蔡博生,陳華慧,羅翠婷,翟 毅,李廣麗,鄧思平

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088; 2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心,廣東 湛江 524088 )

下丘腦刺鼠相關(guān)蛋白/神經(jīng)肽Y(AgRP)神經(jīng)元,是攝食調(diào)節(jié)的關(guān)鍵中樞。AgRP是AgRP神經(jīng)元分泌的一種神經(jīng)肽,是一種作用較強的食欲刺激因子[1-2]。在機體能量缺乏時,下丘腦內(nèi)AgRP神經(jīng)元通過感知神經(jīng)信號和代謝信號被激活,agrp基因過表達合成AgRP并參與瘦素信號傳導(dǎo),進而影響攝食行為,實現(xiàn)食欲調(diào)節(jié)和能量平衡的中樞調(diào)控[3-6]。

目前,對AgRP的研究主要集中在哺乳動物。在四足動物中發(fā)現(xiàn),agrp為單拷貝基因,而在硬骨魚類中普遍存在2種agrp亞型基因[7]。在人和家鼠中,agrp基因主要在下丘腦中表達[8]。鳥類的agrp基因主要在下丘腦、毛囊和皮膚中表達[9]。硬骨魚類中agrp基因的不同亞型在組織表達上存在差異,有的在腦中高表達,有的在鰓和性腺中高表達[10-11]。AgRP在食欲和體質(zhì)量的調(diào)控中起著重要作用。研究證實,藥物損傷成年小鼠(Musmusculus)的AgRP神經(jīng)元或向其腦內(nèi)注射AgRP會導(dǎo)致攝食行為喪失或攝食量顯著增加[12-13]。近年來,關(guān)于AgRP在魚類攝食調(diào)控中的研究相繼被報道。在斑馬魚(Daniorerio)中,損傷AgRP1神經(jīng)元可導(dǎo)致斑馬魚食物消耗量顯著減少[14];禁食狀態(tài)下,斑馬魚下丘腦中AgRP1神經(jīng)元數(shù)量會增加并參與食欲調(diào)節(jié)[15]。AgRP參與了歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[16]和團頭魴(Megalobramaamblycephala)[17]的攝食調(diào)節(jié),長期饑餓狀態(tài)下agrp基因的表達量均顯著上調(diào)。

金錢魚(Scatophagusargus)屬鱸形目金錢魚科金錢魚屬。金錢魚具有極強的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性,但生長較為緩慢,是我國南海的一種名特優(yōu)魚種。目前,在金錢魚的生物學(xué)[18]、性別調(diào)控[19]、生長調(diào)控[20-21]方面已有了初步的研究。也有學(xué)者對金錢魚下丘腦神經(jīng)肽Phoenixin[22]和Spexin[23]在攝食調(diào)節(jié)中的作用進行了初步探討:AgRP也是魚類下丘腦分泌的一種神經(jīng)肽,但其在金錢魚攝食調(diào)節(jié)中的作用尚未見報道。為探明AgRP在金錢魚攝食調(diào)節(jié)中的作用,筆者克隆了金錢魚agrp1基因和agrp2基因,采用實時熒光定量PCR檢測這2種agrp基因在金錢魚各組織中的分布和饑餓及復(fù)投喂處理后其在下丘腦、腸道和肝臟中的表達水平變化情況,旨在為闡明金錢魚下丘腦神經(jīng)肽在攝食調(diào)節(jié)中的作用以及為該魚的人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

基因克隆所用的金錢魚購自廣東省湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場。組織表達和饑餓及復(fù)投喂試驗所用金錢魚均來自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究所基地。所有試驗魚取樣前用間氨基苯甲酸乙脂乙磺酸鹽麻醉,并置于冰上取所需組織,組織取出后立刻投入液氮中保存用于總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和基因表達。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取參照Trizol?reagent(Invitrogen,USA)試劑盒的說明書操作,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段RNA完整性和采用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)合成第1鏈cDNA。

