陳爾東, 高孜航, 王坤東, 雷華明

(上海交通大學(xué) 電子信息與電氣工程學(xué)院,上海 200240)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)體外快速擴(kuò)增DNA片段,自1983年由Mullis等[1]發(fā)明以來被廣泛運(yùn)用于基因檢測領(lǐng)域.由此發(fā)展而來的實(shí)時熒光定量PCR儀通過熒光分子插入DNA片段中實(shí)現(xiàn)對待測DNA樣本的定量檢測[2].PCR反應(yīng)主要分為3步:變性、退火、延伸.重復(fù)這3個步驟實(shí)現(xiàn)DNA片段的分裂、配對和復(fù)制,該反應(yīng)需要熱循環(huán)系統(tǒng)精確控制樣品在65～95 ℃循環(huán)[3-4].PCR的效率和速度取決于反應(yīng)的內(nèi)容如聚合酶濃度和引物設(shè)計[5],以及有效溫度循環(huán)、影響反應(yīng)開始時的轉(zhuǎn)變溫度和斜坡溫度的持續(xù)時間[6].目前常見的PCR熱循環(huán)系統(tǒng)存在耗時長、操作復(fù)雜、設(shè)備成本高的問題[7].其通過保持試液靜止,控制加熱基座溫度變化對試液進(jìn)行升溫和降溫[8],完成一次檢測需要進(jìn)行35～40次溫度循環(huán)約2～3 h,時間大部分耗費(fèi)在控制加熱基座和周圍環(huán)境的溫度變化上[9-11].針對上述問題,Wu等[12]開發(fā)了基于管道的油浴PCR加熱方法,通過多物理場仿真,確定合適的管道尺寸,利用液體自然對流實(shí)現(xiàn)不同溫度之間的循環(huán)流動.Li 等[13]使用半導(dǎo)體制冷器(Thermoelectric Cooler,TEC)作為熱源,通過改進(jìn)的多模式比例積分微分 (Proportional Integral Derivative, PID)算法減少穩(wěn)態(tài)時間、提高反應(yīng)速率,該方法需要復(fù)雜的溫控算法,在溫度變化過程中容易受到超調(diào)、振蕩的不良影響[14].Trauba等[15]采用微流控技術(shù)使用4個銅塊作為熱源,20 μL樣品流經(jīng)由聚碳酸酯制成的微流體管道實(shí)現(xiàn)加熱,約52 s 可以實(shí)現(xiàn)30次循環(huán),但這類PCR制造成本高且后期不能修改循環(huán)次數(shù)[16].此外,也有學(xué)者使用非接觸式傳熱方式來提高效率,Lee等[17]采用激光對樣品進(jìn)行加熱,與傳統(tǒng)方式相比激光能量密度高且沒有熱慣性,可以有效提高熱循環(huán)效率,但設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本高且難以小型化.

隨著PCR技術(shù)的發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)將退火溫度和延伸溫度合為一個溫度也能實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增,即兩步法 PCR,常用于靶基因較短的擴(kuò)增,該方法和需要3個不同溫度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)相比,所需時間較短,控制較為方便[18].本研究采用二步法PCR方案,設(shè)計了PCR熱循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)及其溫控電路,使用增量式PID算法控制基座溫度穩(wěn)定在65和95 ℃實(shí)現(xiàn)兩個恒溫區(qū),通過使樣品盤在不同恒溫區(qū)域中旋轉(zhuǎn),實(shí)現(xiàn)快速溫度循環(huán).避免了加熱器件溫度反復(fù)變化,能明顯節(jié)約反應(yīng)時間,提高檢測效率.同時,針對PCR試液溫度變化過程中的傳熱滯后效應(yīng)[19-20],分析了該熱循環(huán)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)并構(gòu)建傳熱機(jī)理,采用Fluent軟件對試液加熱的延遲現(xiàn)象進(jìn)行有限元分析.由上述仿真結(jié)果對該熱循環(huán)系統(tǒng)PCR試液的真實(shí)溫度變化規(guī)律進(jìn)行合理預(yù)測并對溫度延遲時間補(bǔ)償,最后利用PCR熱循環(huán)系統(tǒng)樣機(jī)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,得到試液的實(shí)際溫度變化,結(jié)果表明該設(shè)計PCR熱循環(huán)系統(tǒng)能提高檢測效率,滿足快速PCR檢測的需求.

