于海鑫, 付開赟, 丁新華, 賈尊尊, 吐爾遜·阿合買提, 王 蘭*, 郭文超*

1塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300; 2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830091

豚草屬AmbrosiaL.系菊科向日葵族,起源于美國西南部和墨西哥北部的索諾蘭沙漠地區(qū)(曾珂等,2010),共有41個種,其中入侵至中國的菊科豚草屬植物為三裂葉豚草AmbrosiatrifidaL.和豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.,這2種雜草是入侵性惡性雜草,也是世界上公認(rèn)的有害植物,素有“植物殺手”之稱(萬方浩等,2005)。20世紀(jì)50年代傳入我國(李素德等,1990),隨后沿交通線四處蔓延,目前在黑龍江、遼寧、北京等多地均有發(fā)現(xiàn)(梁巧玲和路平,2014)。2010年,在新疆伊犁河谷首次發(fā)現(xiàn)豚草和三裂葉豚草,至2013年,兩者其在當(dāng)?shù)氐姆植济娣e分別達(dá)到10和15 hm2(董合干和宋占麗,2017)。

三裂葉豚草和豚草因繁殖力強(qiáng)、擴(kuò)散速度快、競爭力強(qiáng),在生長過程中極易排斥其他植物,形成優(yōu)勢群落,給新疆農(nóng)牧業(yè)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重危害。它們?nèi)肭植菰?引起草原退化,造成草地服務(wù)能力下降(梁巧玲和路平,2014);花粉對人類健康也有危害(王蕊等,2012; 謝俊芳等,2011),嚴(yán)重者可致人過敏甚至死亡(馬麗娟等,2020)。三裂葉豚草形態(tài)多變,除正常的3～5掌狀深裂葉類型外,還有葉不裂型、深齒型和全裂葉型3種變型,從而造成識別困難(關(guān)廣清,1990)。豚草在開花前常與大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd. 、野艾蒿ArtemisialavandulifoliaDC.、小花鬼針草BidensparvifloraWilld.等相混淆(關(guān)廣清,1985)。三裂葉豚草和豚草在種子期、幼苗期形態(tài)特征極為相似,難以辨識,故建立快速檢測技術(shù)對三裂葉豚草和豚草的準(zhǔn)確識別至關(guān)重要。

Notomietal. (2000)研發(fā)了一種新型的核酸擴(kuò)增方法-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù),該技術(shù)針對目的片段設(shè)計4條引物(1對外引物:F3和B3,1對內(nèi)引物:FIP和BIP) ,在鏈置換DNA聚合酶作用下,將目的片段在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增,其產(chǎn)物是眾多大小不一的DNA片段的混合物。Nagamineetal.(2002)開發(fā)出額外的一對引物,稱之為環(huán)引物(LF和LB),能夠提高LAMP反應(yīng)的效率。與常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測相比,該技術(shù)具有操作簡便、特異性高、靈敏度高、結(jié)果易于觀察判斷等優(yōu)勢,也因此備受關(guān)注(董文敏等,2020)。在植物病原物與入侵害蟲檢測中,已有很多應(yīng)用該技術(shù)的報道,如麥根腐平臍蠕孢BipolarissorokinianaShoem(崔林開等,2022)、蘋果輪紋病菌Botryosphaeriadothidea(Moug)(汪少麗等,2020)、油菜黑脛病菌Leptosphaeriabiglobosa(杜然,2019)、茶黃硬薊馬ScirtothripsdorsalisHood (黃麗莉等,2021)、瓜實蠅BactroceracucurbitaeCoquillett(鐘勇等,2019)、根結(jié)線蟲Meloidogynespp.(吳文濤等,2019)等,但目前有關(guān)該技術(shù)在植物檢測上的研究報道還較少。