1.2.2 基因克隆

基于大黃魚(Larimichthyscrocea)agrp基因,在金錢魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出與其相似度較高的unigene片段,根據(jù)篩選的序列,利用Primer premier 6.0設(shè)計特異性引物對(agrp1-F: ATGTTTGGCTCTGTGCTGC, agrp1-R: GCAGCACAGAGCCAAACAT; agrp2-F: ATGTTTGGCT CTGTGCTGC, agrp2-R: GCAGCACAGAGCCAAACAT)。以下丘腦cDNA為模板進行PCR擴增:94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后,取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測。采用瓊脂糖回收試劑盒回收、純化目的片段:將回收純化后的產(chǎn)物與Peasy-T3載體連接,使用溶菌肉湯培養(yǎng)基進行培養(yǎng),挑取單克隆的菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 序列分析和聚類分析

運用DNAMAN 8.0軟件對所得到的測序結(jié)果進行剪切拼接,獲得推導(dǎo)的金錢魚agrp1、agrp2基因的開放閱讀框和氨基酸序列。以Signal IP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測金錢魚agrp信號肽。由美國生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫獲得其余物種的AgRP1、AgRP2的氨基酸序列。利用DNAstar軟件對金錢魚與其他AgRP氨基酸進行同源性分析。運用MEGA 8.0鄰位相接法,基于AgRP1、AgRP2氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 組織分布

自養(yǎng)殖池塘隨機挑選3尾試驗魚立即取下丘腦、垂體、鰓、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、腸道、頭腎、肌肉和胃11個組織,置于液氮保存,用于總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄,獲得組織表達的cDNA模板。以金錢魚agrp1和agrp2基因 (特異性引物:agrp1-F1,CT GTGCTGCTGTGCTGTT; agrp1-R1,CAAGGCT GCTGATGAGTC。agrp2-F1,AGCGATGAGGACCG-ACAA;agrp2-R1,GCAGTGGCAGATGGTGTT)為目的基因,β-actin基因(β-actin-F: GAGAGGTTCCGTTGCCCAGAG; β-actin-R: CAGACAGCA-CAGTGTTGGCGT)為內(nèi)參基因,采用ABI 7500 PCR儀,SYBR Green Realtime PCR Master mix試劑盒(TOYOBO,日本)操作說明建立反應(yīng)體系,實時熒光定量PCR檢測各組織中的表達情況。實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s并收集熒光信號,40個循環(huán);然后進行熔解曲線分析。

1.2.5 饑餓及復(fù)投喂對agrp1和agrp2基因表達水平的影響

選取體質(zhì)量52～60 g的金錢魚用于饑餓及復(fù)投喂試驗。將選取的金錢魚隨機分為正常投喂組、饑餓組和復(fù)投喂組。正常投喂組(對照組)每日定量(餌料為魚體質(zhì)量的2%)、定時(9:00)投喂(餌料購于中國悅?cè)汉Ｑ笊镅芯块_發(fā)公司),連續(xù)投喂7 d;饑餓組分別在饑餓2 d和7 d后取樣;復(fù)投喂組為饑餓7 d后再投喂,并在投喂3 h后取樣。饑餓組和復(fù)投喂組在每個取樣時間點均取3尾試驗魚的下丘腦、肝臟和腸道用于總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR檢測饑餓和復(fù)投喂后agrp1和agrp2基因表達情況,實時熒光定量PCR方法與組織分布所用的方法相同。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

每個樣品進行2次實時熒光定量PCR,取2次的平均Ct值,運用2-ΔΔCt計算agrp1和agrp2基因相對表達量。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準差表示。利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,采用鄧肯多重比較進行各組之間agrp1和agrp2基因的表達量差異比較,當(dāng)P<0.05時,各組間具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 agrp基因序列分析與系統(tǒng)進化樹

從金錢魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中得到agrp1和agrp2基因的unigene片段,經(jīng)過亞克隆測序驗證后,得到金錢魚agrp1(GenBank登錄號:MW988084)和agrp2(GenBank登錄號:MW988085)基因的開放閱讀框序列。其中agrp1基因的開放閱讀框的長度為429 bp,共編碼142個氨基酸,預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為36.73 ku,等電點為5.16,蛋白質(zhì)N端1～24位氨基酸為信號肽,第24～25位為切割位點(圖1);agrp2基因的開放閱讀框的長度為351 bp,共編碼116個氨基酸,預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為64.19 ku,等電點為8.32,蛋白質(zhì)N端1～22位氨基酸為信號肽,第22～23位為切割位點(圖2)。預(yù)測的金錢魚AgRP1和AgRP2具有10個半胱氨酸殘基,并且形成5個保守的二硫鍵(圖3)。

