劉生剛 肖雷 段園園 鄧小紅 王亞軍 柳華

(1.綿陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科·川北醫(yī)學院,四川 綿陽 621053;2.成都市第三人民醫(yī)院·西南交通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川 成都 610014)

腦卒中是我國居民首位死因,目前發(fā)病率為246.8/10萬,死亡率為114.8/10萬[1-2],而缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)是腦卒中的主要類型,占所有腦卒中的43.7%～78.9%[1]。卒中后認知損傷很常見,超過70%的卒中患者在病后3月后會出現(xiàn)不同程度認知損傷(Cognitive impairment,CI),導致失能和死亡率增加,給患者、照護者、家庭、醫(yī)療系統(tǒng)和社會增加了嚴重負擔[3]。其中,IS急性期CI發(fā)生率約為30%～50%[4-5]。因此,研究急性IS后認知損傷(Post stroke cognitive impairment,PSCI)的危險因素,對于預防和針對性治療極為重要[6]。認知損傷具有明確的遺傳背景,研究發(fā)現(xiàn),24%的認知損傷可歸因于遺傳易感因素[7]。最近一個全基因組關聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)在3個蘇格蘭人群中證實IS的多基因風險與PSCI密切相關[8]。長鏈非編碼RNA家族的INK4基因座中反義非編碼RNA(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)與IS發(fā)病密切相關[9]。ANRIL參與了炎癥和神經(jīng)功能失調(diào)的調(diào)節(jié),可能在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發(fā)病機制中起作用[10]。研究者在AD細胞模型中也發(fā)現(xiàn)ANRIL表達上調(diào),通過沉默ANRIL可以減少細胞凋亡,增強神經(jīng)突觸生長,并降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、L-6和IL-17的水平[11]。對氧磷酶(Paraoxonase,PON)參與脂質(zhì)代謝,和動脈粥樣硬化過程關系密切。Meta分析顯示,PON基因單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)與IS的發(fā)病具有緊密相關性[12-14];PON1 L55M(rs854560)與血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)[15],PON2 S311C(rs7493)和rs705379與AD的發(fā)病風險相關[16]。由此推測,ANRIL和PON基因可能是PSCI的發(fā)生遺傳易感因素,并且,PSCI是一個多因素疾病,本研究旨在探討上述2個基因及其與CI傳統(tǒng)危險因素的交互效應,以期為PSCI的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取綿陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)入院的符合納入標準的漢族初發(fā)IS患者。納入標準:①符合世界衛(wèi)生組織(WHO)IS診斷標準。②發(fā)病14天內(nèi),發(fā)病前無認知障礙及其他影響智能的神經(jīng)精神疾患。③患者及家屬知情并簽署知情同意書,同時經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。排除標準:①腔隙性腦梗死、有明確原因的繼發(fā)性腦梗死、再發(fā)性腦梗死患者。②伴有意識障礙、言語障礙、嚴重視聽損害不能進行認知評測者。③存在其他嚴重合并癥和并發(fā)癥者;④影像學發(fā)現(xiàn)腦白質(zhì)病變、腦萎縮者。