1 PCR熱循環(huán)系統(tǒng)硬件設(shè)計

1.1 機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計

PCR熱循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)主要包括加熱基座和試液盤,如圖1所示.加熱基座實(shí)現(xiàn)分區(qū)溫控,將溫度分為65 ℃恒溫區(qū)、95 ℃恒溫區(qū)、冷卻區(qū).試液盤具有4個試液腔可以同時檢測4路樣品.腔體底部采用一層薄膜,隔絕外部環(huán)境又能保證與加熱塊緊密接觸增加傳熱效率.加熱基座包括6個紫銅加熱塊,用溫控電路將加熱塊穩(wěn)定在設(shè)定溫度,加熱塊之間使用硅酸鋁棉包覆以降低與空氣的對流換熱系數(shù),銅塊由下方的加熱陶瓷片進(jìn)行加熱,溫度傳感器嵌入鋁塊和陶瓷加熱片之間檢測加熱基座的溫度.

將待測試液裝載樣品盤中后,上位機(jī)發(fā)送指令控制樣品盤旋轉(zhuǎn),依次經(jīng)過95 ℃恒溫區(qū)、冷卻區(qū)、65 ℃ 恒溫區(qū),旋轉(zhuǎn)一周可實(shí)現(xiàn)2次熱循環(huán).重復(fù)以上過程以實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增.在每次循環(huán)結(jié)束后,試液腔都會經(jīng)過加熱基座上的熒光檢測開孔,激發(fā)光和熒光分別經(jīng)過該孔入射和出射,實(shí)現(xiàn)實(shí)時熒光定量檢測功能.

1.2 電路設(shè)計

PCR熱循環(huán)的電路部分實(shí)現(xiàn)對兩個恒溫區(qū)溫度的高精度控制,確保PCR反應(yīng)能正常進(jìn)行.其電路的主要成如圖2所示,包括上位機(jī)、主控模塊、溫控驅(qū)動模塊、測溫模塊.

圖2 PCR熱循環(huán)系統(tǒng)電路構(gòu)成Fig.2 Circuit composition of PCR thermal cycling system

主控模塊由STM32C8T6及外圍電路組成,主要控制脈沖寬度調(diào)制(Pulse Width Modulation, PWM)驅(qū)動電路加熱陶瓷片、讀取溫度值以及將溫度數(shù)據(jù)通過控制器局域網(wǎng)總線(Controller Area Network, CAN)通信協(xié)議傳輸給上位機(jī)模塊.

溫度驅(qū)動模塊主要由L6203橋式驅(qū)動芯片和加熱陶瓷片組成,主控模塊產(chǎn)生PWM信號,通過SN74LVCT45將晶體管-晶體管邏輯(Transistor-Transistor Logic, TTL)電平轉(zhuǎn)換為+5 V電平的同時增加驅(qū)動能力,最后輸出到L6203芯片產(chǎn)生最大5 A的電流驅(qū)動加熱陶瓷片.采用的薄膜陶瓷片內(nèi)阻為10 Ω,考慮芯片的散熱條件,最大加熱功率能達(dá)到10 W,系統(tǒng)啟動時加熱基座能到達(dá)最快6 ℃/s 的升溫速率.

測溫模塊能實(shí)時采集加熱基座的溫度,并作為溫控程序的反饋信號,以保證溫度恒定,使PCR反應(yīng)能正常完成.該模塊主要包括溫度傳感器和AD采集電路,反應(yīng)溫度主要集中于50～100 ℃的中低溫范圍,溫度傳感器采用Pt100鉑電阻,其精度高、穩(wěn)定性好,若將溫度傳感器直接放入樣品腔中能直接測出試液溫度但容易污染試液,因此將Pt100嵌入陶瓷加熱片上,后續(xù)通過分析傳熱過程預(yù)估試液的真實(shí)溫度.AD采集電路部分使用24位模數(shù)轉(zhuǎn)換器LTC2440,采用三線制電橋法測量Pt100阻值變化,隨后通過AD620儀表放大器,放大倍數(shù)設(shè)15倍使其輸出接近AD的量程,達(dá)到最佳精度.經(jīng)測試,溫度采集精度能到達(dá)±0.1 ℃.

2 試液溫度仿真分析

2.1 傳熱機(jī)理分析

PCR熱循環(huán)系統(tǒng)使用的熱傳遞方式主要為熱傳導(dǎo).試液加瓷加熱片—質(zhì)加熱基座—試管—試液,這是一個非穩(wěn)態(tài)熱傳遞過程.在經(jīng)過一定時間后,試液溫度才能逐漸穩(wěn)定在設(shè)定溫度上.因此試液在每個恒溫區(qū)的停留時間為反應(yīng)時間和溫度穩(wěn)定需要的時間之和.試液處在一個體積小、密封的環(huán)境中做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動,難以布置傳感器在不影響反應(yīng)的情況下直接測得試液溫度,因此采用Fluent對該瞬態(tài)熱傳遞過程進(jìn)行有限元分析得到試液的真實(shí)溫度變化曲線.

