朱敏杰,曾 起,程 超,肖 敏,李愛(ài)平,簡(jiǎn)少卿,趙大顯

( 1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江西 南昌 330031;2.井岡山農(nóng)業(yè)科技園,江西 吉安 343000;3.井岡山市竹佬總冷水魚(yú)養(yǎng)殖專業(yè)合作社,江西 吉安 343000 )

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬硬骨魚(yú)綱鮭科太平洋鮭屬,是我國(guó)重要的冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,2020年國(guó)內(nèi)鱒魚(yú)產(chǎn)量達(dá)3.78×104t[1]。隨著市場(chǎng)需求量增大和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展,高密度集約化人工養(yǎng)殖迅速興起,而這種養(yǎng)殖模式也導(dǎo)致養(yǎng)殖過(guò)程中疾病的發(fā)生,嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中,養(yǎng)殖密度被認(rèn)為是影響魚(yú)類生長(zhǎng)性能和養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要因素之一[2]。隨著養(yǎng)殖密度增大,魚(yú)體生長(zhǎng)率、存活率和食物利用率都有所下降[3-5];養(yǎng)殖密度的增大,除降低養(yǎng)殖魚(yú)體的生長(zhǎng)性能外,還會(huì)引起魚(yú)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]、皮質(zhì)醇水平變化[6]以及魚(yú)體擁擠脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)生改變[7]等;而低放養(yǎng)密度由于空間利用效率低下,也可能導(dǎo)致更高的生產(chǎn)成本和利潤(rùn)率下降。因此,適宜的養(yǎng)殖密度對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖至關(guān)重要。

由于魚(yú)類在生態(tài)和經(jīng)濟(jì)方面的重要性,利用功能基因組學(xué)通過(guò)基因調(diào)控來(lái)研究魚(yú)類和非生物環(huán)境之間的相互作用關(guān)系越來(lái)越受到廣泛關(guān)注[8-12]。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在水產(chǎn)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,其也被針對(duì)性地用于探討魚(yú)體受養(yǎng)殖密度誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制[13-14]。近年來(lái),基于二代高通量測(cè)序平臺(tái)的RNA-seq技術(shù),可提供大量的序列和豐度信息,逐漸替代了微陣列技術(shù),成為轉(zhuǎn)錄組分析更好的方法[15]。與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)相比,RNA-seq技術(shù)在注釋編碼和非編碼基因上有較大優(yōu)勢(shì),它不需要知道目標(biāo)物種的基因信息,就可以對(duì)多數(shù)生物體的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。母尹楠[16]利用RNA-seq技術(shù)研究了感染嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)轉(zhuǎn)錄組,分析得到了1996個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),包括1133個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和863個(gè)下調(diào)表達(dá)基因,其中727個(gè)差異表達(dá)基因顯著上調(diào),489個(gè)差異表達(dá)基因顯著下調(diào),這些基因分布在Toll-like通路、JAK-STAT通路、MAPK通路以及參與T細(xì)胞受體信號(hào)通路中;Schunter等[17]采用RNA-seq技術(shù)研究德氏三鰭鳚(Tripterygiondelaisi)交配策略中雄性二態(tài)性的分子特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種雄性表型間差異表達(dá)基因數(shù)目比雌雄表型間差異表達(dá)基因還多;RNA-seq技術(shù)還被用于識(shí)別大西洋鮭(Salmosalar)肌肉組織中的miRNA,作為毒理學(xué)應(yīng)激的潛在生物標(biāo)志物[18]。因此,RNA-seq技術(shù)在魚(yú)類差異表達(dá)基因的篩選和候選基因的發(fā)掘上發(fā)揮重要功能。

筆者以3種養(yǎng)殖密度條件下的虹鱒幼魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)比較分析其生長(zhǎng)指標(biāo)變化,并采用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序和分析,篩選獲得養(yǎng)殖密度和生長(zhǎng)應(yīng)激響應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)基因信息,為進(jìn)一步開(kāi)展虹鱒健康養(yǎng)殖和基因組學(xué)研究提供參考數(shù)據(jù),也為進(jìn)一步深入挖掘和開(kāi)發(fā)利用虹鱒功能基因提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