圖1 金錢魚agrp1基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of the S. argus agrp1 gene

圖2 金錢魚agrp2基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence of the S. argus agrp2 gene

圖3 不同物種AgRP氨基酸序列多重比較Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences of AgRP in different species

同源性比較發(fā)現(xiàn),金錢魚的AgRP1和AgRP2 2種亞型的同源性為24.6%。在所選取的物種中,金錢魚AgRP1氨基酸序列與其他硬骨魚類的AgRP1同源性較高(70.4%～87.3%),金錢魚AgRP2氨基酸序列與其他硬骨魚類的AgRP2同源性較高(66.1%～86.2%)。金錢魚AgRP1與日本花鱸(Lateolabraxjaponicus) AgRP1、歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax) AgRP1、金頭鯛(Sparusaurata)AgRP1、大菱鲆(Scophthalmusmaximus) AgRP1、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes) AgRP1的同源性分別為87.3%、86.6%、85.2%、83.0%和70.4%。金錢魚AgRP2與歐洲舌齒鱸AgRP2、日本花鱸AgRP2、金頭鯛AgRP-like、大菱鲆AgRP2、紅鰭東方鲀AgRP2的同源性分別為86.2%、84.5%、83.6%、73.9%、66.1%。系統(tǒng)進化樹聚類結(jié)果顯示,AgRP在進化上分化為兩類,其中AgRP1與其他硬骨魚類的AgRP1和AgRP聚為一類,AgRP2則與其他硬骨魚類的AgRP2和AgRP-like聚為一類(圖4)。

圖4 基于AgRP1、AgRP2氨基酸序列構(gòu)建金錢魚與其他硬骨魚類的AgRP系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of the AgRP proteins in the butterfish S. argus and other teleosts

2.2 agrp基因在各組織中的表達

采用實時熒光定量PCR檢測agrp1和agrp2基因在金錢魚各組織的表達。agrp1基因在金錢魚各組織中均有表達,其中下丘腦和肌肉的表達量最高,其次在垂體、鰓、肝臟、心臟、脾臟和腸道等組織中也檢測到其表達(圖5a);而agrp2基因在下丘腦和垂體中表達較高,在鰓和心臟等組織中也檢測到其表達(圖5b)。

圖5 實時熒光定量PCR檢測金錢魚組織中agrp1(a)與agrp2(b)基因的表達情況Fig.5 Tissue distribution of the agrp1 (a) and agrp2 (b) in butterfish S. argus by qPCR

2.3 饑餓及復(fù)投喂對下丘腦、肝臟和腸道中agrp基因表達的影響

饑餓及復(fù)投喂試驗結(jié)果表明:下丘腦中,饑餓2 d后,agrp1基因表達水平與對照組相比差異不顯著(P>0.05),饑餓7 d后,agrp1基因表達水平與對照組相比顯著下調(diào)(P<0.05),饑餓7 d后再進行復(fù)投喂,發(fā)現(xiàn)agrp1基因表達水平上調(diào)到正常水平(圖6a);agrp2基因無論饑餓2、7 d還是復(fù)投喂后,其基因表達水平與對照組相比均無顯著變化(P>0.05)(圖6b)。肝臟中,饑餓2 d后,agrp1基因表達水平與對照組相比顯著下調(diào)(P<0.05),饑餓7 d后,agrp1基因表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),復(fù)投喂后,agrp1基因表達水平與對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖7a);agrp2基因無論饑餓2、7 d還是復(fù)投喂后,其基因表達水平與對照組相比無顯著性變化(P>0.05)(圖7b)。在腸道中,饑餓2 d后,agrp1基因表達水平與對照組相比無顯著性變化(P>0.05),饑餓7 d后,agrp1基因表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),復(fù)投喂后,agrp1基因表達水平下調(diào)到正常水平(圖8a);agrp2基因無論饑餓2、7 d還是復(fù)投喂后,其基因表達水平與對照組相比均無顯著性變化(P>0.05)(圖8b)。

