解水梅，宋春蓮，武 鑫，張 瑩，林鈞藝，張王芝，耿志誠(chéng)，袁 紅，李永薈，潘 瓊，舒相華

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201）

沙門(mén)氏菌為一種人畜共患食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可感染雞、豬、牛和人等多種動(dòng)物。人感染的主要癥狀是發(fā)熱、腹瀉，嚴(yán)重者甚至引發(fā)菌血癥。研究表明22.2%的食源性疾病是由沙門(mén)氏菌引起的，且引起沙門(mén)氏菌中毒的食品中90%以上是動(dòng)物性產(chǎn)品。根據(jù)歐洲食品安全局和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計(jì)顯示，歐洲每年有超過(guò)10 萬(wàn)例的人患沙門(mén)氏菌病，在美國(guó)每年的沙門(mén)氏菌感染已經(jīng)增加到1200 萬(wàn)人，引起大約1.9 萬(wàn)人住院，約450 人死亡。在我國(guó)，據(jù)2021 年食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，沙門(mén)氏菌引起的食品安全事件數(shù)和發(fā)病人數(shù)分別占 29.76%（225/756） 和 27.55%（3192/11585），位居細(xì)菌性食物中毒的首位?？梢?jiàn)，沙門(mén)氏菌的廣泛傳播給國(guó)內(nèi)外的食品安全和人類健康帶來(lái)了巨大的威脅。

食品安全關(guān)系我國(guó)基本民生，豬源性食品是食品的重要組成部分，2019 年我國(guó)豬肉消費(fèi)量為4486 萬(wàn)t，全球豬肉消費(fèi)量達(dá)到1.009 億t，因此，保證生豬生產(chǎn)供應(yīng)及副產(chǎn)品安全極其重要。動(dòng)物在屠宰過(guò)程中易受到環(huán)境源性污染或胴體本身攜帶致病菌，孫向華等對(duì)2013～2016 年北京10 家生豬屠宰場(chǎng)豬肉產(chǎn)品進(jìn)行食源性致病菌污染狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)腸道沙門(mén)氏菌、單增李斯特氏菌和空腸彎曲菌的污染率分別為0.50%、5.33%、2.67%和1.33%；劉鮮鮮等對(duì)山東部分生豬屠宰場(chǎng)屠宰環(huán)節(jié)污染沙門(mén)氏菌狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)污染率為19.96%；周政對(duì)湘潭縣3個(gè)生豬屠宰場(chǎng)的豬肉及環(huán)境樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌污染率為10.00%。若攜帶人畜共患致病菌的動(dòng)物在屠宰時(shí)未被檢出或動(dòng)物產(chǎn)品加工過(guò)程中受致病菌污染，都有可能使致病菌被食用進(jìn)入機(jī)體，引起食源性疾病。

隨著抗生素在畜牧業(yè)的不合理使用，沙門(mén)氏菌也表現(xiàn)出越來(lái)越復(fù)雜的耐藥性。研究表明，沙門(mén)氏菌屬的多重耐藥率在20 世紀(jì)90 年代為20%～30%，到21 世紀(jì)初期已達(dá)70%。因此對(duì)屠宰豬的沙門(mén)氏菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)及了解其耐藥性非常有必要。

為了解昭通某屠宰場(chǎng)豬胴體的沙門(mén)氏菌帶菌情況，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采集豬胴體樣品58 份，進(jìn)行細(xì)菌分離、生理生化鑒定、革蘭氏染色鏡檢、基因型鑒定及藥敏試驗(yàn)，綜合沙門(mén)氏菌的檢出情況對(duì)該病的防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病 料 樣品來(lái)自云南昭通某屠宰場(chǎng)58 頭豬的胴體拭子。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器 改良半固體Rappaport-Vassiliadis（MRSV）培養(yǎng)基（0230252）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）培養(yǎng)基（1101585）、三糖鐵（TSI） 培養(yǎng)基（1097391）、Motility-indole-lysine medium（MIL）培養(yǎng)基（32131401），靛基質(zhì)試劑（6108269）、改良緩沖蛋白胨水（BPW） 培養(yǎng)基（1091781）、LB 肉湯（1096311）均來(lái)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司，Hektoen Enteric （HE） 培養(yǎng)基（HB4093-8）購(gòu)于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒（9763，昆明豐科生物科技有限公司），革蘭氏染色試劑盒（20210103，北京索萊寶科技有限公司），藥敏片（20200830，杭州濱河微生物試劑有限公司）。

