王 歡, 曹征鴻, 葉恭銀, 黨 聰*

1上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 上海 201699; 2浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所, 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310058; 3鷹潭市林業(yè)局, 江西 鷹潭 335001

我國是世界上第一大水稻OryzasativaL.生產(chǎn)國,面對(duì)日趨嚴(yán)重的糧食危機(jī),水稻的綠色高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)于我國糧食安全至關(guān)重要(FAOetal.,2022)。近年來,由于蟲源基數(shù)、種植制度、作物布局、氣候變化、害蟲抗藥性等因素,我國水稻病蟲害發(fā)生呈上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)Bt(Bacillusthuringiensis)基因抗蟲水稻(簡稱Bt水稻)為水稻害蟲防治提供了新的途徑(https:∥www.natesc.org.cn/)。我國在轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻研究方面處于領(lǐng)先地位,目前已經(jīng)有一系列的Bt水稻相繼問世(Lietal.,2016)。其中“華恢1號(hào)”水稻(轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因)已經(jīng)先后2次拿到我國生物安全證書,并且通過了美國食品和藥品管理局的安全性評(píng)價(jià)咨詢,標(biāo)志著Bt水稻商業(yè)化種植又邁出了重要的一步(https:∥www.accessdata.fda.gov/scripts/fdcc/?set=Biocon)。Bt水稻抗蟲效果評(píng)價(jià)是商業(yè)化種植的基礎(chǔ),也是支撐Bt水稻在病蟲害綜合治理中重要性的科學(xué)依據(jù)。

轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗蟲效果主要來源于其體內(nèi)表達(dá)的Bt殺蟲蛋白,這類蛋白進(jìn)入昆蟲腸道后經(jīng)蛋白酶水解成小肽,結(jié)合到中腸上皮細(xì)胞膜的特異性受體上,使細(xì)胞通透性發(fā)生變化,進(jìn)而引起害蟲死亡(Schnepfetal.,1998)。然而,多種因素可能影響B(tài)t蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響其抗蟲效果。Bt蛋白含量在轉(zhuǎn)基因植物的不同生長季節(jié)及不同組織中有所不同,張益文等(2012)發(fā)現(xiàn)Cry1Ac蛋白含量在抗蟲棉生長過程中均呈動(dòng)態(tài)下降趨勢(shì),而根中下降的速率最快,莖和葉片次之。非生物脅迫因素也可能影響B(tài)t蛋白的表達(dá)水平:姜周庚等(2012)的研究結(jié)果表明,高溫脅迫會(huì)顯著降低抗蟲棉鈴殼中Bt蛋白表達(dá)量,且隨著溫度水平的提高,下降的幅度也更大;張祥等(2017)發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下,供試抗蟲棉鈴殼中殺蟲蛋白質(zhì)含量下降;低溫、高鹽等非生物脅迫因子均會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉及抗蟲玉米中Bt蛋白的表達(dá)水平(常麗娟等,2020; Trtikovaetal.,2015)。

目前,關(guān)于生物脅迫因子(病害、蟲害侵染等)對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物中Bt蛋白表達(dá)的影響研究較少。本試驗(yàn)以Bt水稻T1C-19 (表達(dá)Cry1C蛋白)為研究對(duì)象,探究水稻6種常見病蟲害脅迫下其體內(nèi)Bt蛋白的表達(dá)量變化,以期為Bt水稻的抗蟲效果評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ),也為Bt水稻病蟲害綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試水稻

試驗(yàn)所用Bt水稻品系為T1C-19,是采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的表達(dá)cry1C基因的轉(zhuǎn)基因水稻。轉(zhuǎn)入的cry1C基因是以蘇云金芽孢桿菌的野生型cry1Ca5基因?yàn)槟０?通過去除一些影響其在植物細(xì)胞表達(dá)的序列,并且根據(jù)植物中的密碼子偏好性來優(yōu)化設(shè)計(jì)的,由玉米ZeamaysL. 的ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),T1C-19在田間和室內(nèi)條件下對(duì)鱗翅目水稻害蟲二化螟Chilosuppressalis(Walker)、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenée等都表現(xiàn)高抗(Tangetal.,2006)。對(duì)照是非轉(zhuǎn)基因親本明恢63 (MH63)。所有供試水稻采用木村營養(yǎng)液室內(nèi)培養(yǎng)(Yoshidaetal.,1976)。