養(yǎng)殖試驗(yàn)在井岡山市竹佬總冷水魚(yú)養(yǎng)殖專業(yè)合作社進(jìn)行,所有的虹鱒均由同一批受精卵孵化而來(lái),采用室內(nèi)流水養(yǎng)殖模式進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)用魚(yú)均來(lái)自同一個(gè)養(yǎng)殖池(記為來(lái)源池),經(jīng)人工捕撈、篩選出規(guī)格一致的虹鱒幼魚(yú),放養(yǎng)在規(guī)格一致、底面積為1 m2的9個(gè)養(yǎng)殖網(wǎng)箱中。試驗(yàn)水溫17～21 ℃,pH 6.5～7.5,出水口水流速度為1 kg/s,池內(nèi)水深0.4 m。

試驗(yàn)用虹鱒幼魚(yú)初始平均體質(zhì)量(4.66±0.26)g,初始平均體長(zhǎng)(5.98±0.16)cm。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)養(yǎng)殖密度:6.99、4.66、2.33 kg/m3,比例為3∶2∶1。按養(yǎng)殖密度設(shè)為低密度組、中密度組、高密度組,每組設(shè)置3個(gè)平行。低密度組每池放養(yǎng)200尾,中密度組每池放養(yǎng)400尾,高密度組每池放養(yǎng)600尾。試驗(yàn)魚(yú)體健康,規(guī)格基本一致。試驗(yàn)自2019年8月6日開(kāi)始,每隔8 d從每個(gè)網(wǎng)箱中取30尾幼魚(yú)進(jìn)行體長(zhǎng)和體質(zhì)量的測(cè)量,養(yǎng)殖32 d后從每個(gè)網(wǎng)箱中取3尾虹鱒幼魚(yú)肌肉組織混樣作為1個(gè)樣品,3個(gè)密度組每組3個(gè)平行,共9個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 RNA提取

各組樣品使用TRIzol?試劑(Invitrogen)并按照說(shuō)明書(shū)操作提取總RNA,使用DNase I (TaKaRa)去除基因組DNA,使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛)、Aglient 2100 分析儀器對(duì)總RNA的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)。RIN值>7的RNA用于下游試驗(yàn)。

1.3 mRNA-seq文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序

使用NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit(NEB,美國(guó))試劑盒生成測(cè)序文庫(kù)。利用帶有Oligo(dT)磁珠純化mRNA,隨機(jī)六聚體引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA,DNA聚合酶I和RNase H合成第二鏈cDNA,AMPure XP系統(tǒng)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)對(duì)文庫(kù)片段進(jìn)行純化;然后使用USER酶(NEB,美國(guó)) 與大小合適的接頭連接cDNA,37 ℃孵育15 min,95 ℃孵育5 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化,利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),合格后使用Illumina-HiSeq 4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 生長(zhǎng)數(shù)據(jù)處理與分析

以每隔8 d取樣稱量獲得的體長(zhǎng)、體質(zhì)量作為生長(zhǎng)指標(biāo),按下式計(jì)算生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

wWGR=(m2-m1)/m1×100%

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

CF=100m/L3

式中,wWGR為質(zhì)量增加率(%),RSG為特定生長(zhǎng)率(%/d),CF為肥滿度,m1為初始體質(zhì)量(g),m2為終末體質(zhì)量(g),t為養(yǎng)殖時(shí)間(d),m為體質(zhì)量(g),L為體長(zhǎng)(cm)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用Excel和SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出和質(zhì)量控制

基于高通量測(cè)序平臺(tái)IlluminaHiseq 4000對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)Perl腳本對(duì)產(chǎn)出的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,同時(shí)計(jì)算處理后的有效數(shù)據(jù)、Q20、Q30、GC含量和序列重復(fù)水平。

1.4.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和參考基因組序列比對(duì)

利用Hisat2軟件 (http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml,參數(shù):-p 24-dta-x-1-2-S) 對(duì)參考基因組進(jìn)行比對(duì),再利用StringTie軟件(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/,參數(shù):-p 24-G-o-l)進(jìn)行組裝和定量。

1.4.4 新基因的挖掘

基于參考基因組序列,將拼接好的序列與原有的基因組注釋信息比對(duì),尋找原來(lái)未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū),發(fā)掘該物種性的轉(zhuǎn)錄本和新基因,補(bǔ)充和完善基因組注釋信息。使用BLAST軟件 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,參數(shù):-query-db-out-outfmt 6-max-target-seqs 1) 將新基因與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行注釋。

1.4.5 基因功能的注釋

基因功能的注釋基于Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss Prot、KEGG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4.6 差異表達(dá)分析

采用DESeq2軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)分析樣品組間的差異表達(dá)。將差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)每組差異基因進(jìn)行維恩圖的繪制。

