

一、維生素C 測定方法

（一）滴定法測定維生素C

滴定法測定蘋果中維生素C 所用藥品和儀器均較少，操作過程需要對每個蘋果樣品進行過濾后滴定，比較費時，維生素C 在空氣中暴露時間久了容易被氧化，測定的結(jié)果易偏低。該方法可以對蘋果中維生素C 中含量進行簡單的相對比較，不能準(zhǔn)確測定蘋果中維生素C的含量。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，再將樣品融入2%的草酸中，充分混勻避光放置30 min 后過濾，濾液便可進行滴定。樣品設(shè)置3 次重復(fù)。由于維生素C 具有還原性，藍(lán)色染料2,6-二氯酚靛酚具有氧化性，并且該染料在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。滴定過程中當(dāng)樣品溶液中維生素C 被完全氧化后該染料在草酸溶液中便會呈現(xiàn)出紅色。根據(jù)滴定草酸樣品所用的藍(lán)色染料2,6-二氯酚靛酚溶液的量，再利用公式便可計算出蘋果果肉中維生素C 的含量。

（二）熒光分光光度法測定維生素C

熒光分光光度法測定蘋果果肉中維生素C 所用藥品和儀器少，但操作步驟較多，測定的準(zhǔn)確度比滴定法測定稍微高些。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，然后在樣品中加入偏磷酸-冰醋酸溶液，充分混勻后加入適量活性炭，劇烈震蕩20 min 后過濾，取一定量濾液加入定量的硼酸-醋酸鈉，充分搖勻后放置10 min，稀釋到定量濃度便可作為樣品溶液。按照步驟制定維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。在樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中分別加入定量的鄰苯二胺，混合后避光反應(yīng)35 min 后邊便可進行測定。樣品設(shè)置3 次重復(fù)。維生素C 與活性炭反應(yīng)，可被氧化成脫氧抗壞血酸，它與鄰苯二胺進行反應(yīng)生成喹喔啉，利用分光光度計在激發(fā)波長351 nm 和發(fā)射波長432 nm 處測定喹喔啉的熒光強度。根據(jù)公式便可計算出蘋果果肉中維生素C 的含量。

（三）紫外分光光度法測定維生素C

紫外分光光度法測定蘋果果肉中維生素C 時，前面對樣品抽提較麻煩，整個操作過程所用藥品偏多，該方法測定維生素C 時所用到的低溫離心機和進口酶標(biāo)儀價格較高。因為前面操作步驟比較煩瑣，維生素C 容易被氧化，所以測定蘋果果肉中維生素C 含量不是很準(zhǔn)確。紫外分光光度法適合大批量測定樣品，酶標(biāo)儀檢測靈敏度高、速度快，1 次2 min 便可檢測96 個樣品。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預(yù)冷的HCL 溶液進行充分抽提，抽提時間為30 min，且中間需要顛倒混勻5 次。樣品設(shè)置3 次重復(fù)。然后利用低溫離心機進行離心，取一定量的上清液加入NaH2PO4，并用NaOH 調(diào)試溶液的pH?；靹蚝笕∩锨逡杭尤胍欢舛鹊腘aH2PO4和二硫蘇糖醇，在25℃ 條件下黑暗反應(yīng)30 min。蘋果內(nèi)維生素C 分為氧化型和還原型，二硫蘇糖醇具有強還原性，能將蘋果內(nèi)氧化型維生素C 還原為還原型維生素C，在波長265 nm 處便可測定。取一定量前面抽提的上清液加入NaH2PO4，用酶標(biāo)儀測定吸收波長為265 nm 處的值，最后加 AO 酶，反應(yīng)后再測1 次數(shù)值。樣品設(shè)置3 次重復(fù)。根據(jù)維生素C 標(biāo)準(zhǔn)曲線便可測定出蘋果果肉中維生素C的含量。

（四）高效液相色譜法測定維生素C

高效液相色譜法測定蘋果果肉中維生素C 時，整個操作步驟相對簡單、檢測速度也快，測定結(jié)果也較準(zhǔn)確，但高效液相色譜法所用高效液相色譜儀價格非常高。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預(yù)冷的HPO3溶液進行充分抽提，抽提時間30 min，且中間需要顛倒混勻5 次。樣品設(shè)置3 次重復(fù)。采用低溫離心機離心，并用微孔濾膜抽濾上清液進行備用。然后再濾液中加入一定量的二硫蘇糖醇，25℃黑暗條件下反應(yīng)約15 min。蘋果果肉經(jīng)HPO3溶液抽提后，維生素C 便可用微孔濾膜分離出來。此時便可用高效液相色譜儀在254 nm 處檢測其峰值。用高效液相色譜儀在波長為254 nm 測出樣品溶液中總維生素C 含量，流動液相為乙酸緩沖液，測定時流速為1.0 mL·min-1，根據(jù)維生素C 標(biāo)準(zhǔn)曲線和出峰的峰面積 即可測定出蘋果果肉中維生素C 的含量。

二、結(jié)論與討論

由于維生素C 具有還原性，在空氣中不穩(wěn)定，極易被氧化，所以前人對維生素C 含量的測定方法做了很多研究。本文通過對滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法4 種測定方法進行比較，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法具有操作簡便、靈敏度更高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，更適合測定蘋果中維生素C 含量。

高效液相色譜法雖然比較適合測定蘋果中維生素C含量，但是該方法所用到的高效液相色譜儀價格昂貴，且高效液相色譜儀開機比較麻煩，適合大批量測定樣品，測定樣品時費用較高。其他幾種方法雖然準(zhǔn)確性有點低，但可以對蘋果中維生素C 中含量進行簡單的比較。