2.2 仿真模型構(gòu)建

由熱力學(xué)原理可知,熱傳遞可分為3類邊界條件:①給定邊界溫度;②給定邊界熱流密度;③給定邊界換熱系數(shù)和流體溫度.PCR熱循環(huán)系統(tǒng)的熱傳遞涉及流固耦合傳熱,使用Fluent進(jìn)行仿真分析.由于試液腔下方與加熱基座直接接觸,所以加載第一類邊界條件,樣品盤上方及左右與空氣直接接觸加載第三類邊界條件.4個試液位置對稱且傳熱條件一致,因此只對其中一個樣品的傳熱過程進(jìn)行仿真.各材料對應(yīng)熱性能參數(shù)如表1所示.

表1 傳熱模型各區(qū)域熱物性參數(shù)

首先使用meshing進(jìn)行網(wǎng)格劃分,全局網(wǎng)格尺寸設(shè)置為0.2 mm,在不同材料的傳熱表面對網(wǎng)格進(jìn)行膨脹加密以提高計算準(zhǔn)確性.總共生成節(jié)點(diǎn)數(shù)量 98 426,單元數(shù)量 349 878,反應(yīng)網(wǎng)格質(zhì)量的偏態(tài)(skewness)系數(shù)為0.208,表明具有較好的網(wǎng)格質(zhì)量,網(wǎng)格模型如圖3所示.

圖3 傳熱模型網(wǎng)格劃分和仿真溫度云圖Fig.3 Meshing and simulation temperature cloud map of heat transfer model

2.3 仿真結(jié)果分析

反應(yīng)的每個階段保持時間取決于檢測目標(biāo)和引物的種類[21-22],以目前常見的PCR反應(yīng)為例進(jìn)行仿真.設(shè)定在單次循環(huán)過程中,需在95 ℃溫度(T)下保持時間(t)15 s,65 ℃保持40 s.如圖4所示,將該溫度曲線加載為試液的邊界條件進(jìn)行仿真,取試液中心點(diǎn)的溫度值繪制曲線.在變性階段試液溫度從65 ℃升溫到95 ℃,此過程僅耗時5.8 s,保持該溫度15 s,隨后試液溫度經(jīng)過6.1 s從95 ℃下降并穩(wěn)定在65 ℃進(jìn)入退火/延伸階段.在每個擴(kuò)增循環(huán)中試液的升溫和降溫過程中損耗的時間僅為11.9 s,完成一次循環(huán)所需的時間為68 s.相較傳統(tǒng)的變溫式加熱方法有效提升了反應(yīng)速率.

圖4 PCR單次循環(huán)試液溫度仿真Fig.4 Temperature simulation of PCR single cycle test solution

3 溫控算法設(shè)計

在PCR技術(shù)中,對溫度的控制非常重要.在高溫變性階段如果溫度過高會影響聚合酶的活性降低DNA擴(kuò)增效率,如果溫度過低會導(dǎo)致變性不充分,極可能出現(xiàn)假陰性;在低溫退火階段溫度過高或者過低則會影響PCR反應(yīng)的特異性.尤其對于定量PCR儀而言,需要盡可能保持每次循環(huán)溫度穩(wěn)定.因此,對于PCR的溫度控制要求控制精度高、超調(diào)小、調(diào)節(jié)時間短.該設(shè)計采用分區(qū)溫控的熱循環(huán)方式,可以簡化溫控算法,只需保證有較小的調(diào)節(jié)時間和靜態(tài)誤差,無需讓加熱片反復(fù)升溫和降溫.因此采用經(jīng)典PID控制,其是最早發(fā)展起來的控制策略之一,算法簡單、魯棒性好、可靠性高,被廣泛應(yīng)用于工業(yè)過程控制[23].PID算法可表示為

(1)

式中:Kp為比例控制系數(shù);Ki為積分控制系數(shù);Kd為微分控制系數(shù);e(t)為當(dāng)前值與目標(biāo)值的誤差.Kp能加快系統(tǒng)響應(yīng)速度,但數(shù)值過大容易產(chǎn)生超調(diào);Ki能減小系統(tǒng)靜態(tài)誤差,積分過大容易影響系統(tǒng)穩(wěn)定性;Kp根據(jù)偏差變化趨勢調(diào)節(jié)系統(tǒng),能降低調(diào)節(jié)時間,但過大會引起系統(tǒng)振蕩.為了減小誤差累加,增加系統(tǒng)抗干擾能力,采用增量式PID算法,其算式為

Δu(k)=Kp(e(k)-e(k-1))+Kie(k)+

Kd(e(k)-2e(k-1)+e(k-2))

(2)

式中:Δu(k)為控制量的增量;e(k)、e(k-1)和e(k-2)為最近3次采樣的誤差值.Δu(k)僅與最近3次的采樣值有關(guān),與位置式PID相比占用內(nèi)存小,改善了積分飽和現(xiàn)象.