1.4.7 差異表達(dá)基因GO富集分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)。GO注釋系統(tǒng)是一個(gè)有向無(wú)環(huán)圖,包括三個(gè)主要分支:生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分。

1.4.8 差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

根據(jù)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析,并選取q值最小的前20個(gè)通路進(jìn)行分析。

1.4.9 生長(zhǎng)與應(yīng)激相關(guān)基因的篩選

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,篩選與生長(zhǎng)和應(yīng)激相關(guān)的基因。

2 結(jié) 果

2.1 養(yǎng)殖密度對(duì)虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

養(yǎng)殖32 d后,低密度組終末體質(zhì)量、質(zhì)量增加率、特定生長(zhǎng)率和肥滿度均大于中密度組和高密度組,但3個(gè)組別之間上述4個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)數(shù)據(jù)間差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 不同養(yǎng)殖密度中虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)參數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2 測(cè)序結(jié)果的產(chǎn)出及質(zhì)控

本試驗(yàn)完成3個(gè)密度組(低密度組、中密度組、高密度組),每個(gè)密度組3個(gè)平行,共9個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共得到數(shù)據(jù)67.41 Gb,各樣品的數(shù)據(jù)均達(dá)到5.99 Gb以上。Q20和Q30堿基百分比分別在98.07%和94.72%以上,各密度組GC堿基占總堿基平均百分比為:低密度組51.07%、中密度組51.33%、高密度組51.08%。有效數(shù)據(jù)總數(shù)(取各密度組3個(gè)平行組的有效數(shù)據(jù)平均值)為低密度組2.694×107、中密度組2.478×107、高密度組2.327×107(表2)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)

將本試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組獲得的有效數(shù)據(jù)與虹鱒參考基因組進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),各樣品的序列與參考基因組的比對(duì)效率為91.67%～92.77%,比對(duì)效果大于70%。另外,單次匹配的比對(duì)率為79.26%～80.06%,多次匹配的比對(duì)率為11.82%～13.37%(表3)。

表3 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)與虹鱒參考基因組的序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 新基因的分析

基于虹鱒基因組序列作為參考基因組,使用StringTie軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接,并與原有的基因組注釋信息進(jìn)行比較,尋找原來(lái)未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū),發(fā)掘虹鱒的新轉(zhuǎn)錄本和新基因,從而補(bǔ)充和完善原有的基因組注釋信息。過(guò)濾掉編碼的肽鏈過(guò)短(少于50個(gè)氨基酸殘基)或只包含單個(gè)外顯子的序列,共發(fā)掘5501個(gè)新基因,其中4121個(gè)基因得到注釋,1380個(gè)基因未得到注釋(表4)。

表4 新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.5 差異表達(dá)分析

使用DESeq2軟件對(duì)虹鱒養(yǎng)殖高、中、低密度組轉(zhuǎn)錄組兩兩比較進(jìn)行差異表達(dá)分析(FDR<0.05)發(fā)現(xiàn):低密度組與高密度組相比出現(xiàn)2760個(gè)差異表達(dá)基因,其中1279個(gè)差異表達(dá)基因上調(diào),1481個(gè)差異表達(dá)基因下調(diào);低密度組與中密度組相比有654個(gè)差異表達(dá)基因,其中307個(gè)上調(diào),347個(gè)下調(diào);中密度組與高密度組相比有2316個(gè)差異表達(dá)基因,其中1226個(gè)上調(diào),1090個(gè)下調(diào)(表5)。

表5 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

將每組差異基因繪制維恩圖發(fā)現(xiàn),共4030個(gè)非冗余差異表達(dá)基因中的38個(gè)是3個(gè)比較組之間共有的(圖1)。

圖1 差異表達(dá)基因維恩圖Fig.1 Venn diagram of differentially expressed genes

2.6 差異基因GO富集分析

對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類發(fā)現(xiàn),低密度組與高密度組比較共有1943個(gè)差異表達(dá)基因獲得了GO注釋,包括823個(gè)上調(diào)和1120個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因。歸類到GO 3大本體的59個(gè)子類別中,其中:生物學(xué)過(guò)程主要由代謝過(guò)程(741個(gè))、細(xì)胞過(guò)程(950個(gè))、單有機(jī)體過(guò)程(710個(gè))和生物調(diào)控(559個(gè))組成;細(xì)胞組分主要由細(xì)胞(920個(gè))、膜(530個(gè))、膜部件(463個(gè))、細(xì)胞組分(909個(gè))和細(xì)胞器(649個(gè))組成;分子功能主要由催化活性(706個(gè))和結(jié)合(1067個(gè))組成(圖2a)。