鑒于此,本研究擬利用三裂葉豚草和豚草特異性序列設(shè)計一套LAMP引物,并對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,以建立三裂葉豚草和豚草的快速檢測技術(shù),以期實現(xiàn)田間快速精準(zhǔn)識別三裂葉豚草和豚草并阻止其擴(kuò)散。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要實驗材料:三裂葉豚草采自新疆維吾爾自治區(qū)哈薩克自治州新源縣鐵熱克阿吾孜村(83°37′50.40″E,43°52′15.40″N,海拔817.9 m),豚草采自新疆維吾爾自治區(qū)哈薩克自治州新源縣109鄉(xiāng)道(83°21′77.91″E,43°43′67.70″N,海拔 874.7 m)。對照材料艾草ArtemisiaargyiH.采自新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗場(87°48′31.73″E, 43°95′78.83″N,海拔 874.7 m)。

主要實驗試劑:DNA裂解液購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,Bst II DNA polymerase 8 U·μL-1Glycerol-free、10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4)、dNTP Mix(10 mmol·L-1each)和核酸染料 SYBR Green I均購自上海翊圣生物科技有限公司等。

1.2 基因組 DNA 的提取

使用TaKaRa的DNAiso Reagent提取試劑,實驗步驟參考試劑說明(https:∥www.takarabiomed.com.cn/)。

1.3 LAMP引物設(shè)計與合成

在Bold Systems v4網(wǎng)站(http:∥www.boldsystems.org/index.php/Public_SearchTerms)上獲得三裂葉豚草和豚草的基因序列。其中,三裂葉豚草GenBank:rbcLa:491;豚草GenBank:MH517698。選用NEBLAMP (https:∥lamp.neb.com/#!/)在線設(shè)計引物,設(shè)計3套引物同時選取其中1套進(jìn)行引物合成,引物信息見表1。序列在金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行合成。

表1 用于LAMP檢測的引物信息

1.4 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系:2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (10 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL,4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后加入滅菌超純水至25 μL。上述試劑混均勻后,放置于恒溫55～65 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,80 ℃滅活5 min,篩選出最佳反應(yīng)時間。

1.5 LAMP特異性檢測

針對三裂葉豚草和豚草的不同發(fā)育階段(幼苗期、生長期、種子期),通過提取基因組DNA,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用焦磷酸酶沉淀-比濁法,開展LAMP檢測技術(shù)的開發(fā)。以清水和艾草為對照,如產(chǎn)生沉淀則為陽性,如未產(chǎn)生沉淀則為陰性(林瑤等,2014)。

1.6 LAMP靈敏度檢測

選用特異性檢測結(jié)果最穩(wěn)定的葉片作為靈敏度檢測對象。提取濃度為127.5 ng·μL-1,然后用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋,使其終濃度分別為100、10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11ng·μL-1,最終使用不同濃度作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng),以ddH2O為空白對照。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL核酸染料SYBR Green I,若其結(jié)果為陽性,則為明顯的綠色熒光,而陰性結(jié)果則為橙色,并以此檢測LAMP技術(shù)的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立

LAMP引物最佳反應(yīng)溫度為65 ℃。用于檢測三裂葉豚草和豚草的LAMP最佳反應(yīng)體系: 2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (16 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL, 4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后滅菌超純水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序:在65 ℃恒溫水浴鍋中溫育1 h,80 ℃變性5 min,使Bst DNA 聚合酶失活。最后加入核酸染料SYBR Green I,結(jié)果出現(xiàn)明顯的綠色熒光為陽性,出現(xiàn)橙色則為陰性。

2.2 三裂葉豚草和豚草LAMP特異性檢測

使用本研究設(shè)計的三裂葉豚草LAMP引物Atr-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以豚草和艾草對照,對三裂葉豚草幼苗期、生長期、種子期進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,結(jié)果(圖1)顯示,只有三裂葉豚草產(chǎn)生白色沉淀,有陽性反應(yīng),豚草和艾草對照均無產(chǎn)生白色沉淀,為陰性反應(yīng)。

圖1 三裂葉豚草LAMP特異性檢測

使用本研究設(shè)計的豚草LAMP引物Aar-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以三裂葉豚草和艾草為對照,對豚草幼苗期、生長期、種子期進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,結(jié)果(圖2)顯示,只有豚草產(chǎn)生白色沉淀,有陽性反應(yīng),三裂葉豚草、艾草對照均無產(chǎn)生白色沉淀,為陰性反應(yīng)。以上結(jié)果說明,該LAMP引物具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 豚草LAMP特異性檢測