1.2 研究方法

1.2.1 評價指標 ①認知評定:發(fā)病后2周采用簡易智能量表(Mini-mental State Examination,MMSE)中國版本進行認知測定,MMSE<27分診斷為認知損傷。②神經(jīng)功能缺損評定:使用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)進行評估,神經(jīng)功能損傷程度較重定義為NIHSS>5(非輕型卒中)。③高同型半胱氨酸(HHCY)定義采用2011中國高血壓防治指南修訂委員會制定的標準:血漿Hcy>10 μmol/L。④高危CRP定義為hs-CRP>3.0 mg/L。⑤高尿酸定義采用中國高尿酸血癥與痛風診療指南(2019)定義:為非同日兩次血尿酸水平>420 μmol/L。⑥入院高血糖參照1998年WHO標準:空腹 ≥ 7.0 mmol/L,或者隨機 ≥ 11.1 mmol/L。⑦ 入院高血壓根據(jù)1999年WHO高血壓標準:即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。⑧吸煙史定義為平均每日吸煙1支以上,時間大于一年;飲酒史定義為平均每周飲白酒至少一次,時間大于一年)[17]。⑨血脂異常診斷依據(jù)中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版):甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L(150 mg/dl)、血漿膽固醇(TC)≥5.18 mmol/L(200 mg/dl)、高密度脂蛋白(HDL-C)<1.04 mmol/L(40 mg/dl)、低密度脂蛋白(LDL-C)≥3.37 mmol/L(130 mg/dl)。⑩超重定義為BMI≧24 kg/m2。頸動脈狹窄程度:在最大斑塊位置,采用NASCET方法計算頸動脈狹窄率,將頸動脈狹窄程度分為:正常、輕度狹窄(1%～49%)、中度狹窄(50%～69%)、重度狹窄(70%～99%)、血管閉塞(血栓填塞,血流信號消失)。梗死面積定義(CT/MRI):根據(jù)Pullicino公式,將腦梗死面積分為大、中、小三型,其中小梗死灶<4 mL,中梗死灶5～10 mL,大梗死灶>10 mL。

1.2.2 SNP分型

1.2.2.1 ANRIL SNPs位點的選擇 根據(jù)在Hapmap數(shù)據(jù)庫(HapMap Data Phase III/Rel#2,Feb09,on NCBI36 B36 assembly,dbSNP b126)中獲得的中國非親緣關系北京人群的所有SNP基因分型數(shù)據(jù),挑選出r2≥0.8且最小等位基因頻率(MAF)> 5%的SNPs作為標簽SNPs。位于5′和3′側翼區(qū)以及非轉錄區(qū)(UTRs)的SNPs也納入分析。最后,15個SNP位點納入分析,包括rs2184061,rs7044859,rs10738607,rs1537375,rs1004638,rs10738609,rs10757278,rs10757274,rs2383206,rs1333049,rs1333040,rs10116277,rs10757269,rs1537378和rs7865618。

1.2.2.2 PON位點選擇 選擇在腦血管疾病及認知功能研究較多的位點,共涉及9個位點(rs12026、rs3735590、rs662、rs705379、rs705381、rs7493、rs854560、rs854571和rs854572)。

1.2.2.3 DNA提取 取每個受試者外周靜脈血2 mL于內(nèi)含EDTA-K2(K3)抗凝劑的紫頭管,于-80 ℃冰箱保存。采用北京TIANGEN公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)(離心柱型),目錄號:DP348)提取DNA。

1.2.2.4 SNPs分型采用SNPscan方法(Cat#:G0104K,上海天昊生物科技有限公司) 該技術是根據(jù)提供的SNP信息合成特異引物并優(yōu)化連接反應體系后組裝而成。實驗步驟簡述如下:①DNA樣本濃度在30～50 ng/ul。②樣本裂解:使用2.5 ul 4x DNA lysis Buffer,在PCR儀上98 ℃,5 min裂解。③連接反應:使用裂解DNA樣本,加入10 μL連接反應預混合液,3 000 rpm離心0.5 min,在PCR儀按以下程序運行:第一步,4個循環(huán),包括:94 ℃,1 min,58 ℃,4 h;第二步,94 ℃,2 min,72 ℃保持。④多重熒光PCR反應(每個樣本進行兩個PCR反應,每個反應各擴增48位點的連接產(chǎn)物),連接產(chǎn)物1 ul加19 ul PCR預混合液,3000 rpm離心0.5 min,然后在PCR儀按以下程序運行:第一步,95 ℃,2 min變性,第二步,9個循環(huán):94 ℃,20秒變性,首次循環(huán)62 ℃,40秒退火(后續(xù)每個循環(huán)降低0.5 ℃),72 ℃延伸1.5 min;第三部,25個循環(huán):94 ℃,20秒變性,首次循環(huán)57 ℃,40秒退火,72 ℃延伸1.5 min;第四步,68 ℃ 60 min延伸。⑤PCR產(chǎn)物上ABI 3730XL測序儀:PCR產(chǎn)物稀釋10倍后,取1 ul與0.5 ul Liz 600 SIZE STANDARD,8.5 ul Hi-Di混勻,95 ℃變性5 min后上ABI 3730XL測序儀。⑥數(shù)據(jù)分析:ABI 3730XL測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用軟件GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems,USA)分析。