低密度組與中密度組比較共有438個(gè)具有顯著性差異表達(dá)基因獲得了GO注釋信息,其中包括191個(gè)上調(diào)和247個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因。代謝過(guò)程(131個(gè))、細(xì)胞過(guò)程(172個(gè))、單有機(jī)體過(guò)程(160個(gè))和生物調(diào)控(157個(gè))占據(jù)著生物學(xué)過(guò)程涉及的大部分差異表達(dá)基因;細(xì)胞組分主要由細(xì)胞(194個(gè))、膜(151個(gè))、膜部件(137個(gè))、細(xì)胞組分(188個(gè))和細(xì)胞器(137個(gè))組成,分子功能主要由催化活性(135個(gè))和結(jié)合(232個(gè))這兩個(gè)子類別組成(圖2b)。

中密度組與高密度組進(jìn)行比較共有1602個(gè)具有顯著性差異表達(dá)基因獲得了GO注釋信息,其中包括811個(gè)上調(diào)和791個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因。生物學(xué)過(guò)程中有611個(gè)差異表達(dá)基因參與代謝過(guò)程,755個(gè)差異表達(dá)基因參與細(xì)胞過(guò)程,586個(gè)差異表達(dá)基因參與單有機(jī)體過(guò)程,426個(gè)差異表達(dá)基因參與生物調(diào)控;細(xì)胞組分主要由細(xì)胞(680個(gè))、膜(480個(gè))、膜部件(439個(gè))、細(xì)胞組分(667個(gè))和細(xì)胞器(440個(gè))組成,分子功能主要由催化活性(593個(gè))和結(jié)合(844個(gè))組成(圖2c)。

通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),低密度組與高密度組以及中密度組與高密度組的差異表達(dá)基因都主要富集在DNA整合、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)位(生物學(xué)過(guò)程),褶皺(細(xì)胞組分)和細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成(分子功能),低密度組與中密度組的差異表達(dá)基因主要富集在DNA整合、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)位(生物學(xué)過(guò)程),褶皺(細(xì)胞組分)和DNA結(jié)合、氧化還原酶活性作用于成對(duì)供體結(jié)合或重組(分子功能)過(guò)程(圖2)。

2.7 差異基因KEGG富集通路分析

通過(guò)KEGG富集通路分析發(fā)現(xiàn),低密度組與高密度組進(jìn)行比較,920個(gè)差異表達(dá)基因定位到212個(gè)特定的KEGG代謝途徑。低密度組與中密度組相比較,196個(gè)差異表達(dá)基因定位到112個(gè)特定的KEGG代謝途徑;中密度組與高密度組進(jìn)行對(duì)比,743個(gè)差異表達(dá)基因定位到189個(gè)特定代謝途徑。

選取q值最小的20個(gè)通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):低密度組與高密度組相比,差異表達(dá)基因顯著富集到RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪切體、DNA復(fù)制和真核生物中核糖體合成4個(gè)通路(圖3a);低密度組與中密度組相比,差異表達(dá)基因顯著富集到緊密連接通路(圖3b);中密度組與高密度組相比,差異表達(dá)基因顯著富集到剪切體,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,氨基酸的生物合成和真核生物中核糖體合成4條信號(hào)途徑(圖3c)。

2.8 生長(zhǎng)與應(yīng)激相關(guān)基因的篩選

選擇P值小且差異倍數(shù)大的差異表達(dá)基因,并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行篩選。從低密度組-高密度組中篩選獲得絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶pp1-β催化亞基、胰島素受體2、組蛋白結(jié)合蛋白4、無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員2BA、肌肉骨骼-胚胎核蛋白1b、V型質(zhì)子ATP酶亞基e1等與生長(zhǎng)相關(guān)的差異表達(dá)基因及顆粒蛋白前體、整合素alpha-V、轉(zhuǎn)換B細(xì)胞復(fù)合物亞基、組織蛋白酶、熱休克蛋白等與生長(zhǎng)相關(guān)的差異表達(dá)基因;從低密度組-中密度組分組中篩選獲得肌肉生長(zhǎng)抑制素、無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員2BA等與生長(zhǎng)相關(guān)的差異表達(dá)基因及與應(yīng)激相關(guān)的視黃醛脫氫酶2等差異表達(dá)基因;從中密度組-高密度組組中篩選獲得生長(zhǎng)相關(guān)的差異表達(dá)基因,包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白5、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-2前蛋白、肌肉生長(zhǎng)抑制素B、組蛋白結(jié)合蛋白4(表6)。