2.3 三裂葉豚草LAMP靈敏度檢測

因三裂葉豚草和豚草基因組DNA提取方法與靈敏度檢測方法一樣,故本研究只進(jìn)行三裂葉豚草實驗驗證。提取三裂葉豚草基因組DNA,紫外分光光度計測量提取的基因組DNA濃度為127.5 ng·μL-1,將DNA濃度調(diào)整為100 ng·μL-1,進(jìn)行10倍梯度稀釋為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,驗證LAMP體系的靈敏度。從LAMP反應(yīng)結(jié)果(圖3) 可以看出,DNA濃度為10-10ng·μL-1以下的實驗組反應(yīng)液呈淺橘色,DNA濃度為10-10ng·μL-1及以上的實驗組反應(yīng)液顏色為熒光綠,表明LAMP引物最低限度為10-10ng·μL-1。

圖3 三裂葉豚草LAMP靈敏度檢測

3 討論與結(jié)論

LAMP檢測方法具有操作快速簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測成本低等優(yōu)點,該技術(shù)已廣泛運(yùn)用于植保等領(lǐng)域。國外學(xué)者最初通過LAMP檢測番茄花葉病毒病(Shiroetal.,2003);彭軍等(2013)建立的柑桔黃龍病LAMP技術(shù)可以檢測到最低下限約為1 pg·μL-1質(zhì)粒DNA,是PCR檢測靈敏度的100倍;王賢達(dá)等(2014)利用LAMP技術(shù)檢測柑橘黃龍病病原菌,檢測靈敏度達(dá)10-6ng·μL-1,是普通PCR的1000倍,為柑橘黃龍病早期診斷提供了快速檢測的方法;鐘勇等(2019)建立的瓜實蠅快速可視化分子檢測方法可檢測到1.65 ng·μL-1的DNA模板,能夠?qū)⒐蠈嵪壟c其近似種進(jìn)行區(qū)分。

本研究通過三裂葉豚草和豚草的DNA序列區(qū)間設(shè)計了3組引物,并從中篩選獲得1組引物,通過優(yōu)化反應(yīng)體系的溫度以及時間,建立了高效檢測三裂葉豚草和豚草的LAMP技術(shù)體系。通過對前期優(yōu)化后的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行驗證,該LAMP體系僅對三裂葉豚草和豚草的特異性檢測結(jié)果呈陽性,且靈敏度結(jié)果中最低檢測限為10-10ng·μL-1,優(yōu)于常規(guī)PCR的檢測結(jié)果;此外,LAMP快速檢測技術(shù)在反應(yīng)時間方面具有較大優(yōu)勢,常規(guī)PCR對目標(biāo)DNA片段的檢測需要花費(fèi)2～4 h,LAMP體系反應(yīng)時間僅需1 h,且設(shè)備成本較低。但是本實驗所使用的商品裂解液與SYBR GreenⅠ熒光染料成本較高,對引物設(shè)計的要求比較高且LAMP產(chǎn)物不能進(jìn)行后續(xù)實驗(秦文韜等,2013)。

盡管LAMP技術(shù)還存在一些缺點和不足,但隨著LAMP技術(shù)的日益完善和發(fā)展,加上LAMP所需儀器設(shè)備價格極低、擴(kuò)增快速高效、適合各種環(huán)境下的快速檢測、實用性強(qiáng)等優(yōu)點,LAMP有望成為檢測入侵性雜草的常用工具,并將在入侵性雜草的分子檢測和診斷中發(fā)揮更大的作用。后續(xù)應(yīng)開展三裂葉豚草和豚草DNA快速提取方法的建立與優(yōu)化研究,并與本研究的LAMP檢測體系相結(jié)合,提高其檢測能力,從而實現(xiàn)檢測體系的高效、便捷,以達(dá)到從入侵種子源頭控制的目的,這不僅可以為識別鑒定外來入侵性雜草三裂葉豚草和豚草提供技術(shù)支撐,還能為三裂葉豚草和豚草的綠色防控提供參考(胡章薇等 2021; 朱志偉和趙金紅,2020)。