PCR 擴(kuò)增儀（846-X-070-30，德國(guó)耶拿公司），凝膠成像分析儀器（WD-9413B，北京六一生物科技有限公司），生化培養(yǎng)箱（SPX-150，上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 用無(wú)菌棉拭子擦拭屠宰后豬的體表皮膚、腹股溝等位置，將棉拭子放入裝有3mL BPW（加1%瓊脂粉）的離心管中保存，送至實(shí)驗(yàn)室立即分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將拭子用BPW 培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，接種環(huán)沾取菌液用三點(diǎn)涂布法接種于MRSV 培養(yǎng)基，41.5±1 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察是否發(fā)生遷移，挑取遷移菌落接種于XLD 培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)18～24 h 后觀察菌落形態(tài)。

1.2.3 生理生化鑒定 挑取XLD 上的4 個(gè)黑色單菌落分別穿刺接種斜面TSI 和MIL 培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)18～24 h，觀察TSI 培養(yǎng)基顏色，以及觀察MIL 培養(yǎng)基是否有白色環(huán)，滴入2 滴靛基質(zhì)試劑，觀察是否出現(xiàn)品紅色，出現(xiàn)則為吲哚陽(yáng)性。

1.2.4 革蘭氏染色鏡檢 將TSI 上的細(xì)菌接種至LB 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，具體操作為：涂片固定，結(jié)晶紫初染1 min，碘液媒染1 min，乙醇脫色30 s，番紅復(fù)染1 min，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.2.5 16S rRNA 基因鑒定 挑取LB 瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落用LB 肉湯活化12 h 后吸取1mL 菌液，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌的DNA。采用細(xì)菌通用引物16s 515F（AAGGAGGTGATCCRGCC）和16s 1542R（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增細(xì)菌DNA，PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：Taq (mix) 11.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。擴(kuò)增DNA 目的片段大小約為1027 bp。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序，用Seqmen 對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，拼接結(jié)果輸入NCBI 官網(wǎng)，與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 用Kirby-Bauer 法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，具體操作為移液槍吸收200 μL 細(xì)菌菌液，用涂布棒將菌液涂均勻后用鑷子夾住氨芐西林（AMP，10 μg/片）、氯霉素（CHL，30 μg/片）、鏈霉素（STR，10 μg/片）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg/片）、頭孢曲松（CRO，30 μg/片）、復(fù)方新諾明（SXT，1.25 μg/片）和多粘菌素B（CT，300 μg/片）的藥敏片邊緣，并按照一定的順序?qū)⑵滟N在相應(yīng)區(qū)域的中間，輕輕按壓以固定。將其置于恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，然后采用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量其抑菌圈直徑。不同藥物的判定標(biāo)準(zhǔn)參照臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI（2013）推薦的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的生長(zhǎng)特性觀察 由圖1 可知，分離菌株在MRSV 培養(yǎng)基上沿穿刺孔向周邊遷移，遷移區(qū)域呈灰白色；在XLD 培養(yǎng)基上長(zhǎng)出無(wú)色透明，有黑色中心的菌落；染色后鏡檢可見(jiàn)細(xì)菌為紅色的短桿狀的革蘭氏陰性菌。

圖1 分離菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和革蘭氏染色結(jié)果

2.2 生理生化鑒定結(jié)果 分離菌在TSI 培養(yǎng)基斜面和底層均為黑色，產(chǎn)氣，產(chǎn)硫化氫，MIL 培養(yǎng)基有白色環(huán)，滴加靛基質(zhì)試劑變?yōu)槠芳t色，見(jiàn)圖2。

圖2 TSI 培養(yǎng)基（左）和MIL 培養(yǎng)基（右）

2.3 16S rRNA 基因鑒定結(jié)果 電泳檢測(cè)的目標(biāo)條帶大小為1027 bp，與預(yù)期片段大小一致（見(jiàn)圖3）。將測(cè)序結(jié)果輸入Genbank 用Blastbp 軟件進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)相似度性最高的是沙門(mén)氏菌，且相似度均高于99.00%。本次試驗(yàn)共分離出13 株沙門(mén)氏菌，分離率為22.41%。