表6 篩選獲得的與生長(zhǎng)和應(yīng)激相關(guān)的差異表達(dá)基因

3 討 論

3.1 養(yǎng)殖密度對(duì)虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

養(yǎng)殖密度作為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的一個(gè)重要因子,對(duì)魚(yú)類生長(zhǎng)性能產(chǎn)生重要影響。目前,關(guān)于養(yǎng)殖密度影響魚(yú)類生長(zhǎng)的機(jī)制還存在著爭(zhēng)議。普遍認(rèn)為在高密度環(huán)境生活的魚(yú)類中,受到多種因素的影響,這些影響因素單獨(dú)或者疊加地影響魚(yú)類個(gè)體的生長(zhǎng),使得養(yǎng)殖密度對(duì)生長(zhǎng)機(jī)制研究變得更為復(fù)雜。有些魚(yú)類隨著養(yǎng)殖密度的增加,其體質(zhì)量增長(zhǎng)(率)均不斷降低,如地圖魚(yú)(Astronotusocellatus)[19]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[20]、施氏鱘(Acipenserschrenckii)[21];有些魚(yú)類高密度養(yǎng)殖條件下生長(zhǎng)速度和飼料利用率更好,如大西洋白姑魚(yú)(Argyrosomusregius)[22]等;有些魚(yú)類養(yǎng)殖密度超過(guò)臨界范圍,其生長(zhǎng)和存活不受密度的影響,如達(dá)氏鰉(Husodauricus)[23]、瓦氏海馬(Hippocampuswhitei)[24]稚魚(yú)和塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[25]等。筆者發(fā)現(xiàn),隨著養(yǎng)殖密度的增加,虹鱒幼魚(yú)體質(zhì)量增長(zhǎng)率等生長(zhǎng)指標(biāo)均有不同程度的降低,雖然這種影響未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05),但從轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),一些與生長(zhǎng)和應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)模式在不同養(yǎng)殖組之間發(fā)生了顯著性變化,同時(shí)經(jīng)過(guò)初步分析還發(fā)現(xiàn),高密度養(yǎng)殖條件下虹鱒幼魚(yú)抗氧化酶活性與低、中密度組之間存在顯著差異(數(shù)據(jù)未列出),因此,綜合分析可以推測(cè),隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng),高密度養(yǎng)殖條件下虹鱒幼魚(yú)的生長(zhǎng)受到負(fù)面影響。

3.2 不同養(yǎng)殖密度條件下虹鱒幼魚(yú)轉(zhuǎn)錄組比較分析

為進(jìn)一步闡明養(yǎng)殖密度對(duì)虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)性能影響的分子機(jī)制,筆者通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)3個(gè)不同養(yǎng)殖密度虹鱒幼魚(yú)肌肉組織進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和質(zhì)控后,通過(guò)組裝、拼接和轉(zhuǎn)錄本功能注釋,得到67.41 Gb 的轉(zhuǎn)錄組有效數(shù)據(jù)信息,與其他淡水魚(yú)類如江鱈(Lotalota)[26]、黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)[27]、達(dá)氏鰉[28]、花斑裸鯉(Gymnocypriseckloni)[29]、烏鱧(Channaargus)和斑鱧(C.maculatus)[30]一樣都處于較高水平。這些數(shù)據(jù)的積累為今后開(kāi)展虹鱒基因組學(xué)、免疫學(xué)以及健康養(yǎng)殖提供了參考資料。

從轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量來(lái)看,大部分堿基質(zhì)量打分能達(dá)到或超過(guò)Q30。通常Q30值在80%以上則可認(rèn)為測(cè)序質(zhì)量非?？煽?本試驗(yàn)9個(gè)樣品中Q30值最低為94.72%,最高為95.62%,均大于90%,表明筆者利用RNA-seq技術(shù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確可靠,可用于后續(xù)虹鱒基因克隆及功能研究。

通過(guò)過(guò)濾掉編碼的肽鏈過(guò)短(少于50個(gè)氨基酸殘基)或只包含單個(gè)外顯子的序列,筆者共發(fā)掘了5501個(gè)新基因,其中4121個(gè)基因得到注釋,1380個(gè)基因未得到注釋。這些基因的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了虹鱒原有的基因組數(shù)據(jù),對(duì)這些新基因的深入研究將有助于闡明養(yǎng)殖密度與虹鱒幼魚(yú)響應(yīng)的分子機(jī)制。