圖6 饑餓及復(fù)投喂對金錢魚下丘腦中agrp1(a)和agrp2(b)基因表達的影響Fig.6 Effects of starvation and refeeding on the expression of agrp1(a) and agrp2(b) in the hypothalamus of the butterfish S. argus

圖8 饑餓及復(fù)投喂對金錢魚腸道中agrp1(a)和agrp2(b)基因表達的影響Fig.8 Effects of starvation and refeeding on the expression of agrp1(a) and agrp2(b) in the intestine of buterfish S. argus

3 討 論

3.1 金錢魚agrp基因序列、編碼氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析

AgRP屬于Agouti信號蛋白家族的一員,其C端具有一個富含半胱氨酸殘基的區(qū)域。2個半胱氨酸殘基之間形成1個二硫鍵,而二硫鍵對于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要作用[24]。本試驗結(jié)果顯示,金錢魚2種亞型AgRP在C端均具有10個半胱氨酸殘基,并形成5個二硫鍵。這一特征與金魚(Carassiusauratus)[25]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[26]、歐洲舌齒鱸[16]、紅鰭東方鲀[27]中的情況一致,且該結(jié)構(gòu)域高度保守,由此推測該結(jié)構(gòu)域在不同物種間可能具有相似的功能。

從美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫以及現(xiàn)有的文獻發(fā)現(xiàn),硬骨魚類agrp基因命名方式主要有3種:第1種是agrp1和agrp2,如日本花鱸等;第2種是agrp-like和agrp,如攀鱸(Anabastestudineus)、大黃魚和尖吻鱸(Latescalcarifer)等;第3種是agrp1和agrp,如金頭鯛等。氨基酸序列系統(tǒng)進化樹顯示,金錢魚AgRP1和AgRP2明顯聚為兩支,其中金錢魚AgRP1與其他硬骨魚類AgRP1、AgRP-like聚為一類,金錢魚AgRP2與其他硬骨魚類AgRP2、AgRP聚為一類。金錢魚AgRP1與其他硬骨魚類的AgRP1、AgRP-like同源性較高(66.9%～87.3%),與其他硬骨魚類AgRP2、AgRP同源性較低(19.7%～24.1%);金錢魚AgRP2氨基酸序列與其他硬骨魚類的AgRP2、AgRP同源性較高(59.0%～86.2%),與其他硬骨魚類AgRP1、AgRP-like同源性較低(20.20%～26.67%);此外,金錢魚AgRP1與金錢魚AgRP2的同源性較低,只有15.2%。系統(tǒng)進化樹以及同源性比對結(jié)果表明,金錢魚AgRP1與其他硬骨魚類AgRP1和AgRP-like屬于同一亞型,而金錢魚AgRP2與其他硬骨魚類的AgRP2、AgRP屬于另一種亞型。因此本試驗中,將金錢魚agrp基因的2種亞型命名為agrp1和agrp2。

3.2 金錢魚agrp基因在不同組織中表達的分析

在哺乳動物中,agrp基因主要在下丘腦中的弓狀核表達,通過拮抗黑素皮質(zhì)素-4受體的α-MSH效應(yīng),從而參與生物體的攝食調(diào)節(jié)[28-29]。金錢魚的組織分布結(jié)果顯示,agrp1和agrp2基因均在下丘腦中有高表達,這與齊口裂腹魚[24]、紅鰭東方鲀[27]、斑馬魚[15]和金魚[25]的情況吻合。研究結(jié)果提示,與哺乳動物相似,魚類的下丘腦可能也是調(diào)節(jié)食欲和能量平衡的關(guān)鍵區(qū)域。在金錢魚中,agrp1基因還在垂體和肌肉中檢測到高表達,agrp2基因在垂體中檢測到高表達。在其他魚類歐洲舌齒鱸中,agrp1基因主要在腦、卵巢和后腎中表達,agrp2基因主要在腦中表達[16];在大西洋鮭中,agrp1基因主要在腦垂體和皮膚中表達,agrp2基因主要在腸道、肌肉和性腺中表達[11];在鯉(Cyprinuscarpio)中,agrp1基因在腦、眼和腸道中高表達,而agrp2基因在鰓和眼中高表達[10]。這些結(jié)果表明,agrp的2種亞型基因的表達在魚類存在組織表達差異和物種差異,而且在不同魚類之間也存在物種差異,這種差異性表達需要進一步深入研究才能闡明其原因。