圖3 細(xì)菌PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 由表1 和表2 可知，6 株沙門(mén)氏菌對(duì)多粘菌素B 敏感，4 株對(duì)頭孢曲松敏感，3 株對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星和復(fù)方新諾明敏感，其余均為中度敏感和耐藥。分離的12 株沙門(mén)氏菌共存在10 種耐藥表型，其中以CHL-AMP- CIP- SXT，CHL- AMP- CRO - STR- SXT 和CHL- AMPCRO-STR- CIP-SXT（2/13，15.38%）3 種耐藥表型為主。且呈現(xiàn)多重耐藥（3 重～6 重），其中4 和6 重所占的比例最大，達(dá)到30.77%，其次是3 重和5 重，占15.38%。這些結(jié)果說(shuō)明沙門(mén)氏菌耐藥性比較嚴(yán)重。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 13 株沙門(mén)氏菌的耐藥表型

3 討 論

由于抗生素在畜牧業(yè)的不合理使用，沙門(mén)氏菌也表現(xiàn)出越來(lái)越復(fù)雜的耐藥性。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12 株沙門(mén)氏菌（20.69%）呈現(xiàn)3 重～6 重耐藥，4和6 重所占的比例最大（30.77%），提示送往該屠宰場(chǎng)的豬可能造成多重耐藥的傳播。

本研究表明沙門(mén)氏菌的分離量為22.41%，沙門(mén)氏菌分離使用的豬胴體拭子樣品是在生豬劈半后采集的，屬于屠宰處理后期，被檢產(chǎn)品即將進(jìn)入消費(fèi)市場(chǎng)。在豬胴體上檢出這種食源性致病菌，若后期加工處理不足以充分殺滅致病菌，將會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成巨大威脅，同時(shí)也影響社會(huì)的穩(wěn)定發(fā)展。

屠宰豬存在沙門(mén)氏菌的原因可能是屠宰環(huán)節(jié)污染嚴(yán)重，彭通通等研究表明屠宰前污染沙門(mén)氏菌的重點(diǎn)環(huán)節(jié)是屠宰地面（53.3%）和傳送帶（33.3%），屠宰時(shí)重點(diǎn)污染環(huán)節(jié)是劈半（55.0%） 和修飾（45.0%）。王鑫盛等研究表明沙門(mén)氏菌在待宰、麻電環(huán)節(jié)中的檢出率（分別為37.4%、26.5%）明顯高于體表拭子樣本（脫毛20.5%、劈半17.1%、冷卻14.4%），而在環(huán)境樣品中，下白臟地面陽(yáng)性率最高（15.0%），冷卻間地面最低為5.0%。說(shuō)明豬感染致病菌可能是因?yàn)橥涝篆h(huán)節(jié)互相污染。屠宰場(chǎng)作為定點(diǎn)屠宰單位，出現(xiàn)沙門(mén)氏菌，不僅威脅到人的健康還可能會(huì)通過(guò)運(yùn)輸、人員接觸擴(kuò)散至各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)。

因此屠宰場(chǎng)首先應(yīng)當(dāng)做好防疫檢疫工作，建立完善的防疫體系，能從根本上減少致病菌對(duì)動(dòng)物健康所產(chǎn)生的危害；其次屠宰場(chǎng)在接收生豬前嚴(yán)格按照我國(guó)《生豬屠宰檢疫規(guī)程》對(duì)送宰生豬進(jìn)行檢疫，盡量避免帶有致病菌的生豬進(jìn)入屠宰場(chǎng)；最后屠宰前對(duì)屠宰流水線設(shè)備進(jìn)行全面消毒，參與屠宰的工作人員穿防護(hù)服進(jìn)行操作，以減少食源性致病菌在屠宰場(chǎng)和人畜間的傳播。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從云南昭通某屠宰場(chǎng)屠宰胴體分離出13 株沙門(mén)氏菌，13 株沙門(mén)氏菌均呈現(xiàn)多重耐藥，可能會(huì)對(duì)食品安全和人類健康造成潛在威脅。