3.3 生長(zhǎng)與應(yīng)激相關(guān)基因在虹鱒幼魚(yú)生長(zhǎng)中的功能

對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行GO和KEGG分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,人工篩選獲得了19條與生長(zhǎng)和應(yīng)激相關(guān)的基因序列,其中:肌肉生長(zhǎng)抑制素和肌肉生長(zhǎng)抑制素B在魚(yú)類早期發(fā)育、肌肉生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[31-33];無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員2BA調(diào)控魚(yú)類卵巢分化和發(fā)育[34];草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)進(jìn)食高淀粉飼料后,絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶pp1-β催化亞基可以使過(guò)量的碳水化合物轉(zhuǎn)換為糖原[35];胰島素受體2廣泛分布于各個(gè)組織,在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有重要作用[36];肌肉骨骼-胚胎核蛋白1b是一種小型的核蛋白,參與了肌肉和骨骼的發(fā)育和再生[37];骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白5參與了幾個(gè)重要的胚胎過(guò)程和成脂前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化[38],骨形態(tài)發(fā)生蛋白5在1齡的團(tuán)頭魴的肌間骨中廣泛高表達(dá)[39];轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-2前蛋白可作為間充質(zhì)祖細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(如破骨巨噬細(xì)胞[40]破骨細(xì)胞[41]、軟骨細(xì)胞[42])的形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)因子[43];顆粒蛋白前體具有營(yíng)養(yǎng)和抗炎活性[44];整合素alpha-V影響著身體和內(nèi)臟的左右不對(duì)稱[45];組織蛋白酶B參與了細(xì)菌感染和接種過(guò)程中的宿主免疫應(yīng)答[46];熱休克蛋白60可以在先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞中引發(fā)強(qiáng)效的促炎反應(yīng),被認(rèn)為是細(xì)胞受到壓力或受損的危險(xiǎn)信號(hào)[47];轉(zhuǎn)換B細(xì)胞復(fù)合物亞基70作為外周肌動(dòng)蛋白籠與吞噬體連接支架有著關(guān)鍵作用[48]。這些基因在不同養(yǎng)殖密度條件表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)顯著變化,說(shuō)明它們?cè)诤琪V幼魚(yú)應(yīng)對(duì)不同的養(yǎng)殖密度中發(fā)揮重要功能。這些基因的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步深入研究養(yǎng)殖密度對(duì)虹鱒生長(zhǎng)性能影響的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為確定生產(chǎn)上適宜的養(yǎng)殖密度提供了參考指標(biāo)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著養(yǎng)殖密度的增加,虹鱒幼魚(yú)質(zhì)量增加率等生長(zhǎng)指標(biāo)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。通過(guò)RNA-seq技術(shù)共獲得了3個(gè)養(yǎng)殖密度條件下虹鱒幼魚(yú)肌肉組織67.41 Gb轉(zhuǎn)錄組有效數(shù)據(jù),通過(guò)序列比對(duì)共發(fā)掘5501個(gè)新基因,其中4121個(gè)基因得到注釋,1380個(gè)基因未得到注釋。差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn):低密度組與高密度組以及中密度組與高密度組的差異表達(dá)基因都主要富集在DNA整合、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)位(生物學(xué)過(guò)程)、褶皺(細(xì)胞組分)和細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成(分子功能),低密度組與高密度組進(jìn)行比較,920個(gè)差異表達(dá)基因定位到212個(gè)特定的KEGG代謝途徑,中密度組與高密度組進(jìn)行對(duì)比,743個(gè)差異表達(dá)基因定位到189個(gè)特定代謝途徑;低密度組與中密度組的差異表達(dá)基因主要富集在DNA整合、DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)位(生物學(xué)過(guò)程),褶皺(細(xì)胞組分)和DNA結(jié)合、氧化還原酶活性作用于成對(duì)供體結(jié)合或重組(分子功能)過(guò)程,196個(gè)差異表達(dá)基因定位到112個(gè)特定的KEGG代謝途徑。篩選獲得了19條與生長(zhǎng)和應(yīng)激相關(guān)的基因序列。此試驗(yàn)結(jié)果可為開(kāi)展鮭科魚(yú)類組學(xué)研究提供了基因資源庫(kù),也可為今后虹鱒功能基因的挖掘和健康養(yǎng)殖發(fā)提供理論依據(jù)。