2 結果

2.1 一般資料 研究期間,共納入312例急性IS患者,根據(jù)納入排除標準,共255例IS患者進入本研究分析。根據(jù)MMSE評測,88例患者存在認知損傷,認知損傷的比例為34.5%,平均年齡(64.01±4.51)歲,男性52例,女性36例;認知正常167例,年齡(62.03±5.65)歲,男性91例,女性71例。調(diào)整協(xié)變量多因素分析后顯示,認知損傷組年齡較大,更多見大中體積梗死、非輕型梗死、頸動脈中重度狹窄和高hs-CRP值。認知正常IS患者右側梗死多見。病例組與對照組的人口統(tǒng)計學特征和臨床特點,見表1。

表1 PSCI和對照組臨床特點[M(P25,P75)]

2.2 SNPs關聯(lián)分析 在總體樣本的所有遺傳模式下,經(jīng)調(diào)整協(xié)變量后,多元Logistic回歸分析顯示,5個位點影響了急性PSCI的發(fā)病,rs10116277 G等位基因攜帶者發(fā)病風險更小(P=0.001),rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493位點GG基因型、以及rs3735590位點A等位基因增加了發(fā)病風險(P<0.05)。見表2。

2.3 交互作用分析 采用MDR軟件評估總人群PSCI可能的基因-基因,基因-傳統(tǒng)危險因素交互作用的影響,PSCI傳統(tǒng)危險因素分析中P≤0.10的因素都被納入交互分析。我們發(fā)現(xiàn),在基因-基因交互作用分析中,三階交互模型rs10116277、rs3735590和rs7493是最佳模型。在基因-傳統(tǒng)危險因素交互分析中,ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP三階交互,rs10116277、rs1333049和右側腦梗死的三階交互,rs10116277、rs1333049和大中面積梗死體積的三階交互,rs10116277和中重度頸動脈狹窄的二階交互,rs10116277、rs1333049和65歲及以上人群的三階交互,PON rs7493與右側腦梗死二階交互,rs3735590

與大中面積梗死體積的二階是最佳模型,具有最高TBA。然而,在Logistic回歸分析中,只有ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP,rs10116277、rs1333049和大中面積梗死體積,rs10116277和中重度頸動脈狹窄,PON rs7493和右側腦梗死,rs3735590和大中面積梗死體積交互作用具有統(tǒng)計學意義,見表3。Logistic回歸分析用來評估最佳交互模型對PSCI的效應,調(diào)整協(xié)變量后,本研究發(fā)現(xiàn),攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hsCRP患者,發(fā)生急性PSCI的比率為5.049倍(OR=5.049,95%CI:1.650～15.448,P=0.005);攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型,rs1333049 CC基因型的大中面積腦梗死患者,發(fā)生急性PSCI的比率為8.322倍(OR=8.322,95%CI:2.458～28.171,P=0.001);rs10116277 TT攜帶者加上頸動脈中重度狹窄,PSCI發(fā)生率為4.067倍(OR=4.067,95%CI:1.832～9.027,P=0.001);rs3735590 GG攜帶者加上大中面積梗死,PSCI發(fā)生率為5.176倍(OR=5.176,95%CI:2.343～11.436,P<0.001)。其它交互效應未見統(tǒng)計學意義。

3 討論

本研究通過分析動脈粥樣硬化相關基因ANRIL與PON的SNP位點與PSCI發(fā)病風險相關性,發(fā)現(xiàn)了新的PSCI潛在預測指標。本研究還發(fā)現(xiàn),5個SNPs位點影響了急性PSCI的發(fā)病,rs10116277 G等位基因具有保護效應,rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493 GG基因型、rs3735590 A等位基因增加了PSCI發(fā)病風險。

