劉俊 成潔 莊珩之 王圣坦 劉曉行

(海南省人民醫(yī)院婦科,海南 ?？?570311)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,其死亡率較高,全球每年約有14萬患者死亡[1],且由于缺乏早期臨床癥狀和有效的篩查策略,大約75%的病例確診時(shí)通常分期較晚[2]。目前減瘤手術(shù)和鉑/紫杉醇聯(lián)合化療是卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)療法,而隨著醫(yī)療技術(shù)的持續(xù)發(fā)展,卵巢癌的治療已在一定程度上得到改善,但是大多數(shù)患者5年生存率仍低于50%[3]。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,核受體共激活因子5 (Nuclear Receptor Coactivator 5,NCOA5)是一種廣泛表達(dá)的核受體共同調(diào)節(jié)劑,也是雌激素受體和孤兒核激素受體共激活因子BD73的共同調(diào)節(jié)劑[4]。NCOA5基因表達(dá)異?？蓪?dǎo)致腫瘤的發(fā)生,在乳腺癌中NCOA5表達(dá)增加,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[5]。NCOA5在宮頸癌組織中表達(dá)減少,并與宮頸癌患者不良臨床病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān),抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[6]。由此可見,NCOA5在不同腫瘤中發(fā)揮的作用可能相反,其參與了幾種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是它在卵巢癌中的作用仍然未知。因此本文在卵巢癌中研究NCOA5的表達(dá)及發(fā)揮的生物學(xué)功能,以表明NCOA5作為促進(jìn)卵巢癌惡性進(jìn)展的重要分子,具有作為抗卵巢癌治療分子靶點(diǎn)的潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑來源 卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910和正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司;NCOA5 siRNA購于Santa Cruz生物技術(shù)有限公司;基質(zhì)膠購自美國BD公司;Transwell小室購自美國Corning公司;二辛可寧酸 (BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒和PVDF膜購自美國Thermo試劑公司;NCOA5、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Slug、GAPDH和HRP偶聯(lián)的二抗購于英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910和正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80快速復(fù)蘇后均采用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,并加入胎牛血清(10%)和青霉素/鏈霉素的混合物(1%),放置在含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞長至90%左右時(shí),胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。SKOV3及A2780細(xì)胞生長較好時(shí),胰酶消化后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),分為si-NC組和si-NCOA5組。按照Lip 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將NC siRNA和NCOA5 siRNA轉(zhuǎn)染至對應(yīng)組的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,通過western-blot檢測沉默效率。

1.3 Boyden實(shí)驗(yàn) 將BD基質(zhì)膠在4 ℃下解凍,采用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠(稀釋比例為1∶10),取10 μL稀釋的基質(zhì)膠均勻加至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上,放置37 ℃培養(yǎng)箱中30 min備用。胰酶消化si-NC組和si-NCOA5組SKOV3及A2780細(xì)胞重懸,采用無血清培養(yǎng)基洗3次并重懸細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×106個(gè)細(xì)胞/mL,接種至鋪好的基質(zhì)膠上,并在Transwell小室的下室中加入100 μL含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中孵育12 h后,用棉簽去除上室中的細(xì)胞,將聚碳酸酯膜放置4%多聚甲醛中固定,并采用結(jié)晶紫染料染色。在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)不重疊的視野計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 胰酶消化si-NC組和si-NCOA5組SKOV3及A2780細(xì)胞重懸,采用無血清培養(yǎng)基洗3次并重懸細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/mL,接種至Transwell小室的上室聚碳酸酯膜上,并在Transwell小室的下室中加入100 μL含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中孵育6 h后,用棉簽去除上室中的細(xì)胞,將聚碳酸酯膜放置4%多聚甲醛中固定,并采用結(jié)晶紫染料染色。在顯微鏡下隨機(jī)選擇五個(gè)不重疊的視野計(jì)算轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)目。

1.5 Western-blot實(shí)驗(yàn) 胰酶消化si-NC組和si-NCOA5組SKOV3及A2780細(xì)胞,PBS洗3次后,加入含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物的蛋白裂解液,經(jīng)高速離心獲得蛋白裂解液。根據(jù)二辛可寧酸 (BCA) 蛋白檢測試劑盒檢測和計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。吸取50 μg等量的蛋白質(zhì)加入十二烷基硫酸鈉 (SDS) 聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,并將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 (PVDF) 上。采用封閉液封閉PVDF膜上的非特異蛋白,TBST洗3次后,將PVDF膜與NCOA5、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Slug、GAPDH一抗稀釋液(稀釋濃度均為1∶5000)于4 ℃中孵育過夜。TBST洗3次后,將PVDF膜與兔、鼠二抗(稀釋濃度均為1∶8000)孵育。采用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 NCOA5在卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào) Western blot檢測NCOA5在卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、A2780、OC3、HO-8910中的表達(dá)分別為0.89±0.08、0.91±0.10、0.19±0.03、0.21±0.04,顯著高于在正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80中的表達(dá)(0.08±0.03)(F=103.79,P<0.001)。其中在SKOV-3和A2780細(xì)胞中的表達(dá)相對較高(P<0.05),見圖1。

圖1 Western blot檢測NCOA5蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 NCOA5 siRNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞效果 Western-blot結(jié)果顯示,NCOA5蛋白在si-NC組和si-NCOA5組SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)分別為0.31±0.04和0.11±0.02,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞中NCOA5的表達(dá)顯著降低(t=7.746,P=0.001),見圖2A。在si-NC組和si-NCOA5組A2780細(xì)胞中的表達(dá)分別為0.40±0.08和0.10±0.03,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞中NCOA5的表達(dá)顯著降低(t=6.082,P=0.002),見圖2B。