最后利用Ziegler-Nichols方法進(jìn)行參數(shù)整定.首先對65 ℃加熱模塊進(jìn)行整定,將Kd=0、Ki=0,Kp設(shè)置為較小的值,隨后逐漸增大Kp使系統(tǒng)出現(xiàn)等幅振蕩,記錄此時的增益和振蕩周期,最后用經(jīng)驗(yàn)公式求得PID參數(shù)為Kp=210、Ki=32、Kd=18.采用類似方法得到95 ℃的PID參數(shù)為Kp=100、Ki=110、Kd=250.該參數(shù)下基座的升溫曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5～6所示.

圖5 65 ℃恒溫區(qū)基座升溫曲線Fig.5 Heating curve of constant temperature zone of 65 ℃

圖6 95 ℃恒溫區(qū)基座升溫曲線Fig.6 Heating curve of constant temperature zone of 95 ℃

由加熱曲線可以看出,65 ℃恒溫區(qū)的超調(diào)量為0.96%,調(diào)節(jié)時間為31.2 s,靜態(tài)誤差為0.05 ℃;95 ℃ 恒溫區(qū)的超調(diào)量為0.83%,調(diào)節(jié)時間為 23.5 s,靜態(tài)誤差為0.07 ℃.65 ℃恒溫區(qū)面積較大熱容量也較大,因此在功率相同的情況下65 ℃恒溫區(qū)調(diào)節(jié)時間比95 ℃恒溫區(qū)長.結(jié)果表明,該加熱基座設(shè)計滿足PCR系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)精度高的要求.

4 樣機(jī)試液溫度試驗(yàn)

搭建試驗(yàn)樣機(jī)如圖7所示,上位機(jī)控制試液盤在恒溫區(qū)中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)運(yùn)動.使用50 μL水代替反應(yīng)試液,將K型熱電偶插入試液腔中對試液溫度進(jìn)行測量.在反應(yīng)過程中,每個階段時間應(yīng)包含上文中仿真得到的熱延遲時間,因此95和65 ℃的停留設(shè)置為20.8和46.1 s.采集其中兩個循環(huán)的試液溫度變化曲線如圖8所示.

圖7 PCR樣機(jī)試液測溫裝置圖Fig.7 Temperature measuring device of PCR prototype test solution

圖8 試液溫度變化曲線Fig.8 Temperature of test solution

該結(jié)果表明,反應(yīng)過程中試液溫度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后與目標(biāo)溫度差小于±0.2 ℃,試液熱延遲引起的時滯后效應(yīng)大致符合上文的仿真結(jié)果,加熱時間為7.9 s,與仿真結(jié)果相差1.1 s;冷卻時間為6.8 s,與仿真結(jié)果相差0.7 s,表明該仿真模型能較好地預(yù)測試液的實(shí)際變化規(guī)律,較準(zhǔn)確地補(bǔ)償實(shí)際工作中每階段的停留時間.此外,試液在升溫過程中不會受到超調(diào)的影響,實(shí)際升溫速度達(dá)到3.8 ℃/s,實(shí)際降溫速度達(dá)到4.4 ℃/s.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,基于分區(qū)溫控的PCR熱循環(huán)系統(tǒng)能有效縮短PCR反應(yīng)所需時間,較好實(shí)現(xiàn)了預(yù)期指標(biāo).

5 結(jié)語

PCR自發(fā)明以來,已成為遺傳分析的強(qiáng)大工具.PCR反應(yīng)時間與溫度循環(huán)密切相關(guān).為縮短反應(yīng)時間,設(shè)計一種用于實(shí)時熒光PCR的熱循環(huán)系統(tǒng),采用恒溫區(qū)切換的方式對試液進(jìn)行加熱.通過結(jié)構(gòu)和軟件設(shè)計,實(shí)現(xiàn)了±0.1 ℃的恒溫區(qū)溫控精度和試液最高3.8 ℃/s的升溫速度以及4.4 ℃/s的降溫速度.結(jié)果證明,該溫控系統(tǒng)滿足了PCR的要求,為DNA擴(kuò)增提供了可靠快速的反應(yīng)環(huán)境.同時,與傳統(tǒng)變溫式加熱PCR儀相比,該設(shè)計避免了需控制基座反復(fù)達(dá)到目標(biāo)溫度的時間,縮短了單次PCR循環(huán)的過程,提高了核酸檢測效率.理論仿真結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該分區(qū)溫控方案能有效提高PCR熱循環(huán)效率,所提出的PCR熱循環(huán)系統(tǒng)具有小型化、易操作、低成本的特點(diǎn),從而為正在研制的實(shí)時熒光PCR儀提供了理論依據(jù)和堅實(shí)基礎(chǔ).