1.2 供試?yán)ハx

試驗(yàn)所用的褐飛虱NilaparvatalugensStál、黑尾葉蟬NephotettixcincticepsUhler和二化螟均采自于浙江大學(xué)農(nóng)場(chǎng),采回后在人工氣候室內(nèi)分別于感蟲水稻品種TN1(Taichung Native 1,國際標(biāo)準(zhǔn)水稻鑒定品種)上連續(xù)飼養(yǎng)多代。室內(nèi)飼養(yǎng)條件:溫度(28±1) ℃,光周期(明∶暗)14∶10,相對(duì)濕度(60±5)%,光照度3500～4000 lx。

1.3 供試病害

試驗(yàn)所用的稻瘟病菌PyriculariagriseaCavara為野生型Guy11,培養(yǎng)基為CM培養(yǎng)基。所用的白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaeIshiyama為PXO99小種,培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基。水稻普通矮縮病毒(Ricedwarfvirus, RDV)由黑尾葉蟬傳播。所用菌種與80%甘油按照1∶1混合后保存于-70 ℃冰箱,使用之前在相應(yīng)平板上分別進(jìn)行劃線活化。

1.4 蟲害脅迫試驗(yàn)

取1株苗齡40 d左右的T1C-19和MH63稻株于自制養(yǎng)蟲籠(高36 cm,直徑10 cm,由2個(gè)保鮮盒組成,將根莖分開)中,每籠接入饑餓處理6 h的褐飛虱(或黑尾葉蟬)3～4齡若蟲10頭,待褐飛虱(或黑尾葉蟬)取食3 d之后,分別對(duì)每株水稻的葉片和葉鞘進(jìn)行取樣,保存于-70 ℃冰箱用于后續(xù)Bt蛋白含量檢測(cè)。同樣,取1株苗齡40 d左右的T1C-19和MH63稻株于自制養(yǎng)蟲籠中,每籠接入饑餓處理6 h的二化螟2～3齡幼蟲10頭,待二化螟取食3 d后,取出水稻葉鞘中的二化螟幼蟲,分別取每株水稻的葉片和葉鞘進(jìn)行檢測(cè)。以未接蟲的水稻作為對(duì)照,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.5 病害脅迫試驗(yàn)

將稻瘟病菌株Guy11的孢子制成約每毫升105個(gè)的孢子懸浮液,參考劉同寶(2008)的方法,取10 mL孢子懸浮液用噴霧器噴灑到1株水稻植株上。噴霧完后,用黑色塑料袋將接種的水稻套住密封避光培養(yǎng)36 h,其間多次噴水加濕。36 h后去除塑料袋,正常培養(yǎng)。5 d后,接病的植株葉片逐漸出現(xiàn)小病斑,2周后病斑明顯,出現(xiàn)典型的梭形病斑,取其中癥狀明顯的水稻葉片及葉鞘用于Bt蛋白含量檢測(cè),以未接菌的水稻作為對(duì)照,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

將白葉枯病菌PXO99菌液配成光密度0.8～1.0的細(xì)菌懸浮液,參考儲(chǔ)昭暉(2006)的方法,用剪刀沾菌液后,剪水稻上部健康葉片葉尖1～2 cm,每沾一次菌液剪1～2片葉,每株剪5～6片葉。接種完后,放置在溫室中培養(yǎng)10 d左右,水稻葉片剪葉周圍呈枯白色,15～20 d癥狀明顯,部分水稻葉片上部呈枯白色卷曲。取其中癥狀明顯的水稻葉片及葉鞘用于Bt蛋白含量檢測(cè),以未接菌的水稻作為對(duì)照,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

取4～5葉期的T1C-19和MH63水稻各15株,移栽到密封接蟲瓶中,每株水稻內(nèi)接一頭帶毒的黑尾葉蟬若蟲,取食3 d后,移栽到溫室中培養(yǎng),4 d左右,水稻葉片中央葉脈周圍會(huì)出現(xiàn)一連串透明的白點(diǎn),即為水稻普通矮縮病癥狀。2周后,取經(jīng)過傳毒的新鮮水稻葉片0.1 g,采用TRIZOL法提取水稻葉片總RNA,并用試劑盒One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以RDV的S8片段設(shè)計(jì)引物(F:5′-ATAGCTGGCGTTACGGCTAC-3′;R:5′-AAACCGTCCACCTGACTACG-3′)進(jìn)行PCR,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,確認(rèn)水稻植株是否帶RDV病毒(王前進(jìn),2017)。取經(jīng)過帶毒驗(yàn)證的水稻植株的葉片及葉鞘,用于Bt蛋白含量檢測(cè),以未傳毒的水稻為對(duì)照,每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.6 Bt蛋白含量測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫試劑盒(ENVIROLOGIX)測(cè)定Bt蛋白的含量,各處理中用于Bt蛋白含量測(cè)定的水稻組織為0.1 g (鮮質(zhì)量)。參考Dangetal.(2021)中的操作步驟,將取樣的水稻組織液氮冷凍后,用組織研磨儀充分磨碎,加1 mL提取液振蕩提取2 h后,15000 r·min-14 ℃離心5 min,取上清液按照1∶50的體積比例稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的具體步驟參照試劑盒的說明書進(jìn)行,酶標(biāo)儀采用Varioskan Flash (Thermo Scientific, 美國)全波長多功能酶標(biāo)儀,分別在波長450和650 nm測(cè)定相應(yīng)光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中Bt蛋白的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