3.3 饑餓及復(fù)投喂?fàn)顟B(tài)下金錢魚agrp基因表達分析

已有研究表明,AgRP1主要參與攝食行為的調(diào)節(jié),AgRP2主要作為神經(jīng)內(nèi)分泌因子參與應(yīng)激調(diào)節(jié)[14]。本試驗結(jié)果顯示,金錢魚下丘腦中agrp1基因表達水平在饑餓7 d后下調(diào)。與金錢魚類似,禁食6 d的大西洋鮭agrp1基因表達水平下調(diào)[11];團頭魴短期饑餓后,腦組織中agrp基因表達水平先降后升再降[17];鯉短期饑餓后,其agrp基因表達水平下調(diào)[10]。饑餓2 d后,斑馬魚agrp基因表達水平上調(diào),復(fù)投喂后迅速恢復(fù)到對照組水平[15];與斑馬魚類似,金錢魚下丘腦中agrp1基因表達水平在復(fù)投喂3 h后也恢復(fù)到正常水平。魚類禁食后agrp1基因表達的下調(diào)可能與饑餓期間瘦素表達上升,AgRP表達受到抑制有關(guān)[30]。但金錢魚中饑餓導(dǎo)致的agrp1基因表達下調(diào)是否與瘦素抑制有關(guān),需要進一步深入研究。與金錢魚不同,短期饑餓會上調(diào)金魚[25]和歐洲舌齒鱸[16]agrp基因的表達。這種不同物種中AgRP在攝食調(diào)節(jié)中的差異性表明,在短期饑餓情況下,生物體內(nèi)存在某種機制使得原本正常分泌的AgRP減少,以適應(yīng)環(huán)境的變化[31],但具體機理有待進一步研究。食物缺乏時,鱸(Moronesaxatilis)[32]和露斯塔野鯪(Labeorohita)[33]肝臟中的瘦素分泌減少。在小鼠中發(fā)現(xiàn),瘦素分泌減少可導(dǎo)致AgRP的分泌增加[34]。金錢魚agrp1基因在肝臟和腸道中的表達模式與下丘腦中的相反,饑餓期間agrp1基因表達量顯著上調(diào),復(fù)投喂后顯著下調(diào)到正常水平。饑餓和復(fù)投喂中,金錢魚肝臟和腸道中agrp1基因的這種變化是否受到瘦素表達水平的影響有待進一步深入研究。在金錢魚下丘腦、肝臟和腸道中agrp2基因表達水平在饑餓及復(fù)投喂過程均無顯著變化。在歐洲舌齒鱸[16]和大西洋鮭[11]中均發(fā)現(xiàn),饑餓對agrp2基因表達水平影響不大,這提示AgRP2可能不調(diào)節(jié)金錢魚攝食[14]。在本研究中,金錢魚下丘腦、肝臟和腸道中agrp1基因在饑餓及復(fù)投喂后的表達具有顯著的變化,這表明參與金錢魚攝食過程的主要是AgRP1。但魚類的攝食調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程,AgRP在金錢魚攝食調(diào)節(jié)中的作用及作用機制有待進一步證實。

4 結(jié) 論

筆者克隆了金錢魚agrp1和agrp2 2種亞型基因,agrp1基因主要在下丘腦和肌肉中表達,agrp2基因主要在下丘腦和腦垂體中表達,饑餓及復(fù)投喂顯著影響了金錢魚下丘腦、肝臟和腸道組織中agrp1基因的表達。這些結(jié)果表明,下丘腦、肝臟和腸道中的agrp1基因參與了金錢魚攝食過程的調(diào)節(jié)。