ANRIL是染色體9p21區(qū)域一段長3.8 kb的非編碼RNA,廣泛參與了動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生[9,18]。在大鼠糖尿病模型中,ANRIL下調(diào)能重建學習和記憶能力,避免海馬錐體神經(jīng)元的凋亡[19]。在AD細胞模型中,ANRIL敲除能抑制凋亡和炎癥因子細胞因子表達,促進神經(jīng)突的生長[10]。這些都是AD發(fā)病的關鍵機制。研究也發(fā)現(xiàn),ANRIL rs10116277位點風險等位基因增加了白人群體冠脈病變發(fā)生1.45倍[20]。在高加索人群中,冠狀動脈旁路移植術后,rs10116277風險基因攜帶者更易出現(xiàn)心肌損傷[21]。在中國AD人群中研究發(fā)現(xiàn),rs1333049 C等位基因增加了晚發(fā)性AD的發(fā)生[22]。在意大利人群中,rs1333049 C等位基因也增加了VaD和晚發(fā)性AD的發(fā)病風險[23]。

表2 5個SNPs位點在不同遺傳模型下在認知損傷組和正常組中的分布情況

表3 ANRIL,PON基因交互作用模型表

PON是高密度脂蛋白相關的有機磷酸酯水解酶,具有水解內(nèi)酯、硫內(nèi)酯、芳基酯和不同有機磷酸鹽的能力,具有抗動脈粥樣硬化的生理作用[24]。PON基因與動脈粥樣硬化相關疾病具有密切關系,在Gran Canaria島北部地區(qū),rs7493 GG基因型增加了頸動脈IMT的風險[25];在新加坡華人中,不吸煙人群中rs3735590少見等位基因(A)攜帶者患CHD的風險更高[26]。GWAS研究也揭示,PON1基因一個SNP與AD發(fā)病風險有關[27]。Meta分析顯示,PON1 L55M (rs854560) M等位基因有更高的VaD發(fā)病風險[15]。綜上,ANRIL,PON基因與動脈粥樣硬化疾病關系密切,本身也涉及到認知損害的病理生理過程,因此,可以理解ANRIL,PON基因與急性PSCI發(fā)病風險的關系。

本研究交互作用分析也發(fā)現(xiàn),攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hs-CRP患者,攜帶ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的大中面積腦梗死患者,攜帶rs10116277 TT基因型的頸動脈中重度狹窄患者,以及攜帶rs3735590 GG基因型的大中面積梗死患者PSCI發(fā)生率顯著升高。

卒中后認知損傷風險因素眾多,比如高齡(65歲以上)、血管危險因素、梗死部位大小等本身特點以及遺傳易感因素等交互而成[28]。在CHD患者中,rs1333049 CC基因型被發(fā)現(xiàn)與升高的CRP有關[29],ANRIL過表達增加了糖尿病心肌梗死鼠的心肌梗死體積[30],頸總動脈狹窄患者ANRIL表達更低[31]。上述基因與傳統(tǒng)危險因素的復雜相互作用有助于我們理解上述的交互效應,對于IS后急性期CI的防治極其重要。

ANRIL和PON基因與PSCI研究甚少,前期,本研究團隊報道在川東北人群PON基因與PSCI存在關聯(lián)[32],然而,由于認知測試方法差異,以及PSCI本身是一個多因素疾病,基因多態(tài)性有較強的種族及地域差異性,因此,以SNP作為遺傳標志物,在川西北PSCI人群中,研究其遺傳關系及相互交互作用,對于揭示PSCI發(fā)生機制更有優(yōu)勢。本研究成果不僅豐富了目前對PSCI遺傳特性的認知,也為臨床診療提供了參考。本研究也存在一定缺陷,如納入分析樣本來源范圍較窄、數(shù)量較小等,后期研究結果的進一步驗證還需要擴大病例納入范圍及數(shù)量。

4 結論

ANRIL,PON基因與PSCI發(fā)病風險密切相關。為了解IS人群后期認知障礙的發(fā)病、進展、轉歸、治療情況與本研究基因的關系,應對研究對象進行長期隨訪觀察,建立資料庫進行對比研究。