將測(cè)得的各樣品Bt蛋白含量用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Studentt檢驗(yàn)比較被病蟲害侵染的水稻與未被侵染水稻中Bt蛋白含量的差異(α=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 水稻蟲害脅迫對(duì)Bt蛋白含量的影響

相較于未被褐飛虱取食的Bt水稻(圖1A),葉片中Bt蛋白含量在褐飛虱取食后出現(xiàn)顯著下降(t=-4.454,P=0.005),而葉鞘中Bt蛋白含量在褐飛虱取食后沒有出現(xiàn)顯著變化(t=-1.679,P=0.202)。對(duì)于另外一種刺吸式害蟲黑尾葉蟬(圖1B),取食T1C-19后葉鞘中Bt蛋白含量發(fā)生顯著下降(t=3.581,P=0.046),而葉片中Bt蛋白含量與未被取食的水稻之間沒有顯著差異(t=1.050,P=0.797)。二化螟取食T1C-19前后(圖1C),水稻葉鞘及葉片中Bt蛋白含量均沒有發(fā)生顯著變化。

圖1 褐飛虱(A)、黑尾葉蟬(B)、二化螟(C)脅迫下T1C-19水稻葉片和葉鞘中Bt蛋白含量

2.2 水稻病害脅迫對(duì)Bt蛋白含量的影響

對(duì)于水稻病害脅迫(圖2),感染稻瘟病和健康轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量均沒有顯著差異(葉片:t=2.079,P=0.066;葉鞘:t=-0.892,P=0.398)。而白葉枯病菌侵染極顯著促進(jìn)了T1C-19水稻葉鞘中Bt蛋白含量的上升(t=8.656,P=0.001),并沒有影響葉片中Bt蛋白含量(t=1.805,P=0.145)。與未感染RDV的T1C-19水稻相比,感染了RDV的水稻葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量均沒發(fā)生顯著變化(葉片:t=1.579,P=0.165;葉鞘:t=-0.610,P=0.575)。

3 討論

轉(zhuǎn)基因作物品系培育出來之后,在自然條件下是否有預(yù)期的目標(biāo)優(yōu)良性狀,需要對(duì)其進(jìn)行抗性效率評(píng)價(jià)。對(duì)于抗蟲作物,重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)靶標(biāo)害蟲的抗蟲效果。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)指南》的規(guī)定,抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的功能效率評(píng)價(jià)需提供在室內(nèi)和田間試驗(yàn)條件下,轉(zhuǎn)基因植物對(duì)靶標(biāo)生物的抗性生物測(cè)定報(bào)告、靶標(biāo)生物在轉(zhuǎn)基因材料及受體品種田間季節(jié)性發(fā)生危害情況和種群動(dòng)態(tài)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)論。目前,多種因素已被發(fā)現(xiàn)可能影響B(tài)t作物體內(nèi)Bt蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響其抗蟲效果。因此,開展生物因子或非生物因子對(duì)作物中Bt殺蟲蛋白含量的影響是Bt作物抗蟲效果評(píng)價(jià)的關(guān)鍵內(nèi)容。