圖2 Western-blot檢測顯示與si-NC組相比,si-NCOA5組細(xì)胞中NCOA5的表達(dá)顯著降低

2.3 NCOA5 siRNA對細(xì)胞侵襲能力的影響 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測顯示,si-NC組和si-NCOA5組SKOV3穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為67.33±6.11和41.67±4.98,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞侵襲能力顯著降低(t=7.974,P<0.001),見圖3A。si-NC組和si-NCOA5組A2780穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為72.67±7.32和22.67±5.98,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞侵襲能力顯著降低(t=9.162,P<0.001),見圖3B。

圖3 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測顯示與si-NC組相比,si-NCOA5組SKOV3細(xì)胞侵襲能力顯著降低

2.4 NCOA5 siRNA對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測顯示,si-NC組和si-NCOA5組SKOV3穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為73.67±9.04和40.67±5.78,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低(t=15.752,P<0.001),見圖4A。si-NC組和si-NCOA5組A2780穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為88.93±8.96和33.64±7.43,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低(t=8.227,P<0.001),見圖4B。

圖4 Transwell檢測顯示與si-NC組相比,si-NCOA5組SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著降低

2.5 NCOA5 siRNA對細(xì)胞EMT的影響 Western-blot檢測結(jié)果顯示,與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞SKOV3中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表達(dá)減少(均P<0.05),見圖5A。與si-NC組相比,si-NCOA5組卵巢癌細(xì)胞A2780中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表達(dá)減少(均P<0.05),見圖5B。

圖5 western-blot檢測顯示與si-NC組相比,si-NCOA5組SKOV3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白表達(dá)減少

3 討論

卵巢癌嚴(yán)重威脅女性患者生命健康,其發(fā)病機(jī)制也尚未完全明確。研究顯示基因表達(dá)改變在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7],因此研究在卵巢癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子對尋求抗卵巢癌治療的分子靶向藥物以改善患者預(yù)后至關(guān)重要。NCOA5是一種核受體核心調(diào)節(jié)劑,與α和β雌激素受體相互作用,可以調(diào)節(jié)雌激素受體α介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性[8]。此外,NCOA5與腫瘤抑制劑TAT相互作用蛋白相互作用,以調(diào)節(jié)癌基因C-MYC的轉(zhuǎn)錄,以促使腫瘤的發(fā)生[9]。已有研究顯示NCOA5 在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌等常見腫瘤中表達(dá)異常,其中NCOA5在結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá),與腫瘤患者預(yù)后較差相關(guān),并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力,以發(fā)揮癌基因的作用[10-11]。在宮頸癌和甲狀腺乳頭狀癌中NCOA5 表達(dá)降低,低表達(dá)NCOA5的宮頸癌和甲狀腺乳頭狀癌患者預(yù)后較差,抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用,以發(fā)揮抑癌作用[6,12]。表明NCOA5 在腫瘤的惡性進(jìn)展中充當(dāng)“雙面”角色,但是NCOA5在卵巢癌中的研究鮮有報(bào)道。

本研究在卵巢癌細(xì)胞系中檢測發(fā)現(xiàn)NCOA5中表達(dá)升高,提示NCOA5在卵巢癌中發(fā)揮促癌作用,與NCOA5在乳腺癌和結(jié)直腸癌組織水平的表達(dá)具有一致性。但是本研究未在卵巢癌組織水平檢測NCOA5的表達(dá)情況,將在后續(xù)進(jìn)行卵巢癌組織樣本的收集并進(jìn)行研究。在乳腺癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞肝癌等腫瘤中,相關(guān)研究顯示NCOA5與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)[5,10,13]。本研究在卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3和A2780中干擾NCOA5的表達(dá),生物學(xué)功能顯示抑制NCOA5的表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。表明NCOA5促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展,可能是宮頸癌惡性進(jìn)展的關(guān)鍵基因,但是NCOA5發(fā)揮的作用機(jī)制仍需探討。

過往研究顯示,NCOA5可以通過調(diào)控Notch3、PI3K/AKT、p21(WAF1/CIP1)等信號通路參與腫瘤的進(jìn)展[6,9,14]。其中在乳腺癌和肝細(xì)胞肝癌中干擾NCOA5的表達(dá),通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5,13]。而EMT被認(rèn)為是腫瘤從發(fā)生到轉(zhuǎn)移的主要驅(qū)動(dòng)力,并且在誘導(dǎo)腫瘤惡性進(jìn)展和耐藥性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。EMT包含粘附連接和底物極性的喪失以及獲得間充質(zhì)特征,如紡錘形細(xì)胞形態(tài)和肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維的重組、增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力等過程[17]。在分子水平上,EMT的主要標(biāo)志是E-cadherin表達(dá)降低,這導(dǎo)致細(xì)胞連接減弱,隨后細(xì)胞之間脫離,以至單細(xì)胞遷移增加[18]。E-cadherin的缺失經(jīng)常與N-cadherin表達(dá)增加相結(jié)合,這被認(rèn)為有助于基質(zhì)導(dǎo)向的細(xì)胞粘附譜,從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)、侵入性和轉(zhuǎn)移性細(xì)胞表型[19]。同時(shí)在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去了極性轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞,并伴隨著vimentin[20]和Slug蛋白表達(dá)增加[21],本研究檢測發(fā)現(xiàn)干擾NCOA5的表達(dá)后,E-cadherin蛋白的表達(dá)增加,N-cadherin、vimentin和Slug蛋白的表達(dá)減少。表明干擾NCOA5的表達(dá)是通過減弱EMT抑制卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

4 結(jié)論

NCOA5在卵巢癌細(xì)胞系中高表達(dá),并有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控EMT發(fā)揮作用,NCOA5具有成為卵巢癌治療分子靶點(diǎn)的潛力。