從病蟲害脅迫的結(jié)果中可發(fā)現(xiàn),病蟲害脅迫因種類不同對(duì)Bt水稻中Bt蛋白表達(dá)量的影響不同。二化螟、水稻普通矮縮病、稻瘟病對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量影響不明顯;褐飛虱的取食會(huì)造成轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19葉片的Bt蛋白含量明顯降低,而對(duì)葉鞘的Bt蛋白含量沒有明顯影響;黑尾葉蟬的取食會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19葉鞘的Bt蛋白含量明顯降低,而對(duì)葉片沒有明顯影響;轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19在感染白葉枯病后葉鞘內(nèi)Bt蛋白含量會(huì)明顯上升,而對(duì)葉片內(nèi)Bt蛋白含量沒有顯著影響。研究表明,轉(zhuǎn)Bt基因植物的抗蟲性與其體內(nèi)表達(dá)的Bt蛋白含量呈正相關(guān),即表達(dá)量越高,抗蟲效果越好(華樺,2012)。當(dāng)轉(zhuǎn)基因作物體內(nèi)的Bt蛋白含量在受到外界因素影響而變化時(shí),作物的抗蟲性也會(huì)隨之發(fā)生變化,有可能給我們農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來損失。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在實(shí)際生產(chǎn)上就有高溫氣候下不抗蟲的現(xiàn)象,陳源等(2014)研究發(fā)現(xiàn),38 ℃以上的高溫會(huì)使抗蟲棉棉蕾中Bt蛋白表達(dá)量顯著降低,導(dǎo)致其抗蟲效果大幅度降低。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻目前還沒有在脅迫條件下不抗蟲的報(bào)道,而本研究發(fā)現(xiàn),褐飛虱、黑尾葉蟬和白葉枯病均會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19的Bt蛋白表達(dá)量產(chǎn)生影響,至于這種影響是否會(huì)導(dǎo)致T1C-19水稻對(duì)靶標(biāo)害蟲的抗性變化,還需要進(jìn)一步研究,但在今后的研究和實(shí)際生產(chǎn)上要對(duì)這個(gè)問題引以重視。

對(duì)于褐飛虱、黑尾葉蟬取食和白葉枯病感染導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19體內(nèi)Bt蛋白含量變化的原因,目前還不明確。姜周庚等(2012)研究發(fā)現(xiàn),高溫脅迫下Bt棉棉鈴內(nèi)Bt殺蟲蛋白含量下降時(shí),棉鈴內(nèi)可溶性蛋白含量也會(huì)下降,谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性降低,而游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性升高,因此,轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白含量在高溫脅迫下降低可能是因?yàn)楦邷販p少蛋白質(zhì)合成,促進(jìn)蛋白質(zhì)降解。張祥等(2017)研究發(fā)現(xiàn),水分虧缺導(dǎo)致棉鈴殼Bt蛋白含量下降,而在轉(zhuǎn)錄水平Bt基因表達(dá)量未下降。這說明非生物脅迫導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因抗蟲棉Bt蛋白含量下降的原因可能只涉及翻譯水平的調(diào)控而不涉及轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。而生物脅迫的影響可能更加復(fù)雜,因?yàn)椴∠x害的侵染會(huì)誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。水稻轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),褐飛虱取食水稻后植物在基因表達(dá)和蛋白質(zhì)調(diào)控層面發(fā)生了復(fù)雜的生物學(xué)變化,基因表達(dá)的變化主要與氧脅迫、傷害反應(yīng)和信號(hào)途徑有關(guān)(Zhangetal.,2004)。因此,病蟲害等生物脅迫引起的轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻Bt蛋白含量變化的原因,可能不僅僅和轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、降解有關(guān),還可能涉及植物防御應(yīng)答引起的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。當(dāng)然,對(duì)于生物和非生物因素導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物Bt蛋白含量變化的具體機(jī)制,還需要經(jīng)過進(jìn)一步的研究才能確定。

在轉(zhuǎn)基因水稻和水稻害蟲互作的研究中,研究者往往關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)害蟲的影響,而甚少關(guān)注害蟲對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻的影響。但是,轉(zhuǎn)基因水稻作為水稻害蟲的食物來源,不僅害蟲會(huì)因食料的變化受到影響,轉(zhuǎn)基因水稻自身的生長發(fā)育也會(huì)受到害蟲取食的影響,尤其是轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)與抗蟲性密切相關(guān)的Bt蛋白含量。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因水稻T1C-19體內(nèi)的Bt蛋白含量會(huì)因部分病蟲的脅迫而發(fā)生變化,這可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻的抗蟲性發(fā)生變化。在實(shí)際田間環(huán)境中,Bt水稻可能面臨的脅迫將更加復(fù)雜,這些脅迫因素都有可能影響到Bt水稻的抗蟲效果。因此,在進(jìn)行Bt水稻的抗蟲性評(píng)價(jià)時(shí),需要充分考慮到外界生物及非生物因素互作所帶來的影響。